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Introduccin
La tuberculosis, causada por Mycobacterium
tuberculosis, contina siendo la primera causa
de muerte debido a una infeccin por un agente
microbiano1-3. Para el control, la prevencin y la
erradicacin de la tuberculosis se necesita conocer con urgencia la biologa y la patognesis de
M. tuberculosis, as como las manifestaciones
clnicas asociadas a cada etapa de la infeccin4-6.
Sin embargo, el estudio de la expresin gnica
de M. tuberculosis se ha limitado a sistemas de
cultivo celular y modelos animales, dnde no se
reproduce a cabalidad las caractersticas clave de
la tuberculosis humana. A consecuencia de ello,
existe mnima informacin en el contexto de la
infeccin humana, es decir, durante el crecimiento in vivo del bacilo7,8. Para, descubrir aquellos
genes que M. tuberculosis expresa cuando se
replica dentro del ser humano7-9, nos propusimos detectar el mRNA del bacilo en muestras
clnicas respiratorias humanas obtenidas desde
pacientes con tuberculosis pulmonar activa y de
pacientes sin confirmacin diagnstica. Para ello,
decidimos comenzar estudiando la expresin de
la secuencia de insercin IS6110 y de los genes
16SrRNA, sigA, mprA and mprB en muestras de
esputo y lavado broncoalveolar. IS6110 es especfica de los miembros del complejo M. tuberculosis10,11; 16SrRNA y sigA cumplen funciones
housekeeping7,11. El sistema de dos componentes MprAB, asociado a virulencia in vivo e
in vitro, se induce al interior de los macrfagos
humanos9,12,13 y es esencial para el crecimiento in
vivo del bacilo en un modelo de infeccin latente.
Presentamos evidencia que demuestra la deteccin del mRNA de M. tuberculosis en muestras
de esputo de pacientes con tuberculosis pulmonar activa (expresin in vivo), siendo capaces
de identificar la expresin de IS6110 y de los
genes 16SrRNA y sigA. Los genes mprA y mprB
slo se detectaron en M. tuberculosis crecido in
vitro. Con nuestros resultados damos el primer
paso hacia la implementacin de un mtodo no
invasivo para el estudio del transcriptoma de M.
tuberculosis, dentro de su reservorio natural, el
ser humano, con el fin de analizar la regulacin
in vivo de los determinantes genticos requeridos
para su virulencia y patognesis.
Materiales y Mtodos
Cepas y DNAs de Mycobacterium: Se trabaj
con DNAs aislados de M. tuberculosis H37Rv
(ATCC N 27294), M. tuberculosis var. bovis
BCG Pasteur (ATCC N 27291), M. smegmatis
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A. OTAZO M. et al.
Tabla 1. Parejas de partidores utilizados para las reacciones de amplificacin en PCR (reaccin de polimerasa
en cadena) de tiempo-real
Par N
Secuencia blanco
mprA
mprB
IS6110
16SrRNA
sigA
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Secuencia partidor
GenBank
ID
Amplicn
Tamao (bp)
5-CATTGCTGGAGATGCCTGATCG-3
5-CTCGGTCTTGCGGCGTAG-3
885038
100
5-ATCCGTGGCGAGTTGTTC-3
5-CTTCGGTGGGCTTGAGAC-3
885062
100
X52471
163
X52917
416
887477
100
5-GGCTGTGGGTAGCAGACC-3
5-CGGGTCCAGATGGCTTGC-3.
5-GCTTTAGCGTGGGATGAGCC-3
5-GCGACGCTCACAGTTAAGCCGTG-3
5-GCCGATGACGACGAGGAG-3
5-GGCGGATGCGGTGAGTTC-3
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A. OTAZO M. et al.
Figura 3. Productos de amplificacin obtenidos mediante PCR de tiempo real utilizando los pools de
dscDNA como templado y los partidores citados en
la Tabla 1. (A) Gen 16SrRNA de M. tuberculosis como
blanco de amplificacin: Carriles: 1) Estndar MW, ladder
100-pb; 2) DNA M. tuberculosis (control positivo); 3)dscDNA pool A; 4) dscDNA pool D; 5) dscDNA pool C;
6) dscDNA pool B; 7) dscDNA pool E. (B) Gen sigA de
M. tuberculosis como blanco de amplificacin: Carriles:
1) Estndar MW, ladder 100-pb; 2) DNA M. tuberculosis
(control positivo); 3) dscDNA pool A; 4) dscDNA pool
D; 5) dscDNA pool C; 6) dscDNA pool B; 7) dscDNA
pool E. (C) Gen mprA de M. tuberculosis como blanco
de amplificacin: Carriles: 1) Estndar MW, ladder
100-pb; 2) DNA M. tuberculosis (control positivo); 3)
dscDNA pool A; 4) dscDNA pool D; 5) dscDNA pool C;
6) dscDNA pool B; 7) dscDNA pool E. (D) Gen mprB de
M. tuberculosis como blanco de amplificacin: Carriles:
1) Estndar MW, ladder 100-pb; 2) DNA M. tuberculosis
(control positivo); 3) dscDNA pool A; 4) dscDNA pool
D; 5) dscDNA pool C; 6) dscDNA pool B; 7) dscDNA
pool E.
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Tabla 2. Resultados de las amplificaciones realizadas por PCR de tiempo-real utilizando los pools de dscDNA
como templado y las cinco parejas de partidores citados en la Tabla 1
Blanco de amplificacin
(n)
Tipo crecimiento
M. tuberculosis
IS6110
16SrRNA
sigA
mprA
mprB
dscDNApool A
In vivo
(+)
(+)
(+)
(-)
(-)
dscDNApool B
In vivo
(+)
(+)
(+)
(-)
(-)
dscDNApool C
In vivo
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
dscDNApool D
In vivo
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
dscDNApool E
In vitro
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
Muestra a amplificar
(n): Nmero de muestras de esputo o LBA utilizadas para construir el pool A, B, C y D; En el caso de pool E corresponde
a una colonia de M. tuberculosis.
A. OTAZO M. et al.
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Correspondencia a:
Dra. Nancy P. Mauln L.
Profesor Asistente, Facultad de Medicina y Biociencias.
Campus Los Leones. Universidad San Sebastin.
Santiago. Chile.
Tel.: (56)-2-29154739.
E-mail: n.maulen@gmail.com
nancy.maulen@uss.cl
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