AO DE LA PROMOCIN DE LA INDUSTRIA

RESPONSABLE Y DEL COMPROMISO

CLIMTICO
FACULTAD DE AGRONOMIA

CURSO

Biotecnologa

DOCENTE

Ing. Cesar Puicon Aazco.

TEMA

Cultivo de tejidos en camote.

ALUMNA

Holgun Quispe Adriano Emilio

Piura -2014

CULTIVO DE TEJIDOS EN CAMOTE

Ipomoea batata
1
2
3
4

5
6

Ventajas de la tcnica de cultivo de tejidos

Introduccin de material in vivo a in vitro
Aisla~ento de meristemas
Hicropropagacin
Conservacin a largo plazo
Hedios de cultivo
Ref~rencias

El cultivo de tejidos permite la propagacin clonal rpida de un

gran nmero de plntulas en un perodo breve y la conservacin de
germoplasma, bajo condiciones controladas, en espacios pequeos y con poca
mano de obra.
En este documento se describen las ventajas, las metodologias y los
materiales ~sados en cultivo de tejidos que se emplean en el
Centro Internacional de la Papa (CIP) y se analizan las tcnicas de
aislamiento de meristemas, la micropropagacin y el almacenamiento a
largo plazo.
batata (Ipomoea batatas (L.) Lam.) Est considerada en el stimo
puesto en las estadsticas de FAO (1978) como cultivo alimenticio en el
mundo.
La

VENTAJAS

El

ClP

DE LA TECNICA

mantiene

DE CULTIVO

una germoplasma

DE TEJIDOS

de

batat~

de

coleccin de entradas. Su ms de 5000 en el campo es

mantenimiento
clonal muy
costoso
y
adems
existe
un
riesgo
de enfermedades
infecciosas o
prdida
por
climticas condiciones su mantenimiento
dusfavorables. Por eso,
siguientes
ventajas:

in vitro ofrece las

o Menores
costos

de

mano de obra
ausencia

de

infecciones
de campo
contra
o Proteccin
desfavorables

condiciones

ambientales

o Acceso oportuno al material en conservacin

o Acceso oportuno al material para
eliminacin de patgenos
o Disponibilidad permanente de material
para propagacin
o Exportacin (cuando est libre de patgenos).

En el ClP hasta la fecha, se mantienen in vitro 2

800 entradas de la coleccin de germoplasma de batata.
En el presente texto, al nominar
utilizar el trmino de batata.

l. batatas, se

INTRODUCClON DE MATERIAL IN VITRO

La planta madre in vivo debe ser proveniente de invernadero, tener

entre uno a dos meses de edad, poseer ptimas condiciones de sanidad, y
no tener yemas laterales muy brotadas (en todo caso no deben ser
includas). En la planta madre se cortan los tallos y se eliminan las
hojas dejando un pedazo de pecolo cubriendo las yemas; los tallos se
cortan en segmentos, de 2 a 3 cm de longitud, cada uno con una yema
axilar y una porcin de entrenudo detrs de la yema,
para manipularla
fcilmente. Antes de enviarlos al Laboratorio o in vitro, estos
segmentos de tallo son tratados con un acaricida de amplio espectro
(que destruya

los diferentes estadios desarrollo de los caros)

como

Morestan-Baye~ (Chinometonat) al 0,5 %,

durante 10 minutos. Lvego, se elimina el acaricida lavando los segmentos
de tallo con agua corriente y depositndolos en un envase limpio que se
tapa con un plato de petri hasta que se empiece el proceso de
desInfeccin superficial.
Para la desinfeccin superficial de los segmentos de tallo se elimina
el agua corriente del vaso, se agrega alcohol de 96% y se les deja en
l por dos segundos; se elimina el alcohol y se agrega inmediatamente una
solucin de hipoclorito de calcio de 2,5 % (llevado a pH 8 con Hel).
Tambin se puede utilizar hipoclorito de sodio o leja. De ser posible,
agregar unas
gotas ce un agente dispersante-adherente como Twepn 20 80 (4 gotas/L
de
solucion). Se lleva el la cmara de transferencia de
vaso a
flujo laminar, bajo
donde despus de 15
condiciones aspticas, se
minutos,
elimina el
hipoclorito y se
veces con agua estril; despus
lava tres
del ltim0
5

lavado, para aminorar la fenolizacin de los explantes, se dejan

stos sumergidos en solucin estril de cido ascrbico 100 ppm hasta el
momento de la escisin.
En estas condiciones se procede a realizar la escisin de yemas
eliminando el mayor nmero de hojuelas y primordios foliares, de tal
manera que las porciones escindidas sean lo ms pequeas posibles.
Se considera
ser mayor

0,6 mm un tamao ptimo,

si no

se

ejemplo: microscopio

cuenta

con

pero el tamao del explante

facilidades para

la

puede

exisin

(por

estereoscpico).

Las yemas son sembradas

en el medio d~ cultivo HHB-I y se mantienen

en

ella por un perodo de 15 das. Luego, se transfieren

al medio HHB-II,

donde se desarrollan

vara entre 30 y

como plntulas en un perodo que

60 das. Al
cabo de este tiempo, se puede
medio

propagar por nudos individuales

en el

HPB.
Para la primera etapa de proparacin se

utilizan tubos de 16 x 125 mm

para la segunda, tubos de 18 x 150 25 x 150

mm.
Debido a que en estos casos se usan porciones meristemticas mayores de
0,6 mm, es probable que en algn material se presente contaminacin
con bacterias saprfitas principalmente. Dado el caso se puede
proceder de dos maneras:
Si se tiene un
microscopio
meristema3 entre
0,4 mm a 0,6
1

estereoscpico, proceder
a escindir
mm y a sembrarlos en
el medio de

introduccin (HHBI), haciendo

HHB-II.

transferencias semanales
al medio

Se puede tratar de erradicar las bacterias o levaduras mediante

el uso de antibiticos que se pueden incorporar al medio. En
caso de bacterias se recomienda usar Rifampicina
300 CIBA) a una concentracin de 40 ppm.
La

(Rimactn

Rifampicina en solucin concentr.ada(12 COO ppm) y esterilizada

por filtracin, se coloca en pequeos cuadrados de papel

filtro estril (5 x 5 mm), los cuales St dejan secar en la
cmara de flujo laminar; se colocan aproximadamenate 0,03cm3
de solucin concentrada por cada cuadrado de papel.
Se recomienda no

utilizarlos despus de

preparado, ya que pierden progresivamene

siete das de haberlos

su eficacia.

Este trabajo debe realizarse bajo condiciones de asepsia. Los

cuadrados de papel son introducidos
la yema sembrada, y sta
con otro papel-antibitico
usar otros antibiticos

en el medio de cultivo junto a

debe ser transferida

cada 3 a

como Cefoxitina

das.

a medio fresco

Tambin se pueden

(Mefoxin t1erck) en dosis

de 500 ppm.
En

el

caso de

que

la contaminacin :~ea por levaduras, se

recomienda usar Amphotericin

ppmr siguiendo

en

dosis

de 0.25 ppm a 0,5

en todos los casos el mismo sistema del papel de

filtro.

3 AISLAMIENTO Y CULTIVO DE MERISTEMAS

El meristema es un tejido compuesto por clulas en divisin y constituye

el punto activo de crecimiento de las yemas. El domo de la yema contiene
las clulas meristemticas y est rodeada por primordios foliares y
hojas primarias.

Las clulas del mer i s t ema se dividen

9

forman los

nuevos tejidos. La nutricin

de la seccin

disectada

es proporcionada

por el medio artificial.

El aislamiento de la zona meristemtica en condiciones aspticas y su
cultivo en un medio nutritivo adecuado permte el desarrollo de
plntulas, siguiendo un patrn de diferenciacin al del que presenta
una planta normal.
la diseccina del meristem es un proceso delicado que exige prctica
y se realiza principalmente con el objeto de erra3iccr virus. La
secuencia de la diseccin se muestra fotogrficamente es
llevada a cabo como sigue:
Se cortan los tallos de la planta en segmentos conteniendo cada uno uronudo
con su yema axilar, este material se desinfecta con Merestan (Bayer)
e hipoclorito de sodio, de igual forma como se realiza para la
introduccin de material "in vitro.
Despus de enjuagar
microscopio de diseccin

el

material
con agua destilada, bajo un
con la ayuda de una aguja estilete I
'J
se eliminan las hojas que rodean el punto de crecimientohasta quede
slamente la cpula de la yema y dos o tres foliares.
cpula con los primordios foliares son disectados con un bistur
1 transferidos al medio de cultivo HMB-I. El meristema disectado
es
transferido semanalmente a medio fresco HHB-II, en este medio al cabo
de 6

La

semanas el meristema
se subcultivadas en

diferencia en plntula. Estas

plntulas son de propagacin

el ~edio cultivo). (ver seccin 6: Medios de

Termoter4pia: En el CIP,
a la escisin de
previamente plantas se
meristemas, las
someten durante un mes a
termoterapia de 3aoC por
dieciseis
horas y 320C por ocho horas
bajo luz
constante. Este
tratamiento a alta
1
0

temperatura ha aumentado la eficiencia en el proceso de produccin

de material libre de virus.
Despus de la termoterapia, para la escisin de meristemas, se
puede utilizar indistintamente yemas axilares o apicales.
4 MICROPROPAGACION

El objetivo de la micropropagacin es obtener un gran nmero de

plantas clonales en un perodo corto. En el CIP se siguen los siguientes
mtodos:
Propagacin por nudos. Se basa en que el nudo de una plntula in
vitro colocado en un medio de cultivo apropiado induce el desarrollo de
la yema aY-ilardel nudo obtenindose como resultado una nueva plntula
in vitro. Es importante notar que este tipo de propagacin se basa en el
desarrollo de la yema axilar que es una estructura morfolgica ya
existente. La condicin nutricional-hormonal del medio simplemente juega
un papel en la ruptura del reposo de la yema axilar y promueve su
rpido desarrollo. Se
usa el medio de propagacin descrito e: la seccin 6.
Es importante tener mucho
cuidado de no regeneracin
de plntulas, porque esto
gentica del genotipo.

permitir la formacin de
callos y tiende a
afectar la 3tabilidad

Las plntulas se desarrollan bajo condiciones

de das largos (16 horas

ie luz a 45 uE/m2/seg2 3000 lux) y con temperaturas de 25 Oc a 28 oC.

Bajo estas condiciones los niveles de micLopropagacin son rpidos y
cada nudo
se desarrollar como una plntula que logra alcanzar todo el largo del
tubo de prueba y est lista para el subcultivo despus de seis semanas.
Las plntulas in vitro de

en e3ta forma son

batata producidas transferidas

fcilmente sea a

a
vivo,

condiciones in

ya

directamente a camas en el campo.

(Figura 4)

pequeas macetas o

Propagacin por segmentos de tallo en

con la papa, es posible micropropagar
de cultivi

medio lquido. De igual manera que

batata en envases o frascos por medio

lquido (Figura 5). Para ello, se preparan segmentos de

tallo que tengan 5 a 8 nudos y se

remueven

tanto el pice como las

races de la plntula por propagar. Estos segmentos son sembrados en un

medio lquido que contiene cido gibberlico para romper el reposo de
todas la yemas
axilares a lo largo del segmento de tallo. Los nudos brotan y entre 3 a
4
semanas se desarrollan En nuevas plntulas que pueden ser usadas como
material inicial para la propagacin por nudos simples o, nuevamente, por
medio de segmentos de tallo en medio lquido, dependiendo de las
necesidades del programa. Someter los cultivos a agitacin puede acelerar
y favorecer el desarrollo de las nuevas plntulas, aunque esto no
es imprescindible.

5 CONSERVACION A LARGO PLAZO

La conservacin a largo plazo es doblemente importante, para la propagacin

y para la conservacin. En un cultivo propagado clonalmente es importante
que cada propgulo no sufra alteraciones genticas, no importa que stas
sean pequeas, ya que se pueden acumular en el cultivo de una generacin a
la otra y pueden originar cambios
la produccin.

mayores que afectaran la unifor~idad y

En el caso de conservacin de clones de germoplasma, es vital hacer un

anlisis detallado de la estabilidad gentica del cultivo. El
almacenamiento clonal de germoplasma incluye el mantenimiento de
combinaciones especficas de genes (genotipos). Si una plntula sale de
almacenamiento con una combinacin gent:ca diferente, la validez del
mtodo de almacenamiento debe ser cuestionada. La habilidad para detectar
cambios genticos durante la propagacin y el mantenimiento dependen de los
mtodos usados para ello.

En muchas colecciones de germoplasma se evalan los genotipos almacenados

rutinariamente en base a las caiactersticas morfolgicas de las
plntulas cuando stas crecen bajo condiciones
controladas. Si las
plantas muestran caracteres morfolgicos diferentes, por ejemplo, la forma
de hoja, el color de las races reservantes, etc, es evidente que algn
cambio gentico ha ocurrido. Sin embargo, un cambio en un gen,
como por ejemplo, de resistencia a virus, no podra ser detectado
por observacin de cambios
morfolgicos.
Nuevos mtodos, como el anlisis del polimo~fismo por
restriccin (RFLP) estn siendo usados como vas ms
determinar cambios genticos. Es

fragmentos de

sensitivas para

importante que los bancos de germoplasma

programas de semillas usen los mtodos de mayor sensibilidad para

determinar la fidelidad gentica de sus sistemas de propagacin y
y

almacenamiento.
Hedios restrictivos del crecimiento. En muchos aos de investigacin,
se ha logrado el desarrollo de medios de propagacjn para batata
para
optimizar el crecimiento rpido
Pero en el caso
in vitro.
de la
conservacin, el
objetivo es
manteniendo la
viabilidad de

limitar
el los
cultivos.

crecimiento a un
mnimo, Por
este medio es
posible

maximizar el
tiempo entre transferencias (subcultivos) de las
plntulas in vitro. En el CIP, por ejemplo, las transferencias del
material de batata en conservacin se realizan una vez cada ao para la
mayora de clones y en algunos casos solo una vez cada ao y medio.
Los experimentos que se realizan en laboratorio, tendientes a limitar
el crecimiento in vitro de la batata, se basan en el uso de
retardantes hormonales
del crecimiento, por
ejemplo, el ABA
(cido abscisico), inhibidores del crecimiento como el B995, el cce
(cloruro de clorocolir.a),
o regul~dores osmticos, con la adicin de az6cares poco asimilables,
tales como el manitol o el sorbitol.
dificultad en este tipo de estudios es que diferentes genotipos
van a reaccionar en forma distinta bajo estas condiciones. Cuando una
coleccin de germoplasma
tiene que ser mantenida in vitro, el
objetivo de los estudios debe de ser
el
desarrollo de un
medio de conservacin suficientemente amplio para aplicarlo a un gran
n6mero de genotipos.
La

El medio de almacenamiento no debe permitir la induccin de callos

pues stos pueden producir alteraciones genticas.

Muchos medios de almacenamiento

CIP
actualmente,
6.

han sido reportados para batata. En el

se estA usando el medio descrito en el Apndice

Restricin de temperatura para almacenamiento. El grado de crecimiento

de plntulas in vitro pup.de ser restringido reduciendr.
de incubacin.
crecimiento

la temperatura

Una temperatura adecuada para lograr un buen

in vitro de la batata est entre 280C y

30oC si la

temperatura es de 80C, el tiempo de supervivencia es menos de un mes.

Para los genotipos estudiados hasta la fecha la temperatura ptima
sera de lSoC, pero sto necesita
confirmacin
.
Como en el caso de

otros cultivos

mantenidos in vitro, por ejemplo

yuca, papa, etc., es posible aplicar tanto la temperatura ms baja

como los retardantes de crecimiento al mismo tiempo.
El uso de estrs
osmtico y baja temperatura (lSoC) es por ahora la mejor y menos
costosa ~orma de mantener una cole~cin de germoplasma de batata.

6
Los medios

MEDIOS DE CULTIVO
de cultivo

utilizados

sales de Hurashige-Skoog
Kedio para introduccin

para

este

trabajo estn basados

(1962) y en las de Gambo~g

8-5 (1968).

in vi tro (HMB-I).

Pantotenato de calcio
Acido gibberlico

2
20

ppm

Acido ascrbico

100

ppm

Nitrato de calcio
Putrescina Hel
L-Arginina
Agua de coco
Sacarosa
Agar
Phytagel/Gelrite

100

ppm
ppm
ppm

20
100
1
5

ppm

%
%

0,7

0,25

Medio para transferencia de Meristemas o yelll (HMB-II).

Pantotenato de calcio
Acido gibberlico

2
15

ppm
ppm
ppm

Acido ascrbico

100

Nitrato de calcio
Putrescina aci

100
20

pprn

L-Arginina

100
5
0,7
0,25

ppm

Sacarosa
Agar
Phytagel/Gelrite

ppm
%
%
%

en las

Pantotenatc de calcio
Acido gibberlico
L-Arginina
Acido ascrbico
Putresdna BCl
Sacarosa
Agar

2
10
100
200
20
3

ppm
ppm
ppm
ppm
ppm
%

0,8

0,3

Glucosa

Sorbitol

Phytagel/Gelrite
Hedio para conservacin (HeB) .

Putrescina BCl
Phytagel/G lrite

Para todos los medios de cultivo se usa el pH

Nota:

Estos medios de cultivo se han

uniforme para una coleccin de
variedades.

ppm

20
0,4

5,8

elaborado para lograr un desarrollo

germoplasre con un gran nmero de

Si se trabaja con pocas variedades, es recomendable utilizar medios

de cultivo simples, como las sales de Hurashige y Skoog ms cido
gibberlico y sacarosa slamente.

REFERENCIAS

Alconero, R.; Santiago, A.C.; Morales, F., Rodrguez F. 1975.

Meristem tip culture and virus indexing of sweet potatoes.
Phytopathology. 65: 769772.
Folquer, F.
su

1978.

produccin
comercial.

La Batata (camote).

Estudio de la planta y

Editorial Hemisferio Sur S.A., Buenos

Aires. 145 p.

Frison, E.A. 1981. Tissue Cultu!:"(!: A tool

tor improvement and
internanatio~al exchange
of
root and tuber
tropical
crops. Research
International Institute of Tropical
Briefs. Vol. 2,
Agriculture
No. 1. 22 p.
Frison, E.A.; Ng, S.Y.
1981.
Tissue culture and
the distribution of disease-free
sweet
potato
material.
Annual Report.
Internati~nal Institute
of Tropical Agriculture, Nigeria. 74 - 75 p.
Gamborg, O.L.; Miller, R.A.;
Nutrlent requirements of
suspension cultures of soybean
root cells.
50: 151-158.

Ojima,

B.R.;

302-326.

In: Sharp, V.;

Evans, O.A.;

P. V.;

Yamada, Y.

culture.
p.

1968.

Experimental Cell
Research.

Henderson, J.H.M.; Phills,

1984. Sweet potato.
(eds.).

K.

Vhatley,

B.T.

Ammirato,

Handbook of plant cell

Macmillan Publishing Company, New York. 644

Kuo, G. 1985.
Handling of

sweet ~~!ato
germplasm.

Asian
Vegetable

Research and Oevelopement AVHDC 85-234. 2 p.

Center.

Kuo, G.;
Lin, S.;
Green, S.
1985.
Sweet potato germplasm for
international cooperations. International Cooperator's Guide. Asian
Vegetables Research and Development Center. AVRDC 85-238. 3 p.