DIAGNSTICO MOLECULAR EN MEDICINA

Agosto del 2007

La mayor parte de las mutaciones que causan enfermedades hereditarias
son tan pequeas que no pueden identificarse mediante anlisis citogenticos como
cariotipos.
I.

Cuando existen deleciones de un segmento de un gen o de un

gen completo, como en casos de Distrofia Muscular de
Duchenne la delecin se puede identificar mediante:

a) Southern blot. Utilizando una sonda (ADN complementario al gen de inters)

marcada radiactivamente se observa la ausencia o una disminucin en la
longitud del segmento de ADN hibridizado.
b) PCR. Utilizando oligonucletidos iniciadores (sentido y antisentido) que
flanquean cada uno de los exones de un gen se detecta ausencia de
amplificacin para los exones deletados.
c) FISH. Utilizando una sonda de ADN fluorescente complementaria al gen de
inters se observa ausencia de hibridacin en el cromosoma afectado.
Duplicaciones de genes y expansiones de nucletidos. Cuando existen
amplificaciones en el nmero de copias de un gen, como en el caso del oncogen
myc asociado a Neuroblastoma en humanos, se puede detectar generalmente
mediante:
a) Southern blot. Se observa como un fragmento de mayor longitud o de mayor
intensidad. Tambin cuando existen rearreglos genticos en que segmentos
alejados de un gen son yuxtapuestos por recombinacin, se pueden identificar por
Southern blot como un fragmento de longitud anormal.
Un tipo de expansin de nucletidos analizados frecuentemente en clnica son
los Microsatlites. stos son repeticiones en tndem de secuencias cortas de
nucletidos, generalmente de 2 a 20. Se encuentran dispersas a lo largo del
genoma y algunas en la vecindad de algn gen. Aunque su funcin no se conoce
son marcadores tiles de Polimorfismo y segregacin cromosomal. Es decir, es
posible asociar una mutacin en un individuo directamente al cromosoma del padre
o al de la madre. Estos Microsatlites pueden expanderse o deletarse y este suceso
puede asociarse a alteraciones cromosomales que llevan al Cncer; proceso que
se conoce como Prdida de Heterozigocidad (LOH).
Para deteccin de mutaciones puntuales comunes conocidas, como por ejemplo
en las enfermedades Anemia de Clulas Falciformes, algunos tipos de Talasemias,
de Fibrosis Qustica, Fenilcetonuria y Gaucher entre pocas otras, se pueden utilizar
las siguientes aplicaciones de PCR:
a) Hibridacin con Oligonucletido Especfico de Alelo (ASO). En este mtodo
se asla ADN genmico del paciente y se hace PCR con oligonucletidos
iniciadores cercanos al sitio de la mutacin. El producto de PCR se hibridiza con
un Oligonucletido 100% complementario a la secuencia silvestre (normal) y
con otro Oligonucletido 100% complementario a la secuencia mutada. Este
formato se utiliza con frecuencia en la tipificacin molecular para antgenos de
histocompatibilidad mayor (HLA-MHC).

b) PCR Especfica de Alelo. Se utiliza un Oligonucletido iniciador, generalmente

el Sentido con su ltimo nuclotido del extremo 3 complementario a la
secuencia silvestre y otro Oligonucletido con el extremo 3 complementario a la
secuencia mutada; con ambos oligos Sentido se acompaan del mismo oligo
Antisentido. Solo habr producto de PCR cuando el oligo Sentido sea
complementario a la secuencia blanco.
c) PCR y Anlisis de Enzima de Restriccin (PCR-RFLP). Algunas veces la
mutacin crea o altera un sitio reconocido por una enzima de restriccin
especfica. Es el ejemplo de la anemia de clulas falciformes y en algunos
Polimorfismos o variaciones genticas. En estos casos se aisla ADN genmico
y se amplifica mediante PCR la regin que contiene el sitio de la mutacin y
despus se incuba con la enzima de restriccin especfica. Es muy til en
clnica para tamizar varias muestras cuando se trata de mutaciones muy
frecuentes.
ESCANEO MOLECULAR DE MUTACIONES. Cuando se sospecha que un
gene puede estar mutado en cierta enfermedad, pero no se conoce el sitio
exacto de la mutacin, el primer abordaje es recurrir a alguno de los
siguientes mtodos para definir la regin o rea (p. Ej. Exones) en donde
pueda estar la mutacin; una vez identificado el exn alterado, se procede a
secuenciar el ADN para conocer la mutacin:
Polimorfismo de Cadena Sencilla de ADN (SSCP) y Anlisis de Heterodplices
(HET).. Se aisla ADN genmico y se amplifican regiones codificantes (exones) del
gen utilizando Oligos iniciadores separados por regiones de 150 a 200 pares de
bases. Con fragmentos de este tamao es posible detectar cambios en la movilidad
electrofortica de cadenas de ADN sencillas disociadas o de heteroduplex
mutantes.
Prueba de la Protena Truncada (PTT). Mutaciones que causan la lectura
prematura de un codn de terminacin en el ARN mensajero producen protenas
truncadas. Principalmente son mutaciones i) sin sentido, ii) por cambios de fase (de
lectura del Cdigo Gentico) y iii) errores de empalme (procesamiento del ARNhn a
ARNm). ste es el mtodo de eleccin para genes en donde prevalece la presencia
de mutaciones truncantes, por ejemplo BRCA1 para cncer mamario, APC para
cncer de colon, Distrofina para distrofia muscular. Es ms fcil a nivel de ADN que
a nivel de ARNm, por el fenmeno de Decaimiento de ARNm sin sentido. (ver
Regulacin de la traduccin).
Microarreglos de ADN. Esta es una nueva tecnologa emergente en la cual
secuencias de oligonucletidos son arregladas a alta densidad en renglones y
columnas dentro del espacio de una laminilla de microscopa. La longitud puede ser
desde menos de 10 nucletidos hasta ms de 100 y un espacio de unos pocos
centmetros puede contener miles de secuencias diferentes que permiten analizar
cientos de diferentes variaciones en la secuencia nucleotdica de un gene.
Esta tecnologa se usa tambin para obtener perfiles de expresin gentica. Los
genes que se expresan en un tejido estn representados en su poblacin de ARNm
y este se puede extraer de tejidos tumorales para comparar los genes que
aumentan o disminuyen en su expresin en comparacin al tejido normal.
Western blot e inmunohistoqumica.
Estos mtodos permiten identificar directamente la expresin de la protena. En el
western (inmunotransferencia) la protena se identifica por su peso molecular

mediante electroforesis y anticuerpos especficos. En la IHQ se utiliza el anticuerpo

para detectar a la protena en cortes histolgicos que permiten su evaluacin en
cuanto a su estado de expresin y de localizacin tisular.
Bibliografa.
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Devlin, TM. Bioqumica con Aplicaciones Clnicas. 4.Ed Revert, 2004.

Baynes JW y Dominiczak. Bioqumica Mdica. 2.Ed, 2006.
Lodish H. Biologa Celular y Molecular. 5 Ed, 2005