Agrobiotecnologa.

Curso 2013
Clase 2: Cultivo de tejidos vegetales
Tcnicas del cultivo de clulas y tejidos vegetales
Transparencias 3-6
La teora de la totipotencialidad celular constituye el principio rector de las tcnicas de
cultivo de tejidos vegetales. Enuncia la posibilidad de obtener una planta entera a
partir de cualquier clula viva, bajo condiciones controladas de cultivo. Resulta
requisito lograr la desdiferenciacin previa de la clula inicial, induciendo la prdida de
las caractersticas de especializacin de dicha clula hasta un estadio de
desdiferenciacin meristemtica. Posteriormente se buscar la re-diferenciacin de
esta clula de partida, de manera de lograr variadas respuestas morfogenticas tales
como la obtencin de callo, la regeneracin de brotes o primordios de raz, etc. Para
promover estas posibles respuestas es necesario adicionar a los medios sintticos de
cultivo reguladores del crecimiento, fundamentalmente auxinas y citoquininas.
El fisilogo austriaco Haberlandt (1902) fue el primer investigador en intentar cultivar in
vitro clulas vegetales en un medio sinttico de cultivo. Utiliz un medio que contena
macro y micronutrientes, asparagina, peptona y sacarosa. A pesar de que las clulas
sobrevivieron durante varios meses, estas no proliferaron. La falla de su protocolo se
debi probablemente a la pobre composicin del medio de cultivo y al empleo de
clulas muy diferenciadas como material vegetal de partida. Fue Robbins (1922) quien
inici el cultivo aislado de meristemas. Desarroll la tcnica de cultivo de pices de
raz. White (1934) logr el cultivo indefinido de races in vitro. Con el descubrimiento
de las primeras hormonas vegetales result posible promover las desdiferenciacin de
tejidos vegetales y obtener variadas respuestas morfogenticas (Went, 1937).
El cultivo in vitro de clulas y tejidos vegetales implica el mantenimiento de partes
aisladas del cuerpo de una planta bajo condiciones controladas de asepsia, nutrientes,
luz y temperatura. El cultivo de tejidos es frecuentemente utilizado como sistema
modelo en el estudio de problemas fisiolgicos, bioqumicos, genticos y estructurales
relativos a las plantas. El uso comercial de estas tcnicas, la micropropagacin
vegetal, posibilita la propagacin vegetativa a gran escala de especies de importancia
econmica. Existen adems muy variadas aplicaciones del cultivo de tejidos vegetales
que utilizan diferente material vegetal de partida y condiciones particulares de cultivo.
Micropropagacin vegetal
Transparencias 7-9
En las fotos puede observarse material vegetal de diferentes especies propagado in
vitro: en los frascos se observan plntulas y microtubrculos de papa; en la placa de
Petri crecen plntulas de violeta africana (Sainpaulia sp) mientras que en el tubo de
cultivo se enraza un vstago de clavel (Dianthus sp).

Consideraciones tcnicas de la propagacin clonal masiva de plantas

Transparencias 10-22
El cultivo de tejidos vegetales no requiere de equipamiento complejo ni de gran
infraestructura. Las necesidades dependen de la escala de produccin pretendida o de
la naturaleza del proyecto de investigacin en curso. Se detalla la organizacin bsica
de un laboratorio de micropropagacin vegetal.
Para la propagacin clonal masiva de plantas resulta de fundamental importancia la
preparacin y presaneamiento de las plantas madres a partir de las cuales se tomarn
los explantos. La diseccin de los explantos y los subcultivos sucesivos se realizan
bajo condiciones de esterilidad en un gabinete de flujo laminar. Las plantas son
crecidas en una cmara de cultivo a aprox. 24 grados centgrados de temperatura y un
fotoperodo de 16 horas luz/ 8 horas oscuridad. Los medios sintticos y los recipientes
de cultivo (de vidrio resistente a altas temperaturas) son esterilizados por autoclave.
Las plantitas clonales crecen en recipientes estriles, sellados con un film de
polietileno transparente que permite el intercambio gaseoso.
Un medio nutritivo consiste bsicamente en sales inorgnicas, una fuente de carbono,
algunas vitaminas, reguladores del crecimiento y suplementos orgnicos. De acuerdo
con el nivel de organizacin y tamao del material vegetal en cultivo la composicin
del medio ser ms o menos compleja. En el caso del cultivo de protoplastos o clulas
aisladas se requerir mayor cantidad de compuestos orgnicos. Los hidratos de
carbono constituyen una fuente de energa y las vitaminas actan como catalizadores
de reacciones enzimticas.
La consistencia de los medios de cultivo in vitro puede ser lquida o semislida. En el
ltimo de los casos se adiciona a la formulacin salina y compuestos orgnicos un
agente gelificante inerte. El ms usado es el agar-agar. Este es soluble en agua a
90C, permanece fundido hasta los 40C, temperatura por debajo de la cual solidifica
en la forma de un gel transparente, ms o menos slido dependiendo de la
concentracin.
Los medios de cultivo semislidos son envasados en recipientes de vidrio resistente al
calor y esterilizados por autoclave. Los medios lquidos se alicuotan en recipientes
graduados (Erlenmeyers). Los cultivos de esta modalidad se mantienen en agitacin
constante en un agitador con control de temperatura para asegurar la adecuada
inmersin de los explantos (suspensiones de protoplastos o clulas vegetales).
El film de polietileno ampliamente utilizado para el cierre de los recipientes de cultivo
posibilita el intercambio gaseoso y resulta relativamente impermeable para el vapor de
agua previniendo, de esta forma, la desecacin de cultivos a largo plazo. La
transparencia de este film resulta una ventaja extra en le caso de cultivos que
requieran luz.
El pH de los medios de cultivo determina la disponibilidad de los compuestos
osmticos y regula un amplio rango de reacciones bioqumicas que tienen lugar en las
clulas vegetales en cultivo. Siempre debe tenerse en cuenta la posible modificacin
del valor de pH luego de la esterilizacin por autoclave de los medios, debida a las
elevadas temperaturas. Otras causas de modificacin del valor de pH son el tipo de
hidrato de carbono adicionado, el agente gelificante (marca o stock) y el uso de carbn
activado. En la actualidad resulta posible conseguir en el mercado formulaciones de
medios de cultivo con una mayor capacidad buffer de manera de prevenir estas
variaciones indeseadas del pH.

Existe en la literatura una gran variedad de formulaciones de medios de cultivo. La

eleccin de una u otra formulacin depender del objetivo y la aplicacin particular de
alguna de las tcnicas del cultivo de tejidos y de la especie o tipo de planta. Los
requerimientos nutricionales bsicos del material vegetal cultivado son similares a los
de una planta a campo. Las formulaciones detalladas en la tabla son las ms
difundidas y usadas. Los medios de Schenk y Hiledebrandt (SH), el de Gamborg (B5)
y el de Murashige and Skoog (MS) presentan una alta concentracin de
macronutrientes mientras que los restantes contienen considerablemente menos
compuestos inorgnicos.
El termino hormona se reserva para los compuestos naturales que actan como
reguladores del crecimiento vegetal. Los compuestos sintticos que cumplen esta
funcin son denominados reguladores del crecimiento. El suplemento de auxinas y
citoquininas resulta fundamental para la regulacin de la divisin celular, el
alargamiento y la diferenciacin de las clulas en cultivo y la formacin de rganos de
novo u organognesis. El manejo de diferentes concentraciones relativas de estos
reguladores del crecimiento determina las respuestas organognicas. Las giberelinas
se utilizan fundamentalmente en el cultivo de meristemas y en estudios de
diferenciacin vascular. Actualmente se considera la importancia de otros reguladores
del crecimiento como el etileno (iniciacin de yemas) y el cido abscsico.
Las auxinas se solubilizan en NaOH 1 N, a excepcin del 2,4-D que es soluble en
etanol o en dimetilsulfxido (DMSO). Este solvente debe ser manipulado con
precaucin ya que puede penetrar la piel y tiene efectos txicos.
El AIA, auxina natural, es fotosensible y se degrada por oxidacin enzimtica por lo
que se la adiciona a los medios de cultivo en concentraciones relativamente elevadas
(1-30 mg/L). Los restantes compuestos auxnicos se utilizan, en trminos generales,
en un rango de concentraciones de entre 0,1 y 2 mg/L.
Las citoquininas ms usadas en cultivo de tejidos son quinetina, benziladenina y
zeatina. Se las adiciona en relativamente bajas del orden de 0,1 a 1 mg/L. Son
solubles en HCl 1 N. Un compuesto sinttico de marcada accin citoquinnica es el
thidiazurn (TDZ), se trata de una fenilurea sustituida. El agua de coco puede utilizarse
como fuente natural de citoquininas concentraciones en una dilucin en el medio
sinttico de cultivo de 10-15% (v/v).
Las giberelinas al igual que el cido abscsico son reguladores del crecimiento
ocasionalmente usadas en cultivo de tejidos. Generalmente el GA3 se utiliza para
promover el crecimiento de cultivos celulares de baja densidad, para favorecer el
crecimiento de callos y para elongar los entrenudos de plntulas o vstagos in vitro.
Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores
Transparencias 23-27
Principales consideraciones y objetivos de cada una de las etapas detalladas:
Etapa 1: Seleccionar como planta madre un individuo que rena las caractersticas
varietales deseadas, que se encuentre en adecuado estado fitosanitario y que haya
sido pre-tratada conforme a un programa de fertilizacin y aplicacin de pesticidas.
Ajustar un protocolo de desinfeccin que permita obtener un gran porcentaje de
explantos libres de contaminantes superficiales y endgenos.

Etapa 2: obtencin de yemas y/ o embrioides y en su multiplicacin por repiques o

subcultivos sucesivos (cada 20-25 das) a medio fresco. Esta etapa determina la
disponibilidad y ampliacin del stock comercial de plantas clonales. El material vegetal
puede multiplicarse y mantenerse bajo condiciones de cultivo in vitro durante un
tiempo prolongado. Resulta de fundamental importancia el renovar el stock
introduciendo permanentemente material vegetal fresco (nuevos explantos) de manera
de evitar la prdida de la eficiencia y/o tasa de multiplicacin debida a la senescencia
de los explantos.
Etapa 3: transferencia de los brotes o yemas obtenidos y amplificados en la etapa
previa a un medio de cultivo que promueva la diferenciacin de races adventicias para
la obtencin de plantas ntegras capaces de sobrevivir bajo condiciones de cultivo en
tierra.
Etapa 4: transferencia de las plantitas clonales a tierra o sustrato mezcla en maceta o
terrinas bajo condiciones controladas, en un invernculo.
Eleccin del explanto: cualquier tejido u rgano vegetal puede ser usado como
explanto iniciador del cultivo in vitro. El grado de xito depender del sistema de
cultivo utilizado, de la especie vegetal en cuestin y de la adecuada desinfeccin
superficial inicial del material vegetal. El primer objetivo de la etapa I consiste en
obtener un gran porcentaje de explantos libres de patgenos superficiales. Los
explantos ms utilizados para iniciar la propagacin clonal in vitro de una planta son
las yemas apicales del vstago, estacas uninodales portando yemas axilares, discos
de hoja, secciones de raz y meristemas.
Como paso preliminar al uso de soluciones desinfectantes resulta en muchos casos
ventajoso lavar el material vegetal bajo agua corriente (entre 30 minutos hasta 2
horas) de manera de reducir la posible carga de contaminantes que portan los
explantos. Esto resulta particularmente aconsejable cuando se trata de explantos
pubescentes, rganos de reserva (tubrculos, bulbos) o races. Este lavado puede ser
precedido por el uso de una solucin jabonosa. Otros desinfectantes de amplio uso en
cultivo de tejidos vegetales son el perxido de hidrgeno y el nitrato de plata. La
eleccin del orden de dilucin del desinfectante as como el tiempo de exposicin del
material vegetal a dicha solucin depender del tipo de explanto y de su estado
fitosanitario de partida (por ejemplo si se trata de material que viene de campo o de
cultivo controlado bajo invernculo, etc.). Una vez ajustadas estas variables de lograr
La esterilizacin superficial del material a establecer in vitro. En el caso de
contaminaciones bacterianas endgenas resultar necesario el uso de antibiticos
adicionados al medio de cultivo.
Una vez establecido el cultivo in vitro pueden esperarse diferentes respuestas que van
desde la muerte del explanto por la utilizacin de un medio de cultivo inadecuado; la
contaminacin del material por sobre-crecimiento de algn microorganismo endgeno
o por un deficiente tratamiento de desinfeccin superficial; la regeneracin indirecta a
partir de la formacin de callo por proliferacin de las clulas desdiferenciadas,
resultado de sucesivas mitosis o, por ltimo, la aparicin de brotes o embriones
somticos directamente a partir del explanto inicial sin previa formacin de callo. La
regeneracin de brotes, yemas, primordios de raz o embriones somticos estar
determinada fundamentalmente por el balance de reguladores del crecimiento
adicionados al medio sinttico de cultivo.

Vas morfogenticas: organognesis y embriognesis

Transparencias 28-31
La determinacin de cualquiera de estas dos vas morfogenticas: la organognesis y
la embriognesis somtica, no est an claramente esclarecida. Resulta evidente que
se encuentran involucrados diferentes factores: la edad del la planta madre dadora de
explantos, el tipo de explanto, el medio de cultivo, los reguladores del crecimiento y las
condiciones artificiales de cultivo.
La primera respuesta estudiada in vitro fue la organognesis en callos de tabaco. A
partir de estos estudios iniciales pudo conocerse que esta va est qumicamente
regulada. Un balance relativamente alto de auxinas:citoquininas induce la formacin
de races adventicias mientras que una relacin baja (menor a 1) de los mismos
compuestos favorece la produccin de brotes. Adems de la relacin auxina :
citoquinina, numerosos reportes indican que otros factores estn tambin involucrados
en la va organognica: entre ellos otros reguladores del crecimiento tales como las
giberelinas (que suprimen la iniciacin de brotes o races) y el etileno endgeno (que
bloquea la iniciacin de la organognesis pero promueve el crecimiento y
diferenciacin de los primordios de yemas o races preexistentes).
Por otro lado, los ms importantes factores qumicos involucrados en la va
embriognica son las auxinas y los compuestos nitrogenados reducidos (NH4Cl, urea,
cido glutmico, glutamina). El suplemento de los medios de cultivo con carbn
activado promueve, en algunos casos, la embriognesis al igual que el uso de
poliaminas endgenas (putrescina, espermidina). En trminos generales se requieren
dos medios de cultivo diferentes para promover la embriognesis somtica: un medio
de iniciacin de las clulas embriognicas, conteniendo auxinas (2,4-D) y un segundo
medio para la diferenciacin de los embrioides, sin agregado de auxinas o con un nivel
reducido de este tipo de compuesto (no 2,4-D).
Organognesis en Lotus tenuis: diferenciacin de yemas a partir de hipoctilos. Se
observa el primordio de una yema (d: domo meristemtico, p: primer par de primordios
foliares). Se observa la conexin vascular de la yema con los restos del explanto
original y la continuidad anatmica entre el explanto y la neoformacin. Foto de
embrin somtico de Lotus tenuis: se observa un embrin en el estadio torpedo de
diferenciacin. No existe conexin entre el embrin y las clulas parenquimticas que
forman parte del explanto inicial.
Sistemas de micropropagacin vegetal: proliferacin de yemas axilares o
apicales
Transparencias 32-33
El desarrollo de yemas axilares y apicales puede ser promovido in vitro por activacin
de meristemas quiescentes. Un explanto que contiene una yema nica puede, de
acuerdo con las condiciones nutricionales y hormonales del medio de cultivo y con la
especie en cuestin, desarrollar un slo brote o producir mltiples vstagos. A medida
que estos nuevos vstagos crecen, van surgiendo nuevos meristemas a lo largo de su
eje, los que, a travs de repetidos subcultivos, darn lugar a mltiples brotes. La
proliferacin de yemas preexistentes se favorece adicionando citoquininas en
concentraciones de entre 1-30 mg/L a los medios sintticos de cultivo. La gran mayora
de las especies vegetales puede ser propagada clonalmente con xito por este
sistema de micropropagacin. El mayor potencial de este procedimiento alcanza a las

plantas leosas en las cuales la embriognesis somtica y la proliferacin adventicia

de brotes no resultan ventajosas.
Sistemas
de
micropropagacin
desdiferenciados

vegetal:

proliferacin

de

tejidos

Transparencias 34-37
La proliferacin adventicia de brotes y la formacin de callos a partir de los explantos
pueden determinar la prdida del potencial morfogentico de los cultivos o incrementar
la variabilidad gentica. Existen al menos tres posibles explicaciones que explican esta
prdida de potencialidad: a) prdida de los centros meristemticos debido a que estos
son estimulados para producir brotes diferenciados; b) variacin en los niveles
endgenos de reguladores del crecimiento que no pueden ser reemplazados
exgenamente y c) acumulacin de anormalidades cromosmicas tales como cambios
en el nivel de ploida o rearreglos de los cromosomas.
La transparencia 35 presenta de manera esquemtica las vas directa e indirecta de
regeneracin de brotes in vitro. Partiendo de diferentes explantos iniciales (disco de
hoja, suspensin celular, meristema, estaca uninodal, entre otros), es posible
promover una u otra va en funcin de la composicin del medio de cultivo, el balance
de reguladores, las condiciones fsicas del cultivo y la especie en cuestin. La va
indirecta presupone la desdiferenciacin total del explanto, seguida de sucesivas
divisiones mitticas desordenadas que dan lugar a la proliferacin de una masa
amorfa de clulas indiferenciadas denominada callo. La regeneracin directa implica la
aparicin de estructuras de novo, ya se trate de primordios de yemas o races
adventicias, a partir de clulas individuales o grupos de clulas parcialmente
desdiferenciados en el explanto. No existe en este caso proliferacin masiva de
clulas desdiferenciadas con potencialidad meristemtica.
Las imgenes contenidas en la transparencia 37 ilustran diferentes etapas y sistemas
de micropropagacin de plantas de inters comercial. La foto superior izquierda
muestra vstagos de orqudea completando su enraizamiento in vitro listos para su
rusticacin o pasaje a maceta. La foto superior derecha muestra el procedimiento
utilizado para la multiplicacin de material clonal de kiwi a travs del subcultivo de
estacas de uno o dos nudos. La foto inferior izquierda muestra mltiples yemas de
tomate creciendo de manera indirecta a partir de callos. La foto inferior derecha
muestra vstagos de jojoba en la etapa de enraizamiento.
Sistemas de micropropagacin vegetal: cultivo de meristemas
Transparencias 38-40
El cultivo de meristemas representa una metodologa para el saneamiento in vitro de
plantas infectadas. Sumados a la diseccin y establecimiento in vitro de los
meristemas (explantos) de la planta madre infectada resulta aconsejable emplear otros
tratamientos: la termoterapia y la quimioterapia. Estos tres diferentes procedimientos
pueden usarse por separado, pero incrementan notablemente su efectividad cuando
se los combina, trabajando in vivo e in vitro.
Los principales problemas fitosanitarios se deben a la presencia de patgenos cuya
eliminacin, a travs del uso de antibiticos y fungicidas, no resulta eficiente. Es
conocido que no existen tratamientos para eliminar las enfermedades de origen viral.

Por esto, resulta necesario complementar las tcnicas antes mencionadas. El cultivo
de meristemas para el saneamiento de plantas infectadas resulta altamente eficiente
en el caso de plantas que se propagan vegetativamente. En la mayora de los casos la
reproduccin sexual constituye una barrera para la transmisin de virus y bacterias.
Existen excepciones (virus V del tomate, a travs de las semillas)
Liberacin de patgenos
Transparencias 41-55
La ausencia de contaminantes es un prerrequisito que asegura el adecuado
crecimiento y alta productividad de las especies vegetales de inters comercial. La
propagacin clonal o masiva de plantas puede constituir un medio para la
diseminacin de contaminantes endgenos entre las plantas cultivadas. Existe una
serie de consideraciones prcticas que minimizan la posibilidad de contaminacin del
material vegetal bajo cultivo in vitro. Entre stas se incluyen la deteccin temprana y
adecuada caracterizacin o identificacin de los posibles patgenos, la cuidadosa
desinfeccin superficial del material vegetal y del instrumental requerido para su
manipulacin, la seleccin de los explantos y el uso de agentes antimicrobianos in vivo
o in vitro. Estos procedimientos y recaudos debern ser particularmente considerados
para la preparacin y seleccin de plantas madres iniciadoras del stock comercial de
plantas micropropagadas. Es de ampliamente conocido el hecho de que los
meristemas vegetales estn libres de contaminantes endgenos que afectan el resto
del cuerpo de una planta. El cultivo de meristemas in vitro permite, en gran cantidad de
casos, el establecimiento de cultivos libres de patgenos. Una vez confirmada la
sanidad de las plantas bajo cultivo, resulta indispensable monitorear regularmente esta
condicin.
Los principales problemas fitosanitarios se deben a la presencia de patgenos cuya
eliminacin a travs del simple uso de compuestos antimicrobianos no resulta
eficiente. Cuando se detecta la presencia de patgenos o contaminantes en el material
vegetal propagado, resulta indispensable establecer una estrategia de saneamiento
que contemple el tratamiento ms adecuado o la suma de varios tratamientos. La
caracterizacin preliminar del tipo de microorganismo resulta esencial para la
seleccin adecuada del procedimiento a seguir. En el caso de la presencia de
bacterias u hongos, deber intentarse el aislamiento de estos microorganismos en
cultivos puros y determinar su sensibilidad a antibiticos o fungicidas siguiendo
protocolos conocidos. El antibitico y/o fungicida seleccionado deber ser agregado a
los medios de cultivo o bien aplicado in vivo a la planta madre, a partir de la cual se
aislarn explantos o meristemas para iniciar el cultivo bajo condiciones controladas in
vitro. En el caso de la presencia de virus y viroides, el tratamiento con calor
(termoterapia), acompaado del uso de agentes antivirales no especficos y de baja
fitotoxicidad como la ribavirina, resulta indispensable. La ribavirina presenta actividad
contra los virus de ARNsc, los que representan a la gran mayora de virus
fitopatognicos. Tambin se ha reportado su accin inhibitoria frente a diferentes
viroides. La eficiencia de las metodologas de saneamiento mencionadas se
incrementa notablemente cuando los diferentes tratamientos se utilizan en forma
combinada.
La termoterapia implica el tratamiento con altas o bajas temperaturas de plantas
infectadas con virus y/o viroides. La adecuada caracterizacin del patgeno presente
facilitar la eleccin y ajuste del protocolo a seguir. La efectividad del tratamiento por
termoterapia depender tanto del rango de temperaturas seleccionado como del
tiempo o ciclos de exposicin de la planta contaminada a las condiciones y

temperaturas seleccionadas. Resulta fundamental minimizar el posible dao

irreversible a la planta bajo tratamiento. Una vez aplicado el protocolo y monitoreada la
calidad fitosanitaria de la planta tratada, se proceder a la diseccin de los meristemas
como explantos iniciadores del cultivo in vitro.
El tratamiento por quimioterapia de plantas infectadas por diferentes patgenos resulta
una prctica muy difundida, no slo bajo condiciones de laboratorio e invernculo, sino
incluso a campo. La efectividad de la aplicacin exgena de sustancias con probada
actividad antimicrobiana, de alta especificidad o de amplio espectro, depender de la
adecuada identificacin del patgeno, del uso de una dosis adecuada y del correcto
manejo de la planta bajo tratamiento. La aplicacin de los diferentes agentes tales
como antibiticos, insecticidas, agentes antivirales, podr realizarse sobre la planta
madre, bajo condiciones de invernculo o a campo, o bien durante el cultivo in vitro del
material vegetal infectado, adicionando los mencionados compuestos a los medios
sintticos de cultivo. Cabe considerar que el uso repetido o a largo plazo de un
compuesto antibitico, insecticida o antifngico puede desarrollar respuestas de
resistencia o tolerancia por parte del patgeno a controlar.
La efectividad de la metodologa de saneamiento aplicada debe ser confirmada a
travs del monitoreo del estado sanitario de las plantas tratadas. Esta evaluacin
fitosanitaria puede llevarse a cabo por diferentes mtodos, dependiendo del tipo de
patgeno a monitorear, de la localizacin del contaminante dentro de la planta a
analizar, del tipo de sntomas que desarrolla el patgeno, as como del tiempo y
recursos de que se disponga. En el caso de bacterias endgenas, se proceder a
cultivar diferentes explantos de la planta tratada bajo condiciones y medios de cultivo
que propicien la proliferacin del patgeno con el fin de determinar su presencia. La
microscopa ptica y electrnica de transmisin constituyen herramientas valiosas para
la deteccin de la presencia de microorganismos intracelulares o de aquellos que
colonizan el espacio apoplstico. En el caso de hongos, bacterias y virus que
desarrollan sntomas caractersticos en la planta bajo cultivo, resulta vlido conservar
plantas bajo condiciones de invernculo para monitorear la aparicin de los mismos.
La posibilidad de usar plantas indicadoras como mtodo de evaluacin sanitaria
depender del sistema husped-patgeno en cuestin. Deber contarse adems con
individuos de una planta indicadora que sea altamente sensible y manifieste sntomas
caractersticos de la presencia del patgeno.
Muchas enfermedades de origen viral, bacteriano o fngico presentan sntomas
distintivos que pueden ser fcilmente reconocidos por el observador. La presencia de
dichos sntomas constituye evidencia de la presencia de un patgeno en particular.
Debe aclararse que en algunos casos interfiere la subjetividad del observador, lo que
puede dar lugar a diagnsticos errneos. La aparicin se sntomas y el aspecto de
stos puede variar con las condiciones medioambientales y con la fenologa de la
planta. Por ello, resulta aconsejable mantener las plantas a evaluar en invernculo
bajo condiciones controladas durante todo el monitoreo.
Muchas enfermedades de origen viral, como el mosaico causado por el Tomato
mosaic virus, presentan sntomas distintivos, tales como manchas clorticas regulares
a nivel del follaje y la epidermis de los frutos maduros. Erwinia carotovora es una
bacteria gram-negativa que ataca a numerosas especies vegetales de importancia
comercial, entre ellas Solanum tuberosum. Este patgeno desarrolla diferentes
sntomas de acuerdo con el rgano vegetal que infecte. En los vstagos o tallos de
una planta de S. tuberosum infectada, se produce el denominado pie negro. Esta
enfermedad puede desarrollarse en cualquier edad de la planta. Los tallos de una
planta infectada presentan el cuello o base (porcin comprendida entre el vstago y la
raz) de color negro intenso. Al cabo de unos das se evidencia una marcada clorosis

en las hojas seguida de la marchitez de los tallos. Los tejidos de conduccin a nivel del
vstago se ven tambin afectados, determinando finalmente la muerte de la planta.
Los tubrculos de S. tuberosum infectados con Erwinia carotovora desarrollan la
denominada podredumbre blanda. Esta enfermedad puede manifestarse durante el
almacenamiento de los tubrculos o en el suelo. Los sntomas distintivos incluyen la
maceracin del parnquima de reserva con la oxidacin de la porcin perifrica de la
lesin.
La gran mayora de las enfermedades causadas por hongos presentan sntomas muy
conspicuos y caractersticos. Uno los ejemplos incluidos en la transparencia 50 es la
antracnosis en Fragaria spp. producida por Colletotrichium fragariae, la forma asexual
de un hongo ascomycete. Las manifestaciones de la antracnosis en Fragaria consisten
en la aparicin de lesiones necrticas en estolones y pecolos. Estas lesiones van
aumentando de tamao hasta involucrar a todo el rgano. Pueden aparecer tambin
lesiones firmes, redondeadas y ligeramente deprimidas en la superficie de los frutos
maduros. Estas reas necrticas van incrementando su tamao hasta cubrir todo el
fruto que termina por secarse momificndose. El otro ejemplo que se presenta en la
transparencia 50, el Powdery Mildew, es una enfermedad que ataca el follaje de
diferentes especies vegetales y es causada por hongos del gnero Erysiphe (forma
asexual de un ascomycete). En etapas tempranas de la infeccin, se observan en
ambas caras de la lmina de las hojas depsitos pulvurulentos blanquecinos debidos a
la esporulacin del hongo. En etapas ms avanzadas de la enfermedad, se evidencian
reas necrticas en las hojas. Finalmente se produce la abscisin de estos rganos.
Los nemtodos fitopatgenos son organismos pequeos observables al microscopio.
Presentan forma alargada, el cuerpo liso, no segmentado y carecen de patas u otros
apndices. Su ciclo de vida incluye cuatro etapas larvarias y se completa en 3 4
semanas. La mayora de las especies de nemtodos fitopatgenos vive libremente en
el suelo, alimentndose de las races y tallos subterrneos de las plantas susceptibles.
La temperatura, humedad y aireacin afectan a la supervivencia y a la movilidad de
estos organismos en el suelo. La mayor concentracin de nematodos en la regin
radical de la planta hospedera se debe principalmente a que es all donde encuentran
una mayor disponibilidad de alimento, lo que favorece su reproduccin y crecimiento,
adems del efecto de atraccin que ejercen sobre ellos determinadas sustancias
liberadas por la planta. Los nemtodos se distribuyen con gran facilidad a travs del
equipo agrcola, el sistema de riego, las inundaciones, las patas de los animales, los
productos agrcolas y las plantas provenientes de viveros. Adems, su dispersin se
incrementa cuando los rganos de plantas infectadas entran en contacto con los de
plantas sanas. Al alimentarse, los nemtodos penetran en el espacio apoplstico,
perforan las paredes celulares, inyectan secreciones en las clulas y succionan parte
de sus contenidos. Los daos provocados en los tejidos de la raz disminuyen su
capacidad de absorcin, por lo que se desarrollan sntomas de deficiencia de agua y
nutrientes en los rganos areos de la planta. Finalmente, las lesiones producidas
constituyen puntos de entrada para otros patgenos.
La mayora de los sntomas producidos por los virus se asemejan a los ocasionados
por insectos u otros patgenos, o a los de ciertas deficiencias nutricionales. La
determinacin certera de que determinados sntomas se deben a la presencia de un
virus incluye la exclusin de otros posibles agentes causales de enfermedad y la
transmisin de virus a partir de plantas enfermas. Entre los mtodos que se utilizan
para detectar virus fitopatgenos, se incluye la transmisin del virus de una planta
enferma a una sana, ya sea por injerto, frotacin o inyeccin de extractos.
Histricamente, se han utilizado otros mtodos de transmisin como insectos vectores
o plantas parsitas (como la cuscuta). La prueba definitiva de la presencia de un virus

en una planta la proporciona su purificacin, su observacin en el microscopio

electrnico y las pruebas serolgicas o moleculares.
Cuando una protena de un virus o cualquier otra protena extraa (antgeno) se
inyecta en un mamfero o en un ave, induce la formacin de anticuerpos en el suero
sanguneo, los cuales reaccionan especficamente con el antgeno inyectado. El virus
y su anticuerpo se acoplan en varias formas siendo la ms comn la reaccin de la
precipitina. En esta reaccin, los anticuerpos y antgenos se mezclan en solucin, se
acoplan en la interfase entre las dos soluciones separadas (prueba de la interfase) o
bien se difunden a travs de un gel y se precipitan en una zona en condiciones
apropiadas (prueba de Ouchterlony). En ocasiones, el antgeno es adsorbido sobre la
superficie de partculas grandes y stas se precipitan al aadir los anticuerpos
(reaccin de aglutinacin). En todas estas pruebas, la reaccin puede observarse
como una precipitacin en un tubo de ensayo o la formacin de una banda en una
interfase.
La observacin directa de los posibles patgenos en el espacio intra- o extracelular
resulta posible con el uso de la microscopa electrnica. Sin embargo, an con este
instrumento, las partculas virales no siempre son fciles de detectar. Los virus
fitopatgenos presentan diferentes morfologas, como varillas, bacilos, filamentos,
esferas, formas isodiamtricas e incluso polidricas. Su tamao tambin es variado,
desde 10 nm por 2000 nm (Tristeza mosaic virus) a 17-60 nm de dimetro (diferentes
virus esfricos o polidricos).
Conservacin de germoplasma
Transparencias 56-63
La conservacin de la biodiversidad constituye un objetivo prioritario en un escenario
en que las relaciones entre el desarrollo tecnolgico y la conservacin del ambiente
ocupan crecientemente el debate pblico. En particular, la conservacin de los
recursos fitogenticos de inters para la agricultura es un factor ampliamente
reconocido para contribuir al desarrollo sostenible de la misma y a la conservacin de
los recursos naturales. Uno de los ventajas ms destacables del cultivo de tejidos in
vitro es su posibilidad de propagar a gran escala cualquier material vegetal con mnimo
riesgo de introducir o reintroducir patgenos y con alto grado de estabilidad genotpica.
Por esta razn, han encontrado sus aplicaciones en la conservacin e intercambio de
recursos fitogenticos se ha incrementado aceleradamente.
Tradicionalmente, la conservacin de recursos fitogenticos se ha basado en dos
metodologas: ex situ e in situ. La conservacin ex situ incluye al cultivo de clulas y/o
tejidos vegetales (bancos de germoplasma in vitro). Los mtodos de conservacin in
situ contemplan la preservacin de las especies de inters en su hbitat natural. La
criopreservacin consiste en la conservacin a temperaturas ultra bajas (-196C) en un
medio criognico como el nitrgeno lquido. Durante las ltimas dcadas se ha
avanzado mucho en el estudio de la respuesta del material vegetal a bajas
temperaturas. Como parte de ello, se han estudiado los procesos fisiolgicos y
bioqumicos involucrados en la criopreservacin y se han investigado las condiciones
que posibilitan la preservacin de la viabilidad del material vegetal almacenado por
este mtodo.
Los bancos de germoplasma in vitro posibilitan el mantenimiento a largo plazo de
material vegetal en medios sintticos de cultivo, bajo condiciones controladas de luz,
fotoperodo y temperatura. El manejo de este material no difiere demasiado de los

procedimientos generales utilizados para la micropropagacin vegetal. Ciertas

variables, tales como la concentracin de los compuestos osmticamente activos, la
concentracin del agente gelificante inerte, la temperatura de cultivo y la luz, son
ajustadas de manera de determinar una disminucin de la tasa metablica del material
vegetal. De esta manera, se logra minimizar la manipulacin y espaciar los
subcultivos, lo que contribuye al descenso de los costos de mantenimiento. Una
prctica general consiste en disminuir la intensidad lumnica y reducir la temperatura.
Bajo estas condiciones restrictivas (por ejemplo, en oscuridad y a 4C), es posible
conservar plntulas de Fragaria x ananassa (frutillas o fresas) durante aos, con el
agregado espordico de gotas de medio de cultivo fresco al material en conservacin.
Las condiciones estndar de cultivo in vitro slo pueden utilizarse para conservacin a
mediano plazo de especies de crecimiento lento, como por ejemplo Coffea arabiga.
Las plntulas de caf micropropagadas pueden ser conservadas en un medio de
cultivo estndar a 27C, sin necesidad de ser repicadas o subcultivadas
peridicamente a medio fresco, durante un ao.
Entre los mtodos ms conocidos de conservacin de recursos filogenticos ex situ
se encuentran los bancos de semillas. Una gran proporcin de especies vegetales de
importancia agronmica produce semillas que pueden ser deshidratadas hasta un bajo
contenido de agua de manera de poder ser conservadas a baja temperatura. En este
sistema de conservacin existe una situacin de compromiso entre diferentes factores,
como el contenido de agua, la temperatura, la longevidad de la semilla y la
supervivencia del embrin latente. Este sistema presenta importantes restricciones
para grupos de especies de inters comercial que no producen semillas y se propagan
vegetativamente (Musa spp.), que se propagan por tubrculos, rizomas o estolones
(Solanum tuberosum, Saccharum spp.), cuya semilla botnica presenta alta
variabilidad genotpica o que producen semillas recalcitrantes (semillas que no toleran
la deshidratacin ni la conservacin a baja temperatura). Este ltimo es el caso de
muchas plantas tropicales que producen semillas de gran porte con alto contenido de
endosperma lquido (Cocos nucifera, Persea americana).
El primer reporte sobre el mantenimiento en nitrgeno lquido de rganos o tejidos
vegetales data de 1968. En esta oportunidad, Quatrano logr preservar clulas de
Linum usitatissimum por esta tcnica, con el inters agregado de conservar diferentes
genotipos. La metodologa publicada en aquella oportunidad no difera del
procedimiento ya conocido y puesto en prctica para la conservacin de otros
materiales biolgicos (semen y tejidos ovricos de vacunos). El procedimiento
comprenda el uso de sustancias crioprotectoras, el enfriamiento y deshidratacin
lentas de la muestra vegetal, el almacenamiento en nitrgeno lquido, y sucesivos
pasos de descongelamiento, lavado y recuperacin. En la actualidad, se ha producido
una gran diversificacin de las tcnicas de crioconservacin. Las diferentes opciones
metodolgicas dependen del tipo de muestra biolgica as como de las facilidades e
infraestructura disponibles.
Los pasos incluidos en la tcnica de criopreservacin pueden variar segn el tipo de
material a conservar. Las sustancias crioprotectoras usadas exitosamente en el caso
de tejidos u rganos vegetales pueden resultar txicas o inadecuadas para la
preservacin de otros tipos de explantos tales como suspensiones celulares o
protoplastos. El congelamiento puede llevarse a cabo de forma lenta, gradual o de
manera rpida. La eleccin de una u otra va depender del tipo de muestra. En todos
los casos, se trata de evitar la formacin de cristales de agua intracelulares que
pudieran destruir las clulas y daar las muestras a conservar. Numerosos estudios
han demostrado que la tasa de congelamiento ptima para asegurar una elevada
supervivencia del material conservado oscila entre 1C a 2C por minuto. La edad
de las clulas vegetales en el momento de su congelamiento constituye un factor

importante que determina su supervivencia. Esta condicin se relaciona directamente

con el tamao y contenido de agua celulares. En el protocolo pueden introducirse
modificaciones que incluyan la adicin de compuestos osmticamente activos (manitol,
sorbitol) durante el precultivo del material a conservar, de manera de reducir el tamao
celular y aumentar su tolerancia al congelamiento.
El material vegetal a conservar deber ser preparado y preacondicionado con
sustancias crioprotectoras. Estas sustancias minimizan el posible dao a que estn
expuestos las clulas y tejidos durante los pasos de enfriamiento y congelamiento. La
eleccin de los medios crioprotectores depender del tipo de material a congelar.
Cuanto menor sea el nivel de organizacin del material a preservar, mayores debern
ser los recaudos que debern tomarse. Durante el paso de congelamiento, la
eliminacin del contenido de agua en las clulas y el estado del agua remanente en el
interior de sta, resultan factores crticos. Las modernas tcnicas de crioconservacin
se basan en el fenmeno de la vitrificacin. La vitrificacin consiste en la transicin
directa del agua del estado lquido al estado amorfo o vtreo sin la formacin de hielo
cristalino. En este procedimiento, las muestras a congelar son previamente
deshidratadas por exposicin al aire o por el uso de los medios crioprotectores antes
referidos. Estos pasos minimizan la formacin de cristales intracelulares que daaran
la integridad de las clulas vegetales a conservar.
El descongelamiento puede acelerarse sumergiendo las muestras en un bao de agua
a 40C, durante 1-2 min y agregando gradualmente medio de cultivo para diluir las
sustancias crioprotectoras y evitar la plasmlisis celular. El material congelado puede,
de lo contrario, dejarse a temperatura ambiente en el laboratorio, logrndose as un
descongelamiento lento. Una vez recuperadas las muestras debe estudiarse su
viabilidad. Existen diferentes mtodos o pruebas que permiten estimar la viabilidad de
clulas y protoplastos. Las pruebas colorimtricas como el mtodo del cloruro de
2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC) y la tincin con diacetato de fluorescena (FDA) permiten
distinguir las clulas vivas de las no viables por desarrollo de color o de fluorescencia.
El material vegetal descongelado viable podr ser recultivado bajo condiciones
controladas, haciendo uso de los mismos medios y condiciones en que se lo cultivaba
antes de su criopreservacin.
El congelamiento constituye el paso crtico de la crioconservacin. La eleccin de
alguna de una de las tres modalidades de congelamiento (rpido, lento o escalonado)
depender de las caractersticas del material a preservar. Si la muestra es pequea
podr practicarse un congelamiento rpido, haciendo uso de sustancias
crioprotectoras. En el caso de muestras de mayor tamao, podr optarse por un
procedimiento lento o gradual, dependiendo del contenido de agua del material a
conservar. Para muestras de alto contenido de agua, el congelamiento escalonado
resulta aconsejable luego de la deshidratacin cuidadosa de la muestra. El
congelamiento lento y el procedimiento gradual aseguran un adecuado progreso del
congelamiento desde el interior de la muestra hacia la superficie externa.
La transparencia 63 muestra un esquema de los pasos implicados en la
crioconservacin de meristemas de soja. Los meristemas son diseccionados bajo lupa
estereoscpica y establecidos in vitro en un medio conteniendo la formulacin salina
de Murashige y Skoog complementada con diferentes reguladores del crecimiento.
Una vez desarrollados los vstagos o brotes, sus meristemas son nuevamente
separados como explanto a crioconservar. Como sustancia crioprotectora se utiliza
dimetilsulfxido (DMSO) al 5%. La tasa de congelamiento se ajusta a 0,84 C por
minuto, de manera de evitar la formacin de cristales intracelulares. Una vez
congelados, los meristemas son sumergidos en nitrgeno lquido y conservados a
largo plazo a -196C. La recuperacin del material vegetal incluye su

descongelamiento a temperatura ambiente, su lavado y su siembra en condiciones de

cultivo que incluyen medios nutritivos ricos y reguladores del crecimiento. Estos
factores favorecen el desarrollo de nuevos vstagos que crecern in vitro para dar
lugar a plantas completas. Otra posible va para la recuperacin del material
conservado, consiste en la encapsulacin de los meristemas recuperados en cpsulas
de alginato para su manejo como semilla sinttica. Estas semillas artificiales pueden
ser luego sembradas en condiciones de germinacin adecuadas para obtener plantas
completas.
Cultivo in vitro de clulas haploides y embriones
Transparencias 64-70
Las clulas haploides contienen un nico juego de la dotacin cromosmica, por lo
que constituyen una valiosa herramienta para la seleccin de caracteres deseables en
los programas de mejoramiento. El fenotipo de las plantas derivadas de estas clulas
resulta de la expresin de la nica copia del material gentico, por lo que no existe
enmascaramiento de caracteres debido a efectos de dominancia. El objetivo del cultivo
de anteras y polen es producir plantas haploides partiendo de esporas monoploides,
ya sean stas granos inmaduros de polen o microsporas, mediante la induccin de la
embriognesis. El complemento cromosmico de estos haploides puede ser duplicado
con el uso de colchicina o a travs de la regeneracin de diploides homocigotas
frtiles.
Las anteras de numerosas especies vegetales, entre ellas el tabaco, pueden ser
cultivadas de manera relativamente simple, en medios conteniendo minerales y
sacarosa. En general, la formulacin salina ms utilizada es la de Murashige y Skoog
aunque, para el caso de algunas plantas, resulta conveniente modificar el contenido
relativo de NH4. Algunas otras especies requieren la adicin de compuestos orgnicos
y hormonas vegetales. La adicin de reguladores del crecimiento del tipo de las
auxinas da lugar a la formacin de callos, lo que resulta desaconsejable porque
promueve la variabilidad gentica. En 1953, Tulecke observ por primera vez la
induccin de callos haploides a partir de granos de polen maduros de la gimnosperma
Gynkgo biloba en condiciones adecuadas de cultivo. Hacia 1966, Guha y Maheshwuari
reportaron la observacin de divisiones repetidas de granos de polen de diferentes
angiospermas in vitro. Estos investigadores realizaron experimentos de cultivo de
granos de polen de Datura innoxia (una planta solancea) como medio para el estudio
de los factores reguladores de la meiosis. En el marco de esta investigacin, lograron,
la obtencin de embriones somticos que dieron origen a plantas normales con un
nico juego de cromosomas.
El estadio de desarrollo de las anteras en el momento de inicio del cultivo resulta el
factor ms importante para la obtencin de una respuesta morfogentica. En el caso
de las angiospermas con un nmero indeterminado de anteras, es conveniente
seleccionar botones florales con diferente nmero de las mismas en los distintos
estadios de maduracin. En el caso de especies con nmero determinado de anteras,
deber examinarse cierta cantidad de pimpollos para contar al inicio del cultivo con
anteras en diferentes estadios de maduracin. La relacin entre el grado de desarrollo
y la respuesta al cultivo in vitro permite definir tres tipos de anteras: a) anteras premitticas; son aquellas que responden mejor al cultivo in vitro una vez que las
microsporas han completado su meiosis (ejemplo, Hordeum vulgare); b) anteras
mitticas; son aquellas que responden ptimamente al cultivo cuando se las siembra
luego de la primera divisin mittica del grano de polen (ejemplo, Nicotiana tabacum) y
c) anteras post-mitticas; son aquellas que responden al cultivo cuando los granos de

polen ya han alcanzado su estado bicelular (ejemplo, Atropa belladona). El tratamiento

de anteras o panculas de arroz a 10C durante 8 d aumenta su respuesta al cultivo in
vitro, disminuye el albinismo de los cereales y estimula la divisin mittica ecuatorial
de las microsporas androgenticas.
En un programa de mejoramiento, el tiempo requerido para obtener una lnea
isognica se reduce de 5/6 generaciones a 1/2 cuando se emplea el cultivo de
haploides in vitro. La duplicacin del material gentico de los haploides obtenidos se
logra tratando las anteras con colchicina antes de la primera divisin mittica del
polen. Se obtiene as una primera generacin de homocigotas. Cuando el cultivo se
inicia a partir de microsporas no tratadas con colchicina, las plantas producidas
resultan haploides (y por lo tanto estriles), pero pueden ser diploidizadas
posteriormente. La produccin de haploides in vitro no presenta limitaciones una vez
introducidos al protocolo los necesarios ajustes para cada especie de inters.
Un protocolo general de cultivo de granos de polen incluye los siguientes pasos: a)
cultivo in vitro de las anteras durante 2-3 d; b) ruptura y siembra en medio de cultivo
lquido para obtener suspensiones de aproximadamente 5x104 granos de polen; c)
filtracin y centrifugacin de la suspensin; d) resuspensin del polen en medio de
cultivo lquido a la densidad deseada. Las condiciones generales de cultivo de los
granos de polen incluyen la formulacin salina de Sunderland y Roberts (1977),
oscuridad (durante los primeros 15 d de cultivo), y temperatura de 28C.
El cultivo in vitro de polen implica la interrupcin del desarrollo normal de la gameta
masculina, forzando la evolucin de estas clulas hacia la formacin de una plntula
haploide. Para favorecer esta diferenciacin, los granos de polen deben ser aislados
de su medio natural dentro de las anteras e incubados bajo condiciones artificiales de
cultivo. Antes de iniciar el cultivo de polen, debe considerarse muy cuidadosamente el
estado de la planta a partir de la cual se obtendr el mismo (planta dadora). Esta
deber mantenerse en condiciones favorables de cultivo bajo un rgimen ptimo de
iluminacin. Durante el perodo de desarrollo del polen (andrognesis) debern
extremarse los cuidados de la planta madre para evitar cualquier condicin de estrs
que resultara en un anormal desarrollo de las clulas de inters. Antes de la remocin
del polen del interior de las anteras, resulta aconsejable mantener los botones florales
a temperatura adecuada. El fro sincroniza el desarrollo de los granos de polen,
promoviendo el cese de su actividad metablica y preparndolos para iniciar su
divisin vegetativa cuando se restablecen condiciones inductoras adecuadas (medio
de cultivo, temperatura, luz). El efecto de la baja temperatura puede compararse a una
vernalizacin o dormicin inducida. El rango de temperaturas a utilizar depende de la
especie vegetal en cultivo.
La polinizacin seguida de la fertilizacin resulta en la formacin de un embrin
contenido en una semilla. En la gran mayora de las angiospermas la autopolinizacin
se encuentra limitada. Adems, las hibridaciones interespecficas e intergenricas son
muy poco frecuentes en la naturaleza. Por esta razn, la polinizacin y la fertilizacin
in vitro constituyen herramientas muy tiles en los programas actuales de
mejoramiento. La gran mayora de los embriones obtenidos por estas vas no resultan
viables en condiciones naturales, por lo que deben ser rescatados, es decir cultivados
bajo condiciones controladas in vitro, fuera de la semilla.
El cultivo de embriones inmaduros consiste en la diseccin de los mismos bajo
condiciones de esterilidad y en su transferencia a un medio adecuado de cultivo bajo
condiciones controladas. En general, resulta fcil obtener embriones libres de
patgenos, ya que se encuentran protegidos dentro del medio estril del ovario. Antes
de la diseccin y establecimiento in vitro, se debe proceder a desinfectar

superficialmente los ovarios, semillas y/o frutos que los contienen. En el caso de
semillas con tegumentos duros o gruesos, se las sumergir en agua durante uno o
pocos das para luego utilizar soluciones desinfectantes. Las semillas esterilizadas
deben ser abiertas dentro de un gabinete de flujo laminar. Los embriones inmaduros
se remueven de la semilla y se siembran en medio nutritivo estril. En muchos casos,
la diseccin de los embriones se lleva a cabo bajo una lupa estereoscpica instalada
dentro del cuarto estril. Durante la manipulacin debe tenerse particular cuidado para
evitar daos mecnicos o deshidratacin. El aspecto ms importante del cultivo de
embriones es la composicin del medio sinttico de cultivo. Cuanto ms joven o
inmaduro es el embrin, mayores son sus requerimientos nutricionales, requiriendo
sales inorgnicas y una fuente de hidratos de carbono (sacarosa), diferentes
combinaciones de vitaminas, aminocidos, reguladores del crecimiento y, en algunos
casos, extractos naturales de endospermo, tales como agua de coco. Dado que en
general los embriones inmaduros se encuentran naturalmente embebidos dentro del
endospermo que los rodea, resulta recomendable adicionar compuestos
osmticamente activos al medio de cultivo (por ejemplo, manitol).
La tcnica de la polinizacin y fertilizacin in vitro fue desarrollada por investigadores
de la Universidad de Delhi, India, en los aos 60 utilizando como especie modelo
Papaver somniferum. El xito de esta tcnica depende de dos factores bsicos: a) el
estado de los granos de polen y de los vulos a utilizar y, b) la composicin del medio
nutritivo adecuado para la induccin de la germinacin del polen, el crecimiento del
tubo polnico y el desarrollo del embrin. Para el manejo de estas condiciones, resulta
imprescindible el conocimiento de la biologa floral de la especie de inters, lo que
implica poseer informacin sobre los procesos de antesis, la dehiscencia de las
anteras, la polinizacin, la germinacin del polen y el desarrollo del endosperma y del
embrin.
Semillas sintticas
Transparencias 71-74
La posibilidad de obtener embriones somticos a gran escala ha sentado las bases
para el desarrollo de la denominada tecnologa de las semillas sintticas. La
produccin de estas semillas artificiales se ha convertido en una alternativa para el
manejo extensivo de especies cultivables. Numerosas especies de inters agronmico
pueden hoy en da ser multiplicadas clonalmente y sembradas a campo utilizando esta
tecnologa. Estas semillas pueden ser manejadas como si se tratara de semillas
tradicionales, incluso con el auxilio de maquinaria agrcola.
La transparencia 31 muestra un esquema de la va embriognica iniciada a partir de
un trozo de tejido o de clulas vegetales en suspensin. Se grafica la regeneracin
indirecta, que pasa por des-diferenciacin del explanto inicial y sucesivas divisiones
mitticas par dar lugar a la formacin de un callo. En algunos casos, resulta posible
promover la regeneracin directa de embriones somticos (sin formacin de callo),
minimizndose de esta forma la posibilidad de variabilidad genotpica. Los embriones
o embrioides de origen somtico pueden mantenerse bajo condiciones de cultivo in
vitro, subcultivndolos en un medio que propicie su germinacin, o bien pueden
encapsularse para la obtencin de semillas sintticas. En ambos casos su germinacin
dar lugar a una planta idntica a la planta madre seleccionada.
Para la obtencin de semillas sintticas, los embriones somticos son encapsulados
en gotas de alginato de sodio al 2%. Existen diferentes procedimientos, incluso
mecanizados, para disponer los embriones en el interior de cada gota. El ms sencillo

consiste en dispensar, mientras la solucin de alginato se engloba por goteo, un

embrin dentro de una gota en formacin con auxilio de una pipeta o jeringa. Las
gotas conteniendo los embriones se agregan a ritmo lento en una solucin de NO 3Na
100 mM, lo que promueve su gelificacin y da lugar a la formacin de semillas
sintticas (perlas de alginato conteniendo embriones somticos).
Cultivo de protoplastos
Transparencias 75-79
La transparencia 76 muestra una tpica suspensin de protoplastos de Nicotiana
tabacum. Los protoplastos son clulas vegetales desprovistas de pared celular. La
introduccin en la dcada de los aos 60 de mtodos de aislamiento de protoplastos
viables por tratamientos enzimticos posibilit su obtencin a gran escala y su
utilizacin para estudios experimentales. En medios nutritivos adecuados y bajo
condiciones controladas de cultivo, los protoplastos pueden regenerar su pared celular,
dividirse y diferenciarse dando lugar a plantas completas.
Los protoplastos constituyen un explanto ideal para diferentes aplicaciones
biotecnolgicas. La ausencia de pared celular rgida y la completa exposicin de la
membrana plasmtica hacen de los protoplastos un sistema til para el estudio de los
fenmenos de transporte a travs de esta ltima. Numerosas investigaciones acerca
del proceso de infeccin y replicacin de virus fitopatgenos se han valido de los
protoplastos como herramienta de indagacin. Tambin han sido utilizados para la
elucidacin de la especificidad y modo de accin de patgenos fngicos y bacterianos.
Los protoplastos aislados son capaces de incorporar organelas exgenas, tales como
ncleos y cloroplastos, as como tambin ADN, protenas, y otras macromolculas, lo
que posibilit el desarrollo de ensayos de transformacin gentica y de fusin. Estos
explantos pueden ser empleados con xito en ensayos de mutagnesis y la
regeneracin posterior de plantas transgnicas.
El incremento en la variabilidad gentica puede inducirse en poblaciones homogneas
de clulas vegetales, protoplastos o callos, mediante la exposicin a agentes
mutagnicos fsicos o qumicos. Estos agentes permiten de incrementar el aislamiento
de variantes genticas cuando los cultivos son mantenidos bajo condiciones selectivas
que permiten la rpida deteccin de mutantes. Los principales tipos de mutantes son:
a) auxotrficos; aquellos que requieren suplementos nutricionales para su crecimiento;
b) resistentes; los que resisten a drogas especficas, antimetabolitos o condiciones
nutricionales anormales y c) autotrficos; aquellos que crecen y prosperan en medios
de cultivo deficitarios y son capaces de sintetizar compuestos normalmente requeridos
por las lneas wild type.
La mayor ventaja que ofrece el cultivo in vitro de protoplastos es la posibilidad de tratar
un gran nmero de clulas con los agentes mutagnicos y de seleccionar dichos
explantos bajo condiciones controladas. Los avances en las tcnicas de cultivo in vitro
han posibilitado el perfeccionamiento de este procedimiento para la producir lneas
celulares, tejidos y organismos mutantes en forma ms rpida y eficiente que los
procedimientos convencionales. Con la difusin de la mutagnesis y cultivo in vitro, los
investigadores han podido encarar el desarrollo de numerosas aplicaciones de inters
econmico. Ejemplos de ello son la seleccin de lneas resistentes a estrs para
obtener plantas adaptadas a suelos salinos, la obtencin de plantas resistentes a
herbicidas y pesticidas, la seleccin de lneas celulares y plantas tolerantes al
anegamiento o a temperaturas elevadas y la obtencin de plantas con alteraciones en
la sntesis de metabolitos secundarios de valor comercial (pigmentos y alcaloides).

La fusin de protoplastos posibilita el cruzamiento de individuos que no son

compatibles en la naturaleza y que no puede lograrse a travs de las tcnicas
tradicionales de mejoramiento. Los protoplastos pueden fusionarse espontneamente
durante su aislamiento o ser inducidos a ello por exposicin a condiciones especiales.
Los heterocariontes resultantes pueden contener numerosos ncleos. Estos
protoplastos multinucleados forman una nueva pared y sus ncleos entran en mitosis
sincrnicamente. El proceso meitico contina y se sincroniza en los homocariontes.
Los productos de la fusin pueden ser estudiados por diferentes mtodos. La tincin
diferencial de ncleos permite monitorear los productos de fusin. La relacin 1:1 entre
los ncleos de cada especie resulta ser la ms frecuente. Los protoplastos
multinucleados se deterioran mientras que los productos de la fusin se recuperan del
tratamiento con polietilenglicol (PEG) y forman su nueva pared dentro de las 24 h. La
produccin de clulas hbridas entre diferentes familias de plantas como tabaco y soja,
zanahoria y cebada, tomate y papa, entre otras, sugiere la ausencia de mecanismos
de incompatibilidad entre las clulas somticas. La naturaleza hbrida de las progenies
celulares puede establecerse en base a estudios de ultraestructura, identificacin de
cromosomas, isoenzimas, patrn de polipptidos, marcadores moleculares, etc.
Variacin somaclonal
Transparencias 80-83
La variacin gentica espontnea ha sido tradicionalmente utilizada para desarrollar
nuevas variedades de plantas. Durante el cultivo in vitro, cuando los tejidos pasan por
fases de des-diferenciacin, se producen alteraciones que pueden originar cambios
genticos en las plantas regeneradas. Estos cambios se denominan variacin
somaclonal y puede servir como fuente de variacin gentica para programas de
mejoramiento de plantas de importancia econmica. Tambin puede ser utilizada como
fuente para la obtencin de mutantes con caractersticas genticas, bioqumicas,
fisiolgicas y agronmicas determinadas.
La frecuencia de aparicin de variantes somaclonales es generalmente mayor en la
regeneracin indirecta (aquella que pasa por la formacin de un callo) y en los cultivos
celulares que incluyen alteraciones en el nmero de juegos cromosmicos
(poliploidia), prdida de cromosomas (aneuploidia), aberraciones cromosmicas
(deleciones, traslocaciones, inversiones) o mutaciones puntuales. Esto hace de los
cultivos de callos y clulas en suspensin sistemas interesantes y tiles para el
aislamiento, por medio de distintas presiones de seleccin, de clulas variantes o
mutantes con caractersticas especficas. Por ejemplo, la variacin somaclonal puede
utilizarse para aislar clulas resistentes a sustancias txicas (herbicidas, toxinas
microbianas, metales pesados, etc.) o a factores abiticos como el fro, la salinidad y la
sequa.
Durante el cultivo in vitro de clulas y/o tejidos vegetales puede ocurrir la obtencin de
regenerantes que presenten una alteracin espontnea de su fenotipo. En los
programas de propagacin clonal masiva, esta variabilidad resulta desventajosa o
negativa, principalmente cuando se origina a partir de mutaciones cromosmicas o
genmicas. Debido a que estos nuevos genotipos difieren del tipo varietal de la planta
madre de origen, deben ser descartados y separados del cultivo. Sin embargo, en los
ltimos aos la variacin somaclonal ha comenzado a considerarse una fuente valiosa
para el mejoramiento intra-cultivar. Este tipo de variabilidad puede verse favorecida
bajo condiciones restrictivas o bajo presin de seleccin.

En un protocolo de seleccin de variantes somaclonales, resulta fundamental aplicar la

presin de seleccin adecuada durante el cultivo. Esta presin de seleccin puede
estar dada por el agregado de determinados compuestos al medio de cultivo
(antibiticos, herbicidas, etc.), o por el aumento o la modificacin de la concentracin
relativa de algunos componentes de la formulacin salina (por ejemplo, alta
concentracin de ClNa), por variacin de la temperatura en la cmara de crecimiento,
o por la alteracin de las condiciones de iluminacin (intensidad o fotoperodo), entre
otras.