PARASITOLOGIE

valuation dune mthode simple et rapide

dextraction de lADN de Plasmodium falciparum
partir de gouttes paisses de patients gabonais.
M.-T. Ekala (1), F. Lekoulou (1), S. Djikou (1), G. Dubreuil (1), S. Issifou (2, 3) & F. Ntoumi (1)*
(1) Centre international de recherches mdicales (CIRMF), B. P. 769, Franceville (Gabon).
(2) Dpartement de biochimie et de biologie cellulaire, Facult des sciences et techniques, Universit nationale du Bnin,04 B.P.0320,Cotonou,Benin.
(3) CREDESA / SSP, Centre rgional pour le dveloppement et la sant, B.P. 1822,Cotonou,Bnin
*Correspondance : Dr Francine Ntoumi,CIRMF, B. P. 769, Franceville (Gabon). Fax : (241)-67-75-83.E-mail : fntoumi@cirmf.sci.ga
Manuscrit n2031. Parasitologie. Reu le 28 janvier 1999. Accept le 9 juin 1999.

Summary: Evaluation of a simple and quick method for extracting DNA

from Plasmodium falciparum using thick blood smears of Gabonese patients.

Plasmodium falciparum
In field-based studies, sometimes it is difficult to collect and store samples. We have evaluated a
method of malaria parasite deoxyribonucleic (DNA) extraction from non-stained thick dried blood deoxyribonucleic acid (DNA) extraction
blood smear
smears collected from 108 Gabonese patients. This method of DNA isolation was compared to
malaria
those using phenol/chloroform. Patients parasitemia ranged from 0 to 240.000 parasites/l of
hospital
blood. Both methods of DNA preparation gave similar results. Of the 108 slides, 57% were PlasGabon
modium falciparum positive after PCR analysis of the MSA-2 gene and 34% were positive by micro Sub-Saharan Africa
scopical examination. Thirty-six and seventy-two blood smears from patients were also tested after
one and four weeks storage respectively, at room temperature, and the parasite DNA was success fully extracted. We conclude that this simple method of collection and rapid procedure of parasite
DNA isolation are adequate and convenient in the field when a large number of samples are requi red and in the case of repetitive samplings of patients.
Rsum :
La mthode de prlvement et la conservation des chantillons sanguins posent parfois des pro blmes sur le terrain en zone dendmie palustre. Il est donc ncessaire de disposer dune technique
permettant un bon recueil du sang et qui permette aussi une bonne exploitation de ce matriel au
laboratoire. Nous avons valu une mthode dextraction de lacide dsoxyribonuclique (ADN)
parasitaire partir des lames portant des gouttes paisses non colores ralises avec du sang de
108 malades gabonais dont la parasitmie tait comprise entre 0 et 240 000 parasites/l de sang.
Cette mthode dextraction a t compare celle utilisant du phnol/chloroforme. Les deux
mthodes dextraction ont donn des rsultats identiques. Pour tester lefficacit de la mthode
dextraction, nous avons amplifi le gne MSA-2 de Plasmodium falciparum. Nous avons trouv
57 % de lame positives aprs le gnotypage contre 34 % aprs lobservation microscopique des
parasites. Lanalyse de 36 et 72 lames a t reprise aprs respectivement une et quatre semaines de
conservation des lames la temprature ambiante. LADN parasitaire a t mis en vidence une
semaine et un mois aprs recueil du sang. La goutte paisse tant la mthode la plus utilise pour
diagnostiquer le paludisme, nous avons conclu que cette mthode simple et rapide de prlvement
et dextraction de lADN de P. falciparum est pratique et convenable pour les tudes de terrain
lorsque lon ne dispose pas de structures pour conserver des prlvements dans des conditions
strictes de froid, que lon a un grand nombre dchantillons analyser et lorsquil savre ncessaire
de faire des prlvements rpts.

Introduction

e nombreuses tudes montrent que le paludisme est

divers dans ses manifestations cliniques et dans ses descriptions pidmiologiques. Ces dix dernires annes, de nombreuses tudes dpidmiologie molculaire des parasites ont
mis en vidence une diffrence gographique dans les isolats
de Plasmodium falciparum (6, 3, 2, 12). Lanalyse au niveau

Plasmodium falciparum
extraction dacide dsoxyribonuclique (ADN)
goutte paisse
paludisme
hpital
Gabon
Afrique intertropicale

molculaire des parasites devient une ncessit pour, dune

part valuer les effets de la lutte anti-vectorielle ou ceux produits par les essais vaccinaux sur les populations de plasmodies, et dautre part pour explorer spcifiquement la complexit
des infections P. falciparum (4).
Les tudes de terrain demandent une longue prparation et
ncessitent le consentement inform des populations. Des
prlvements rpts sont un argument courant pour refuser

Parasitologie

dtre inclus dans une tude. La simplification de la mthode

de prlvement de sang est donc essentielle pour pouvoir disposer de larges cohortes et par consquent de rsultats fiables
ayant une signification statistique. Il est aussi important que
cette mthode permette de raliser un travail de laboratoire
convenable (obtention dADN parasitaire de bonne qualit).
Lamplification gnique (Polymerase Chain reaction, PCR)
sest avre un outil prcieux dans le diagnostic (1, 9) de la
maladie en cas de parasitmie trs faible (15). Pour faire des
prlvements de sang, diffrents supports ont t tests tels que
des papiers filtres (14), des lames colores au Giemsa (8) ou
encore des tubes contenant de lEDTA (thylne diamine
ttra acetic).
La goutte paisse est le moyen le plus frquemment utilis
dans les zones dendmie paludenne pour dtecter et identifier les parasites et des tudes (8, 10) ont rapport que lutilisation de la goutte paisse et/ou du frottis colors pour isoler
lADN parasitaire taient des techniques possibles. Cependant,
cette mthode semble plus adquate dans les cas o le patient
a une parasitmie leve (8).
Nous prsentons ici les rsultats de notre valuation de lextraction de lADN parasitaire partir de gouttes paisses sches
et non colores provenant de patients gabonais ayant des parasites dtectables ou non en microscopie. Nous comparons
cette mthode dextraction celle de rfrence qui est celle de
lextraction phnolique ralise sur du sang veineux.

Matriel et mthodes
Patients
Cent huit patients venus en consultation lhpital de Franceville (sud-est du Gabon) et lhpital de Moanda (67 km de
Franceville) ont t recruts dans cette tude avec leur consentement inform individuel durant la priode de mars
avril 1998. Certains malades avaient de la fivre (temprature
axillaire > 37,5 C) ou avaient eu de la fivre la veille. Dautres
patients avaient t convoqus pour une visite mdicale recommande par le service des ressources humaines de leur entreprise. Cette tude a eu lapprobation du comit dthique du
centre (CIRMF).

chantillons
Avant le traitement antipaluden (J0), trois lames L1, L2 et L3
ont t ralises pour chaque patient. Sur L1, une goutte
paisse avec 4l de sang et un frottis avec 1,5l ont t colo rs au Giemsa afin de dterminer la densit parasitaire et
didentifier le Plasmodium. L2 et L3 nont pas t colores
mais ont t conserves au sec dans une bote de rangement
labri de la poussire. Lextraction de lADN parasitaire a t
ralise immdiatement en utilisant L2 et aprs un dlai de 8
jours (36 chantillons) et de 30 jours (72 chantillons) de
conservation en utilisant L3. Quatre autres gouttes paisses ont
t faites avec les parasites SGE2 et Hb3 dune culture in vitro
(concentration de 50 parasites/l) (7). Ces quatre dernires
lames ont t exploites dune faon identique J0, J8 et J30.
Sans tre informs des rsultats de lanalyse molculaire, les
lames sont lues par deux techniciens expriments (le seuil
de dtection tant de 10 parasites/l de sang).
Par ailleurs, le sang de tous les participants ltude a t
galement prlev sur ethylene diamine tetra acetic (EDTA)
pour une tude dont lobjectif tait dvaluer les rponses
immunitaires.

Bull Soc Pathol Exot, 2000, 93, 1, 8-11

Techniques dextractions de lADN parasitaire

Dune part, nous avons utilis la technique dcrite par EDOH
et coll. (8). Chaque goutte paisse de sang sch a t racle
laide dun bistouri strile dans 10 l de Na 2HPO4 5mM.
Aprs deux lavages avec le mme tampon, le culot obtenu a
t resuspendu dans 20 l deau strile puis port bullition
pendant 10 minutes. Dautre part, nous avons conserv
-80C une cinquantaine de microlitres de sang veineux pour
lextraction de lADN parasitaire au phnol/chloroforme (11).

Ractions damplification de lADN (PCR niche)

Cinq microlitres de cette solution ont t utiliss pour la
premire amplification. Nous avons amplifi le gne codant
lantigne 2 de surface du mrozoite (MSA-2) de P. falcipa rum laide de deux amorces non spcifiques dallles (1+4)
puis une seconde amplification a t ralise en utilisant les
a m o rces (2+3) en suivant les conditions damplification
dcrites prcdemment avec un seuil de dtection de 0.25pg
dADN parasitaire (5, 11).

Rsultats
ADN parasitaire extrait partir de la goutte
paisse J0 et microscopie conventionnelle
La parasitmie des patients recruts varie entre 0 et 240000
parasites/l de sang. Sur un total de 37 patients, 21 patients ont
prsent de 10 4999 parasites/l de sang, 13 patients de 5 000
100 000 et, pour 3 patients, la densit tait suprieure
100 000 parasites/l de sang.
Lexamen microscopique (gouttes paisses et frottis) des 108
lames L1 a montr que 37 patients taient infects par P. fal ciparum. Lanalyse molculaire a permis dobtenir 100 %
damplifications enzymatiques de lADN parasitaire avec les
lames de ces mmes 37 patients. 46 lames ngatives lexamen
microscopique se sont rvles aussi ngatives avec notre technique dextraction et damplification. Tandis que les lames de
25 patients ngatives lexamen microscopique ont permis
damplifier lADN parasitaire aprs cette technique dextraction rapide. Ainsi, 37/108 (34 %) sont positives lexamen
microscopique et 62/108 lames (57 %) sont positives par
amplification du gne parasitaire MSA-2. La figure 1 montre
des bandes visibles, claires et propres dtectes sur le gel dagarose aprs la seconde amplification de lADN extrait partir
de la goutte paisse non colore.
Figure 1.
Analyse des produits de PCR obtenus aprs avoir extrait lADN parasitaire partir
des gouttes paisses ou aprs avoir utilis la mthode au phnol/chloroforme.
Analysis of PCR products obtained after extracting parasitic DNA
from thick blood smears or having used the phenol/chloroform method.

Migration sur gel dagarose des produits de PCR niche du gne MSA-2 de P. falciparum
(11) aprs coloration au bromure dthidium. LADN parasitaire de 8 isolats a t extrait
partir de la goutte paisse au Na2HPO4 ou par la mthode phnol/chloroforme.
Ligne VI : marqueurs de poids molculaire de Boehringer VI. Patient 1 : Lignes 1 et
10. Patient 2 : lignes 2 et 11. Patient 3 : lignes 3 et 12. Patient 4 : lignes 4 et 13.
Patient 5 : lignes 5 et 14. Patient 6 : lignes 6 et 15. Patient 7 : lignes 7 et 16. Patient
8 : lignes 8 et 17.Des infections multiples (une bande reprsentant un gnotype
parasitaire) P. falciparum sont dtectes dans les isolats des patients 2,5,6,7,8.
Lignes 9 et 18:les tmoins ngatifs de la raction,aucun ADN na t ajout dans le
milieu ractionnel.

M.-T. Ekala, F. Lekoulou, S. Djikou et al.

Figure 2.
Analyse des produits de PCR niche obtenus aprs avoir extrait lADN J0 et J30.
Analysis of PCR nested products after J0 and J30 DNA extraction.

Migration sur gel dagarose des produits de la double amplification du gne MSA-2
de P. falciparum aprs coloration au bromure dthidium. Lextraction de lADN parasitaire a t ralise partir de la goutte paisse sche immdiatement et 30 jours
aprs le prlvement.LigneVI : Marqueurs de poids molculaire BoehringerVI.Lignes
2 et 5 sont des isolats qui taient ngatifs en microscopie. Lignes 7 et 14 sont les
contrles ngatifs de la raction.Lignes 1 6 : lADN parasitaire a t extrait J0.
Lignes 8 13 : lADN parasitaire a t extrait J30.

valuation de lADN parasitaire extrait aprs un

dlai de 8 jours et 30 jours.
Nous avons compar les rsultats obtenus aprs extraction
de lADN parasitaire des intervalles de temps diffrents :
immdiatement aprs le prlvement de sang, huit et trente
jours aprs conservation temprature ambiante. LADN
parasitaire extrait des parasites SGE2 et HB3, des 108 gouttes
paisses des patients avec une trs faible parasitmie (25 chantillons) ou avec une densit parasitaire dtectable en microscopie (> 10 parasites/l) tait amplifi quel que soit le dlai
de conservation des lames J0, J8 ou J30. Aucune diffrence na
t observe dans lintensit de la bande produite (figure 2).

Validation de la mthode dextraction rapide

sur lame et comparaison avec celle
utilisant du phnol/chloroforme.
Les soixante-deux chantillons qui prsentaient une bande
aprs lextraction au phnol/chloroforme ont aussi prsent
une bande aprs lextraction au Na2HPO4 partir de la goutte
paisse. Lintensit des bandes peut varier en faveur de lune
ou lautre mthode de faon non significative (figure 1).

Discussion

objectif de cette tude tait dvaluer une mthode simple

de recueil de sang, la goutte paisse non colore, associe
une mthode rapide dextraction de lADN parasitaire en utilisant des prlvements du terrain. Il est vrai quil existe des
supports plus lgers comme les papiers filtres pour recueillir
le sang mais, concrtement, tout laboratoire de zone dendmie a des facilits pour avoir des lames tandis que se procurer rgulirement des filtres peut savrer moins ais. Cest
aussi lune des raisons qui nous conduit faire lvaluation prsente ici.
Pour valuer notre mthode dextraction, dont lexcution
est simple et rapide, nous avons aussi trait les mmes chantillons sanguins par la mthode classique dextraction utilisant
le phnol et le chloroforme, tandis que lamplification gnique
a t ralise dans des conditions strictement identiques. Il
faut noter que la technique phnol-chloroforme ncessite
lemploi dun volume de sang 12,5 fois suprieur obtenu par
ponction veineuse. Notre technique dextraction rapide peut
se raliser plus simplement avec quatre microlitres de sang
obtenus par simple piqre du doigt.
Nous navons pas eu de problme de contamination avec ces
deux mthodes. Nous avons observ que lintensit de la
bande obtenue sur le gel aprs llectrophorse du produit
PCR diffre peu entre les deux techniques dextraction dADN
utilises. Ceci est important remarquer pour la validit des

10

tudes dpidmiologie molculaire des parasites qui utiliseront ces mthodes de prlvement et disolement de lADN
parasitaire.
Pour valuer la sensibilit de cette mthode, nous avions pris
des sujets asymptomatiques dont la parasitmie ntait pas
dtectable par lexamen microscopique conventionnel. Vingttrois pour cent des malades dclars ngatifs par la microscopie furent identifis positifs par lanalyse du gne MSA-2.
Nous navons pas t surpris que la PCR niche soit plus sensible que la microscopie (11, 14).
Dans une analyse molculaire des parasites prlevs chez des
sujets tanzaniens, il a t rapport par EDOH et al. (1997) (8)
que la mthode dextraction de lADN parasitaire partir de
lames colores ntait efficace que pour les parasitmies leves. Avec notre technique, lADN parasitaire a pu tre dtect
aussi de faon efficace dans les cas de parasitmies trs basses.
Il est possible que la coloration altre la qualit de lADN
extrait (10). Il a aussi t possible de dtecter des infections multiples P. falciparum mme en cas de parasitmie basse. La
mthodologie dcrite ici a un avantage logistique car un quipement minimal est requis (pas de conglateur, ni de tubes
EDTA). Cette mthodologie prsente aussi un avantage
thique. En effet, le recueil dun faible volume de sang chez
des enfants et des nouveau-ns est moins contraignant. De
plus, le transport des prlvements du terrain au laboratoire
peut se faire sans risque daltration.
Nous avons obtenu une amplification identique pour tous les
prlvements extraits J0, J8 et J30. Il apparat clairement que
lADN parasitaire isol dans les semaines qui suivent le prlvement permet de faire des analyses molculaires de bonne
qualit, mais le dsavantage majeur pourrait tre la courte
dure de conservation. Il serait intressant de tester la validit
de cette mthode avec des conditions de conservation temprature ambiante mais avec des dlais de plusieurs mois.
Cette tude montre que la technique prsente ici est approprie pour les tudes pidmiologiques incluant un grand
nombre dindividus. Cette mthodologie savrerait utile aussi
dans les tudes ncessitant des prlvements rpts comme
lanalyse cintique de populations parasitaires.

Remerciements
Nous remercions chaleureusement les participants et le personnel des
hpitaux de Franceville et de Moanda, en particulier les docteurs GUIZARD, PLACCA, DAOUD, SICA, ANASTHASIE ainsi que M. KARMAN,
Directeur de lhpital de Franceville pour leur contribution cette
tude. Ce travail a bnfici dun financement de UNDP/World
Bank/WHO Special Programme for the Research and Training in
Tropical Diseases (TDR), numro ID 971211. Le Centre international de recherches mdicales de Franceville est financ par le gouvernement du Gabon, Elf Gabon et le Ministre de la coopration franaise.

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