LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN DIFERENSIAL
Senin, 3 Maret 2015
Kelompok IV
Senin, Pukul 13.00 16.00 WIB

Nama

NPM

Raissa Dwi A.

260110130155

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2015
Nilai

TTD

(Dhiya) (Emanuella) (Puspagita)

PEWARNAAN GRAM
1. Tujuan
Mengamati dua kelompok bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif,
dengan menggunakan prosedur pewarnaan Gram, memahami setiap
langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.
2. Prinsip
1) Teknik Aseptis
Teknik aseptis adalah proses tanpa kontaminasi untuk menjamin preparasi
bebas dari mikroba kontaminan. Teknik aseptic digunakan sepanjang
percobaan berlangsung baik alat, bahan, lingkungan sekitar maupun
praktikan. Untuk alat dan bahan dapat diterapkan metode sterilisasi.
2) Pewarnaan Diferensial
Pewarnaan Diferensial adalah teknik pewarnaan yang dilakukan untuk
mengetahui perebedaan antara sel-sel dari tiap-tiap mikroba. Pewarnaan
diferensial menggunakan dua pewarna atau lebih.
3) Ikatan Ion
Pewarnaan bakteri didasarkan atas adanya ikatan ion antara komponen
seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut
kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada
komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdsarkan adanya muatan ini
maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.
4) Absorpsi
Absorpsi atau penyerapan, dalam kimia, adalah suatu fenomena fisik atau
kimiawi atau suatu proses sewaktu atom, molekul, atau ion memasuki
suatu fase limbak (bulk) lain yang bisa berupa gas, cairan, ataupun
padatan.

3. Teori Dasar
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan
sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri berukuran sangat kecil
dan tipis sehingga sukar dilihat struktur tubuhnya walaupun dengan bantuan
mikroskop. Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau
membiaskan cahaya. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras
dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Alasan inilah yang
menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna
mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan
sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan
pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yng mengandung zat
pati dan granula fosfat (Entjang, 2003).
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan
gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini
diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark, Hans Christian Gram
(18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae (Lestari,
Rina, 2013).
Pewarnaan gram ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini
berdasarkan perbedaan struktur dinding sel, yaitu:
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan
warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative
tidak.
b. Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu
sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu
di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah

muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan
pada perbedaan struktur dinding sel bakteri
(Aditya,2010).
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat
diwarnai dengan safranin/fuchsin akan berwarna merah. Bakteri gram positif
memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan
dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh
alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).
Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi
terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu
dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

Zat warna utama (violet kristal)

Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan

warna utama.

Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang
digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.

Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali
sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
(Lestari, Rina, 2013).

Faktor-faktor lain yang dapat, menimbulkan keragaman pada reaksi Gram ialah :
1) Pelaksanaan fiksasi panas terhadap olesan
Olesan bakteri yang dipanaskan secara berlebihan akan menyebabkan pecahnya
dinding sel. Akibatnya sel Gram positif akan melepaskan pewarna primer dan
menerima pewarna landingan.
2) Kerapatan sel pada olesan.
Olesan yangterlalu tebal akan memucat lebih lama dari olesan dengan

kerapatan sel normal.

3) Konsentrasi dan umur reagen yang digunakan.
4) Sifat, konsentrasi dan jumlah pemucat yang dipakai.
Sebagai pemucat, alkohol 95% bekrja paling lambat dan aseton paling cepat.
Umumnya digunakan campuran alkohol 95% dan aseton (l : 1).
5) Sejarah biakan.
Sejarah biakan meliputi umur biakan serta pH medium tempat bakteri tumbuh.
Umumnya reaksi Gram menggunakan biakan berumur 18-24 jam. Biakan Gram
positif yang lebih tua (terutama bila sudah autolisis) dalam medium asam,
seringkali memberikan reaksi Gram positif atau Gram variabel (campuran Gram
positif dan Gram negatif). Hal tersebut diakibatkan perubahan permeabilitas
dinding sel pada biakan tua. Tetapi bakteri Gram negatif tidak terpengaruh oleh
umur atau medium yang digunakan. Jangan dipersoalkan teramatinya beberapa sel
Gram negatif dalam suatu preparat sel Gram positif
(Sulistianingsih. Milanda, Tiana, dkk.,2015).
4. Alat dan Bahan
4.1. Alat

Bak pewarna

Cawan petri

Kaca obyek

Kapas

Kertas saring

Mikroskop

Ose

Pembakar spirtus

Tabung Reaksi

4.2. Bahan

Alkohol

Aquadest

Fuchsin

Karbol gentian violet

Lugol

Metilen blue

Minyak emersi

Suspensi Bakteri

4.3. Gambar Alat

Cawan petri

Mikroskop

kaca obyek

ose

kapas

pembakar spiritus

kertas saring

Tabung Reaksi

5. Prosedur
Pertama, kaca obyek dibersihkan dengan alkohol lalu suspensi bakteri
dioleskan dengan ose pada bagian yang telah ditandai pada kaca obyek. Kaca
obyek difiksasi diatas spiritus. kaca obyek diletakkan di atas bak pewarna.

Kemudian, olesan bakteri dengan digenangi pewarna karbol gentian violet

(pewarna primer) selama 1 menit, lalu zat warna yang berlebih dibuang, dibilas
dengan air suling. Kedua, olesan digenangi dengan lugol selama 2 menit, lugol
dibuang yang berlebih lalu dibilas dengan air suling. Olessan dicuci dengan
pemucat alkohol 95% sebanyak satu tetes, lalu dibilas dengan air suling. Terakhir,
olesan digenangi dengan pewarna tandingan fuksin (sekunder) selama 30 detik,
warna yang berlebih dibuang dan dibilas dengan air suling lalu dikeringkan
dengan kertas saring. Kemudian, teleskan sedikit minyak emersi pada preparat.
Preparat dikeringkan dengan kertas saring, lalu minyak emersi dituangkan untuk
melihat preparat dengan mikroskop. Hasil diamati dan digambar.
6. Hasil Pengamatan

7. Pembahasan
Pada praktikum kali ini, dilakukan pewarnaan differensial, yaitu
pewarnaan gram. Pewarnaan gram dilakukan untuk mengamati kelompok bakteri
gram negatif dan gram positif. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya

lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada
membran sel bakteri. Kelompok bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi
menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki
dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif
mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel
Pertama, dilakukan pembuatan olesan bakteri dengan sampel suspensi.
Kaca obyek harus disterilisasi dengan alkohol hingga bersih serta bebas lemak
agar tidak ada kontaminan yang menggangu hasil pewarnaan. Suspensi bakteri
yang berada dalam tabung reaksi dikocok terlebih dahulu agar bakteri yang ada di
dalamnnya merata, lalu dioleskan secara merata menggunakan ose ke daerah yang
telah ditandai pada kaca obyek. Saat pengambilan sampel, ose harus disterilisasi
dengan cara dibakar hingga berpijar kemudian ditunggu hingga dingin di dekat
api. Begitu juga daerah atas tabung reaksi sebelum dan sesudah ditutup harus
difiksasi agar tidak terjadi kontaminasi ke dalam sampel. Kaca Obyek difiksasi
dengan dilewatkan diatas pembakar spiritus untuk melekatkan bakteri dengan
kaca obyek.
Kedua, proses pewarnaan gram dapat dimulai. Kaca obyek digenangi
dengan karbol gentian violet diatas bak pewarna dan ditunggu selama satu menit
agar pewarna dapat meresap dan melekat sempurna pada dinding sel. Karbol
gentian violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Reagen ini merupakan
pewarna primer (utama) yang akan memberikan warna pada bakteri target. Karbol
gentian violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme
yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang
transparan akan terlihat berwarna (ungu). Setelah itu, pewarna yang berlebih
dibuang ke dalam bak pewarna. Kaca obyek dibilas dengan aquadest secara
perlahan-lahan agar daerah olesan bakteri tidak ikut tercuci. pembilasan ini
bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan.
Kemudian, kaca obyek digenangi dengan lugol dan ditunggu selama dua menit.
Lugol merupakan Zat pemantek (mordant), yaitu pewarna yang berfungsi
memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau

mengintensifkan warna utama. Zat tersebut berfungsi untuk menambah gaya

gabung, dimana hasil reaksi antara sel dan zat warna diendapkan oleh pemantek
menjadi presipitat berbulir-bulir besar sehingga tidak mungkin keluar melalui
pori-pori dinding sel dan memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Lugol yang
diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh
bakteri menjadi semakin lebih kuat. Pewarna yang berlebih dibuang ke dalam bak
pewarna. Kaca obyek dibilas dengan aquadest secara perlahan-lahan.
Selanjutnya, alkohol 95% diteteskan di atas kaca obyek tersebut
kemudian didiamkan selama 10-30 detik. Setelah itu, kaca objek dibilas
dengan air hingga warnanya hilang. Alkohol 95% merupakan solven organik yang
berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada
sel bakteri. Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel,
bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci
sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar, maka
warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan
terjadinya dua kemungkinan yaitu bakteri akan tetap berwarna ungu atau bakteri
menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi
lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Kaca obyek kembali
dibilas lagi dengan aquadest. Selanjutnya kaca obyek digenangi oleh pewarna
sekunder (tandingan), yaitu fuchsin selama 30 detik. Pewarna ini berfungsi untuk
mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan
dengan alkohol. Pewarna fuchsin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel
menjadi berwarna merah (pink) pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri
gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pewarna
fuchsin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu. Dengan kata lain, safranin
memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa
cat atau pewarna. Kemudian, kaca obyek dibilas dengan aquadest dan dikeringkan
dengan kertas saring. Penggunaan kertas saring juga harus secara perlahan-lahan
agar daerah olesan bakteri tidak hilang terkikis oleh kertas saring. Lalu, ditetesi
minyak emersi agar objek yang diamati dapat terlihat lebih jelas. Minyak imersi

memiliki indeks refraksi yang tinggi dibandingkan dengan air atau udara sehingga
objek yang diamati dapat terlihat lebih jelas dibandingkan dengan tanpa minyak
imersi.
Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke
pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat
warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu
singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang
lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat.
Dari hasil pengamatan, didapatkan dua kelompok, yaitu bakteri gram
positif yang berbentuk bulat yang berkoloni dan berbentuk seperti buah anggur,
staphylococcus aureus dan gram negatif yang berbentuk batang, escherichia coli.
Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah
didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif
mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih
tinggi dan dinding selnya tipis. Bakteri gram positif menghasilkan warna ungu.
Bakteri ini akan mempertahankan pewarna primernya karena pewarna tersebut
akan terjerap ke dalam dinding sel dengan peptidoglikan yang tebal. Kompleks
zat lugol terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme
gram positif. Dinding sel yang tebal pada bakteri Gram positif akan menyusut
oleh pembilasan alkohol (terdehidrasi), sehingga pori-pori dinding sel menutup
dan mencegah larutnya kompleks pewarna primer pada saat pemucatan.
Sedangkan, bakteri gram negatif tidak dapat mempertahankan pewarna primernya
sehingga akan menghasilkan warna dari pewarna tandingannya, yaitu merah
(pink). Dinding sel Gram negatif mengandung banyak lipid, yang pada umumnya
larut dalam alkohol. Larutnya lipid akan memperbesar pori-pori dinding sel dan
menyebabkan proses pemucatan berlangsung lebih cepat sehingga pewarna primer
tidak terjerap ke dalam sel dan tercuci oleh alkohol.
Beberapa faktor kesalahan pada praktikum yang menyebabkan sulitnya
mengamati preparat olesan bakteri dengan mikroskop antara lain pemberian zat

warna yang berlebihan sehingga sel bakteri tidak tampak, kurang maksimalnya
dalam proses fiksasi sehingga masih ada bakteri yang belum mati, dan faktor yang
lain adalah pada proses pencucian terlalu deras dalam membilas zat warna dengan
air sehingga dapat menyebabkan bakteri larut terbawa air.
8. Kesimpulan
Dapat dipahami proses pewarnaan gram dan diamati dua kelompok
bakteri, yaitu bakteri gram positif yang berbentuk bulat yang berkoloni berbentuk
seperti buah anggur dan berwarna ungu adalah staphylococcus aureus dan gram
negatif yang berbentuk batang dan berwarna merah (pink) adalah escherichia coli.

Daftar Pustaka
Aditya.2010. Teknik Pewarnaan Bakteri. Tersedia online di
http://mushoffaditya.co.id/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html (diakses 7
Maret 2015).
Entjang, I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi untuk Akademi Keperawatan.
Bandung: Citra Aditya Bakti
Fitria. 2009. Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram
Negatif). Tersedia inline di http://biobakteri.co.id/2009/06/07/7-pewarnaan-gramgram-positif-dan-gram-negatif (diakses 7 Maret 2015).
Lestari, Rina.2013. Pewarnaan Sederhana, Negatif, Kapsul dan Gram, tersedia
online di http://rinayarina.pun.bz/files/mikrobiologi-pewarnaan.pdf (diakses 7
Maret 2015).
Sulistianingsih. Milanda, Tiana, dkk.2015. PENUNTUN PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI DASAR. Jatinangor: Fakultas Farmasi UNPAD