Diagnostico microbiolgico:

Herramienta fundamental para

garantizar la inocuidad de los
alimentos
Lina Carolina Cruz Martnez
Microbiloga Industrial MSc. - Especialista en Bioprocesos
Miembro de la Asociacin de Microbilogos Javerianos

Industria de alimentos
OBJETIVO: PRODUCIR CON CALIDAD Y MEJORAR
COMPETITIVIDAD/RENTABILIDAD

En Colombia es uno de los sectores de la economa ms

prometedores: inversin para convertir el sector en
competitivo y de talla mundial
Posee importante tradicin en sanidad e inocuidad - responde
a exigencias del mercado y ofrece calidad

Mercado internacional - altamente exigente a la hora de

adquirir/importar productos alimenticios
Cumplimiento de estndares internacionales en sanidad:
presentan algunas dificultades

Requiere profesionales preparados y competentes con sentido

de responsabilidad social

Inocuidad
Segn el Diccionario de la Real Academia de la Lengua
Espaola 22. Edicin:
Inocuo (Del latn Innocus) - Que no hace dao
Inocuidad: Cualidad de inocuo
Segn el Codex Alimentarius (FAO y OMS):

Inocuidad es la condicin que garantiza que un alimento no

causar dao al consumidor cuando el mismo sea preparado
y/o ingerido de acuerdo con el uso a que se destine

Consecuencias de la falta de inocuidad

en los alimentos
Riesgo para la salud de consumidores
Costos de atencin mdica (individual/gubernamental)
Prdidas de productividad
Retencin, rechazo y destruccin

 Prdidas y costos econmicos

Prdidas comerciales

Efectos negativos sobre la empresa productora

La inocuidad tiene gran importancia para el
consumidor mundial -cultura del cuidado- que hoy se
toma el mercado y exige a las empresas de la industria
de alimentos perfeccionarse en este aspecto

Componentes
para asegurar la
calidad e
inocuidad de los
alimentos

Aspectos relacionados con la

inocuidad
Legislacin
Nacional

Autoridades de vigilancia y
control
Aplicacin voluntaria

Comisin del
Codex Alimentarius

Tratados
Internacionales
OMC - OMS

Microbiologa
Derivada de 3 palabras griegas:

- Mikros (pequeo)
- Bios (vida)
- Logos (ciencia)
Conjuntamente significan el estudio de la vida microscpica:
estudio de los microorganismos
Ciencia biolgica bsica: alternativa para explicar fenmenos
relacionados con la existencia de los microorganismos

Surge ante la necesidad de resolver problemas prcticos en

diversos campos
Disponibilidad de herramientas verstiles, tcnicas y
procedimientos:
- Responder a las necesidades y exigencias de la sociedad
- Desarrollo, implementacin y validacin de procesos y/o
resultados
- Produccin de bienes y servicios

Procesos industriales basados en microorganismos: desarrollo

de la Biotecnologa

Microorganismos
Diminutos seres vivos
Se encuentran en todas partes
Bacterias, hongos, virus, protozoos y algas microscpicas
Desempean papeles imprescindibles para el desarrollo de
la vida en el planeta
- Ciclos biogeoqumicos de los elementos (C, N)
Amplias aplicaciones en el terreno industrial

Usados en:

Sntesis de productos qumicos (alcoholes, cidos orgnicos,

enzimas, antibiticos y frmacos)
Produccin de alimentos por procesos de fermentacin
Bebidas alcohlicas: cerveza, vino, jerez
Productos lcteos: yogurt, queso, mantequilla
Panadera: pan, tortas, bizcochos
Conservacin de alimentos: encurtidos, embutidos - vinagre

Para qu microbiologa?
Innovacin y desarrollo de
productos de base biotecnolgica:
Alimentos funcionales - probiticos y prebiticos

Empaques y envases
materiales biodegradables

de

alimentos

biopolmeros,

Otros productos: protena unicelular, pigmentos (clorofila

a), antioxidantes, vitaminas, minerales

Microbiologa de Alimentos
Engloba aspectos de ecologa microbiana y de biotecnologa
para la produccin
Importante en el desarrollo y solucin de problemas en la
industria de alimentos
Diseo e implementacin de estrategias de control
microbiolgico y aseguramiento de la calidad, de materias
primas, procesos y producto terminado

Control microbiolgico
Procedimiento
realizado
para
alcanzar
la
calidad
microbiolgica de los alimentos, aplicado en forma de etapas
ordenadas a travs de la cadena de produccin
Control de la presencia y
microorganismos en los alimentos

multiplicacin

de

los

Objetivo:
Garantizar al consumidor un abastecimiento de productos
salubres e inocuos y evitar el deterioro microbiolgico de los
mismos

En dnde:
Control del procesado del producto
Control de las materias primas y producto finales para
asegurar que cumplen las normas o estndares establecidos
Control de la higiene de la lnea de procesado
Para qu:
Inocuidad
Aceptabilidad/vida comercial
Estabilidad

Diagnstico microbiolgico
Ofrece directrices sobre establecimiento y aplicacin de
criterios microbiolgicos a los alimentos en cualquier punto de
la cadena alimentaria
Concepto de Inocuidad de los alimentos:
Control en el punto de origen
Control de la planificacin y formulacin del producto
Implementacin de sistemas que garantizan inocuidad y
calidad de los productos: BPM, HACCP, ISO 22000

Estudio realizado por Strategic Consulting Incs (2003):

Importancia del anlisis microbiolgico en el sector alimentario
mundial
Total de ensayos microbiolgicos realizados en el mundo ao
2003: 1136,5 millones
Industria alimentaria: 558,1 millones
Industria farmacutica: 206,9 millones
Cosmtica:194,3 millones
Bebidas: 102,4 millones
Medio ambiente: 44,8 millones
Otros sectores industriales: 30 millones

Componentes de
microbiolgico:

un

diagnstico

Muestreo
Planes o programas de muestreo - muestras estadsticamente
significativas
Mtodo Analtico
Sensibilidad de la tcnica - deteccin adecuada, tambin que
sea econmico
Interpretacin de resultados
Comparacin con criterios establecidos/normas internacionales

A travs del diagnostico microbiolgico se puede

realizar:
Estimacin del nmero total de microorganismos

Estimacin del nmero de microorganismos indicadores

Estimacin del nmero de microorganismos alterantes
Estimacin del nmero de patgenos especficos

Anlisis de productos metablicos de los microorganismos

Ej.: Toxinas

Tipos de diagnostico microbiolgico

Mtodos cuantitativos
Recuento de microorganismos
Determina el nmero de microorganismos presentes en una
cantidad dada del alimento

Mtodos cualitativos
Deteccin de microorganismos
Determina la presencia o ausencia de microorganismos en una
cantidad dada del alimento

Algunos mtodos empleados son:

Mtodos directos
Recuento en placa: siembra en superficie, siembra en
inclusin, filtracin de membrana
Mtodo de gotitas de agar
Tcnica del nmero ms probable NMP

Recuento microscpico con cmara de recuento

Recuento electrnico

Mtodos indirectos
Determinacin de peso seco

Medidas turbidimtricas
Determinacin de ATP
Determinacin de algn componente celular

Puede utilizarse para:

Formular requisitos de diseo e indicar el estado requerido

de materias primas, ingredientes y productos terminados en
cualquier fase de la cadena alimentaria

Ser aplicado por Organismos de control y vigilancia, por los

empresarios para definir aceptabilidad e inaceptabilidad de
materias primas, ingredientes, productos, lotes, etc.

 Determinar si los procesos se ajustan a los Principios

Generales de Higiene de los Alimentos establecidos por el
Codex Alimentarius

Comprobar la eficacia de los sistemas basados en el sistema

de HACCP y de las buenas prcticas de higiene BPM

Ventajas
Mejor utilizacin del dinero y de la mano de obra:
rentabilidad para las empresas
Enfoque preventivo - mayor control en la cadena
productiva: prevenir es siempre ms barato que corregir
Estimulo para generar confianza en el consumidor
seguridad en el producto

Aumentar el nivel de proteccin que se ofrece al

consumidor

Aseguramiento de
la calidad e
inocuidad

Buenas Prcticas
de Manufactura

Principios
Generales de
Higiene de
Alimentos Codex
Alimentarius

Sistema de
Anlisis de
Riesgos y de
Puntos Crticos de
Control

Rentabilidad de la calidad

Fuente: Nestl, 2001

Innovacin tecnolgica en diagnostico

microbiolgico
Mtodos microbiolgicos convencionales - empleados en
numerosos laboratorios de todo el mundo y establecidos en
muchos casos como mtodos estndares de anlisis
microbiolgico de los alimentos
Desventajas:
Laboriosos
Emplean grandes volmenes de medios de cultivo
Requieren un tiempo considerable para la obtencin y el
anlisis de los resultados

Mtodos rpidos y automatizacin

Desarrollo de estos mtodos para deteccin, aislamiento,
identificacin y enumeracin de microorganismos (y/o sus
metabolitos) relacionados con la alteracin y seguridad de los
alimentos - rea de la microbiologa aplicada con una
importancia en aumento
Tiempo reducido para obtencin de resultados
Fciles de usar
Precisos
Econmicamente rentables - menor gasto de material y
equilibrio costo - beneficio

1965-1975: Desarrollo de sistemas de miniaturizacin tcnicas

microbiolgicas convencionales y aparicin de primeros kits
diagnsticos
1975-1985: Desarrollo de tcnicas inmunolgicas
1985-1995: Desarrollo de tcnicas genticas - PCR (reaccin
en cadena de la polimerasa)
1995-Actualidad: Desarrollo de biosensores, microarreglos,
etc.
Respuesta a las necesidades que generaron en su momento el
proyecto del genoma humano, as como el desarrollo de la
protemica y de otros campos relacionados

Avances realizados en el desarrollo de mtodos

rpidos y automatizados aplicados al anlisis
microbiolgico de los alimentos
Estas aplicaciones se han dividido en seis grupos que
incluyen:

Recuento de clulas viables

Sistemas miniaturizados y kits de diagnstico
Medicin de biomasa microbiana
Tcnicas inmunolgicas
Tcnicas genticas
Otros avances

Avances en los recuentos de clulas

viables
Parmetro importante en el control de calidad:
Recuento de clulas viables en alimentos, superficies y aire
dentro de las industrias alimentarias
Mtodo estndar de recuento en placa
Principal ventaja: Mtodo sencillo
Limitaciones:
Volumen considerable de material, medio de cultivo, espacio
para almacenamiento e incubacin de las placas de cultivo,
necesidad de repeticiones para validacin del procedimiento

Sistemas de siembra en espiral: Iso-Grid, Petrifilm, Redigel,

SimPlate
Automatizacin del mtodo del Nmero Ms Probable
(NMP)
Sistemas de recuento en tiempo real: Citometra de flujo,
Epifluorescencia directa sobre filtro
Ventajas:
Permiten simplificar el proceso
Mayor rapidez en obtencin de resultados - ahorro tiempo
Equilibrio costo - beneficio
Poco gasto de material - Fcil de realizar
Minimizan errores de procedimiento - automatizacin

Avances en sistemas miniaturizados y

kits de diagnstico
Concepto de placa microtituladora (96 pocillos, formato 8x12)
Desarrollo algunos medios de cultivo selectivos
Metabolismo de sustratos especficos
Deteccin por sistemas indicadores

Ventajas:
Reduccin de volumen de reactivos y medio a emplear en
los ensayos
Rapidez en la obtencin de resultados
Posibilidad de lectura e interpretacin de resultados de
manera automatizada

 Tarjetas desechables para identificacin sencilla de colonias

sospechosas - pruebas bioqumicas rpidas: OBIS
Galeras para identificacin de ms de 800 especies de
bacterias y levaduras: sistema API
Tubos de plstico de compartimentos con agar de distintos
sustratos: BBL Enterotube y Oxi/Ferm Tube
Soportes plsticos con sustratos cromognicos
fluorognicos: BBL Crystal, RapID systems y MicroID

y/o

Cambios de color en sustratos y/o produccin de gas de

cultivos inoculados: sistema VITEK

 Sistema Biolog - detecta la capacidad

microorganismos para oxidar 95 fuentes de carbono

de

los

Automatizacin del mtodo del Nmero Ms Probable

(NMP): uso de tarjetas de material plstico - medios de cultivo
con indicadores fluorescentes
Principal ventaja:
Disminuye considerablemente la necesidad de reactivos,
espacio y tiempo con respecto al mtodo del NMP
convencional

Avances en los equipos de medida de

biomasa microbiana
Instrumentacin necesaria para detectar seales relacionadas
con el crecimiento microbiano
Debe ser establecida la correlacin entre estos parmetros y el
recuento estndar de clulas viables
Bioluminiscencia o medida del ATP - monitorizacin de la
higiene de superficies

Impedimetra - degradacin metablica de sustratos o

nutrientes

 Turbidimetra o nefelometra - fundamento del Automicrobic

system - emplea medios selectivos y un sistema ptico para
deteccin e identificacin de Enterobacterias en solo 12 horas
Especies del gnero Bacillus se pueden identificar con este
equipo en 24 horas
BioSys - equipo automatizado que registra cambios de color
en el medio - crecimiento de los microorganismos
Otros equipos automatizados
Deteccin colorimtrica del CO2 producido

Avances en la automatizacin de
tcnicas inmunolgicas
Procedimientos analticos basados en la visualizacin objetiva
de la interaccin entre un antgeno y su correspondiente
anticuerpo
Ventajas:
Sensibilidad
Especificidad
Rapidez
Bajo costo

 Tcnica inmunoenzimtica de ELISA

Immunosorbent Assay) y sus variaciones

(Enzyme

Linked

Kits de ELISA para la deteccin en los alimentos de

microorganismos patgenos y/o sus toxinas o metabolitos
Kit Assurance EIA para la deteccin de Salmonella, Listeria,
E. coli O157:H7 y Campylobacter en alimentos y muestras
ambientales

Automatizacin completa del proceso: sistema VIDAs completa la reaccin de ELISA entre 45 minutos y 2 horas
dependiendo del microorganismo diana o toxina que se
pretenda detectar

Limitacin:
Necesidad de enriquecimiento previo de la muestra para
facilitar multiplicacin del microorganismo - proceso de
inmunocaptura previa
Solucin:
Separacin inmunomagntica - permite reducir el tiempo
requerido para el enriquecimiento de la muestra
Comercializacin partculas metlicas que llevan fijados
anticuerpos especficos de Listeria
Bolas magnticas con anticuerpos especficos de E. coli
O157:H7, Listeria, Cryptosporidium, Giardia, etc.

Avances en la automatizacin de
tcnicas genticas
Deteccin de caractersticas celulares mucho ms estables
contenidas en los cidos nucleicos

Hibridacin de cidos nucleicos con sondas genticas

conocidas (oligonucletidos sintticos) - deteccin de
patgenos como Salmonella, Listeria, Campylobacter y E. coli
0157:H7
Sondas marcadas con enzimas y diseadas para hibridar en el
ARN ribosmico de los microorganismos diana - adaptacin
del sistema a placas de pocillos para mejor automatizacin del
ensayo

 Tcnica de PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa) amplificacin ADN de microorganismos

Ventajas:
Existen alternativas a la utilizacin del bromuro de etidio tincin con SYBR Safe DNA gel Stain (menor toxicidad)
Utilizacin de polimerasas termoestables y diseo de
termocicladores - completa automatizacin

Empleo rutinario - disponibilidad de cebadores especficos

Reduccin tiempo necesario para obtener resultados

Otros sistemas
Biosensores
Dispositivo compacto de anlisis integrado por un elemento de
reconocimiento biolgico (enzima, orgnulo, tejido, clula,
anticuerpo o cido nucleico) o biomimtico (polmeros de
impresin molecular)
Ventajas:
Alta especificidad
Sensibilidad
Fiabilidad y capacidad de anlisis mltiples
Fcil automatizacin
Capacidad para trabajar en tiempo real

Microarreglos
Pequeos dispositivos innovadores recientemente aplicados a
la deteccin e identificacin microbianas
Contienen de forma ordenada una coleccin de molculas
biolgicas (cidos nuclicos, protenas, anticuerpos o tejidos),
ordenadas en dos dimensiones e inmovilizadas sobre un
soporte slido
Principales usos:
Control de calidad y seguridad microbiolgica de los alimentos
Identificacin de bacterias patgenas entricas FDA
Investigacin biotecnolgica / Ingeniera gentica

Microbiologa Predictiva
rea de la microbiologa de los alimentos que permite predecir
las respuestas microbianas (crecimiento, muerte, inactivacin)
frente a diferentes factores y condiciones de los alimentos

La obtencin de predicciones es posible gracias al desarrollo

de modelos matemticos que relacionan respuestas
microbianas y factores/condiciones ambientales
Ejemplo:
Establecimiento de la vida comercial de productos alimenticios

Campo prometedor dentro de la microbiologa de los alimentos

a una exigencia en el control de calidad y seguridad
alimentaria - modelos predictivos
Importancia
como
herramienta
en
microbiolgico - rea multidisciplinaria

el

diagnstico

Empleo en sistemas HACCP prevencin de riesgos:

biolgicos, fsicos, qumicos
Desarrollo de nuevos productos

Prevencin
de ETAS

Reduccin
de gastos
en anlisis

Aseguramiento
de la calidad
ms eficaz

Proteccin
del
Mercado

Reduccin
de
prdidas

Perspectivas
Los mtodos rpidos y automatizados en Microbiologa de los
alimentos representan un rea de la microbiologa aplicada en
continua expansin
Es previsible que se desarrollen nuevos mtodos para la
identificacin rpida de virus y parsitos implicados en la
transmisin de enfermedades a travs de los alimentos
Desarrollo de envases inteligentes que alerten a los
consumidores sobre la presencia de microorganismos
alterantes o patgenos en los alimentos

El tiempo ahorrado mediante el empleo de estos mtodos

puede utilizarse para otras tareas:
Revisin del plan HACCP
Ampliar planes de control de patgenos y de anlisis
qumicos (micotoxinas, antibiticos, alrgenos, etc.)
Capacitacin de personal
La rapidez es fundamental en un programa de HACCP exitoso,
ya que permite la aplicacin de acciones correctoras durante el
procesado de los alimentos
Futuro prximo - incremento del uso de los biosensores en la
industria alimentaria y de los microchips para la deteccin
simultnea de varios patgenos

Muchas gracias!!