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TRANSFORMAO

DE CLOROPLASTOS
QUAIS AS VANTAGENS EM SE MODIFICAR ESTA ORGANELA?

Helaine Carrer
Pesquisadora do Centro de
Biotecnologia Agrcola (CEBTEC)
Professora doutora do
Departamento de Qumica,
ESALQ/USP

Foto cedida pelos autores.

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Cloroplastos so organelas
intracelulares presentes em algas e plantas, responsveis pelo processo
fotossinttico, desde a captao da energia luminosa at a formao de compostos orgnicos, participando tambm da
assimilao do nitrognio, na sntese e
armazenamento de amido e na
biossntese de aminocidos e lipdios. A
estrutura desse centro fotossintetizador
est representada na figura 1, onde se
pode observar a presena da membrana
dupla, a qual caracterstica da organela
que se originou atravs do processo
endossimbitico de integrao de uma

diviso celular, quando somente um


nucleide transferido para a clulafilha. O DNA encontrado em trs compartimentos numa clula: no ncleo, nos
cloroplastos e na mitocndria. O ncleo
o local mais comum para estudos de
engenharia gentica de plantas com o
objetivo de introduzir caractersticas agronmicas desejveis. Modificao no
genoma de cloroplasto j uma realidade enquanto que a mitocndria de plantas permanece sem uma tecnologia de
transformao. Entretanto, modificaes
genticas nas mitocndrias da alga
Chlamydomonas e da levedura S.

seqenciado por Sugiura et al. em 1986


(EMBO J. 5: 2043-2049). Atualmente esse
genoma tambm foi seqenciado em
outras espcies vegetais: arroz, milho,
Arabidopsis, Pinus e as algas
fotossintetizantes Chlamydomonas e
Euglena. O seqenciamento do genoma
tem importncia fundamental para o conhecimento dos genes que participam
dos caminhos metablicos, no estudo da
interao dos genes nucleares que se
expressam nos cloroplastos e apresenta
fundamentos para anlise do sistema
evolutivo da organela nos vegetais. Em
plantas superiores, como o tabaco, o

cianobactria em uma clula eucarionte,


dando origem ao cloroplasto (Gray, 1993.
Curr. Opinion Genet Dev. 3: 884-890). H
tambm membranas dos tilacides e grana, e regies denominadas nucleides
que se localizam no estroma e onde se
encontram as cpias do genoma do
cloroplasto (ptDNA). Esta regio no
delimitada por uma membrana, existindo a presena de protenas que mantm
algumas cpias do genoma agregadas.
De certa forma, a presena de cpias do
genoma nos nucleides facilita o processo de transformao do cloroplasto
durante a desdiferenciao celular na

cerevisae j foram obtidas, acreditandose que num futuro prximo, esta organela
tambm ser alvo de transformao gentica em plantas superiores.

genoma codifica em torno de 120 genes,


um nmero pequeno quando comparado com o genoma da cianobactria.
Existem pelo menos de 500 a 1.000 genes
nucleares que se expressam nos
cloroplastos aps sntese pr-protica
nos ribossomos do citoplasma. Dos genes
codificados no plastdio, em torno de 50
esto envolvidos na transcrio dos genes
plastidiais como: rRNA, tRNAs, genes de
protenas ribossomais e gene da RNA
polimerase. Os genes relacionados com
o metabolismo vegetal so aproximadamente 40 e formam complexos com
genes nucleares, codificando compo-

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Estrutura do genoma de cloroplastos


O genoma do cloroplasto circular,
o tamanho varia entre 120 a 180kb,
apresentando uma regio duplicada com
orientao invertida na maioria das espcies vegetais. A figura 2 mostra o
genoma de cloroplasto de tabaco
(Nicotiana tabacum), o qual possui
155.884 pares de bases e foi totalmente

nentes do sistema fotossinttico, os quais


compreendem os genes da enzima
Rubisco
(ribulose-1,5-bifosfato
carboxilase/oxidase), que a principal
protena do cloroplasto; genes participantes do complexo do fotossistema I e
II; do citocromo b/f e da enzima ATP
sintase e NADH desidrogenase. Nas
dicotiledneas, o gene accD codifica
uma subunidade da acetil-CoA
carboxilase, enzima participante da
biossntese de lipdios, porm no est
presente nas monocotiledneas
seqenciadas at o momento. Este
genoma tambm possui genes que codificam tRNA envolvidos na biossntese de
clorofilas, processo metablico especfico para cloroplastos e cianobactrias.
Alm destes genes com funes conhecidas, existem seqncias de quadros de
leitura (ORFs) com potencial para serem
genes cujas funes ainda no foram
identificadas. Embora as cpias do

organela. O sucesso obtido com a transformao de cloroplastos exigiu: 1) desenvolvimento de um mtodo de introduo
dos
transgenes
(DNA
transformante) atravs da membrana
dupla do cloroplasto; 2) disponibilidade
de genes marcadores seletivos com expresso na organela e 3) eficiente escolha do local de integrao do transgene
para no interferir com a funo normal
dos genes no genoma. Essa transformao foi obtida primeiramente em
Chlamydomonas reinhardtii, uma alga
unicelular, por Boyton et al., 1988
(Science 240: 1534-1538), e em plantas
superiores a transformao foi obtida
em tabaco (Nicotiana tabacum) por Svab
et al. 1990 (PNAS 87: 8526-8530). Sistema
de liberao do transgene no cloroplasto:
Atravs do sistema de biolstica (biologia
+ balstica) desenvolvido por Klein et al.,
1987 (Nature 327: 70-73) foi possvel
introduzir transgenes no interior dos

bombardeadas, as clulas so mantidas


em meio de crescimento sem agente
seletivo por dois dias para
restabelecimento da diviso celular, sendo em seguida cortadas em pequenos
segmentos e transferidas para meio de
cultura contendo o agente seletivo. Aps
5 a 6 semanas observam-se as brotaes
de novas plantas regeneradas a partir de
uma nica clula que possivelmente recebeu o transgene no cloroplasto. Esta
planta colocada em meio de
enraizamento e analisada atravs de tcnicas de biologia celular, como PCR
(Polymerase Chain Reaction) ou anlise
de Southern para verificar a integrao
do transgene no genoma do cloroplasto.
Para que as plantas transformadas sejam
geneticamente estveis, necessrio que
todas as cpias do genoma sejam uniformemente transformadas. Uma planta primria (primeira brotao) em geral encontra-se na fase heteroplsmica, quan-

genoma sejam idnticas dentro de uma


espcie, o nmero de cloroplastos e do
ptDNA dependente do tipo de clula
vegetal. Nas clulas meristemticas encontra-se a forma indiferenciada chamada proplastdio, em nmero de 10 a 15,
possuindo no mximo 50 cpias do
ptDNA. Por sua vez, a clula foliar possui
os proplastdios diferenciados em
cloroplastos,
os
quais
so
fotossinteticamente ativos encontrados
em nmero de aproximadamente 100,
sendo que h em mdia 100 cpias do
ptDNA, determina-se um total de aproximadamente 10.000 cpias do genoma
por clula (Maliga et al. 1993. Phil. Trans.
R. Soc. Lond. B 341, 449-454).

cloroplastos. Outro mtodo que demonstrou resultados positivos foi descrito por
Golds et al., 1994 (Biotechnology 11: 9597) e O'Neill et al., 1993 ( Plant J. 3: 729738), utilizando tratamento com PEG
(polietileno glicol), mas a eficincia de
transformao menor comparando-se
com o mtodo de biolstica. A utilizao
de Agrobacterium vem sendo objeto de
estudo em muitos laboratrios sem resultado satisfatrio at o momento. O
protocolo de transformao de
cloroplasto de tabaco est apresentado
na figura 3. A metodologia consiste em
introduzir o transgene no interior dos
cloroplastos atravs de biolstica. Cpias
do transgene ficam aderidas s partculas de ouro ou tungstnio de aproximadamente 1mm em tamanho, elas so
aceleradas pelo gs de hlio em alta
presso em cmara de vcuo, so
introduzidas no cloroplasto onde liberam o DNA. Inicialmente, somente uma
ou poucas cpias do genoma so alteradas entre as 10.000 cpias presentes nas
clulas do mesfilo foliar. Aps serem

do as cpias do ptDNA no se apresentam uniformemente modificadas. Para


que se torne uma planta transgnica
homoplsmica, a qual possui todas as
cpias do ptDNA uniformemente transformadas, so necessrias 3 a 4
subculturas transferindo pequenas sees da folha da planta primria em
meio seletivo. Durante a subcultura, as
clulas que no possurem os transgenes
no se dividem, e se tornam clorticas.
As que possuem o transgene se dividem
e voltam ao estado desdiferenciado, o
qual possui somente um nucleide com
2 a 10 ptDNA. A partir do sistema de
recombinao obtm-se a uniformidade
das cpias do ptDNAs, monitorando-se
atravs de PCR. Seleo dos
transformantes: O primeiro gene
marcador seletivo expresso em
cloroplasto de Chlamydomonas e tabaco
foi um gene plastidial alelo ribossomal
mutante do gene 16S rRNA. Mutaes de
algumas bases na seqncia desse gene
resultam na resistncia a inibidores da
sntese de protena de procariotos, como

Transformao de
cloroplastos
Atravs do desenvolvimento da
tecnologia de manipulao de genes de
cloroplastos in vivo criou-se uma nova
ferramenta para estudar os aspectos da
biologia celular e molecular desta

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os antibiticos espectinomicina,
estreptomicina e lincomicina. Entretanto, a freqncia de transformao de
cloroplastos utilizando este gene
marcador seletivo foi muito baixa, em
mdia entre 0.5 a 2 transformantes para
cada 100 bombardeamentos (Svab e
Maliga, 1991. Mol. Gen. Gen. 228: 316319; Staub e Maliga, 1993. EMBO J. 12:
601-606). Existe sempre a necessidade
de identificao de genes marcadores
seletivos para facilitar a introduo dos
transgenes com alta eficincia de seleo. Os genes bacterianos: aadA (Svab e
Maliga, 1993. PNAS 90: 913-917) e nptII
(Carrer et al., 1993. Mol Gen Gen 241: 4956) conferem resistncia aos antibiticos
espectinomicina e canamicina, respectivamente. Estes genes utilizados como
marcadores seletivos apresentaram melhores resultados na eficincia de transformao, em torno de 2 a 10
transformantes por bombardeamento,
sendo que o gene nptII apresentou menor freqncia de transformao e tambm expresso nuclear. O gene de planta
que confere resistncia aos herbicidas
inibidores da enzima acetolactato sintase
(ALS) foi testado para utilizao como
marcador seletivo (Carrer e Maliga, resultados no publicados). Recombinao
homloga: A integrao de um transgene
no genoma de cloroplasto ocorre atravs
de recombinao homloga, como demonstrado na figura 4. Para tanto, na
construo de um vetor de transformao, seqncias do ptDNA devem
flanquear o gene de interesse, indo desta
forma o transgene para o local de insero no genoma. Quando o local de
insero a regio duplicada invertida
do cloroplasto, existe a necessidade de
"correo" da segunda cpia, podendo,
ento, ocorrer a correo para a forma
original ou transformada. O transgene
expresso no cloroplasto sob controle de
um promotor procaritico, o qual possui
os sinais de expresso na organela.
Aplicaes da tecnologia de
transformao
At o momento, o tabaco tem sido a
nica planta superior a ter o cloroplasto
transformado, sendo utilizada como planta-modelo. Existe vrias vantagens em se
expressar os transgenes nessa organela
do que no genoma nuclear. Herana
materna: Anlise de plantas variegadas
revelou que os cloroplastos no apresentam segregao mendeliana, apresentando herana maternal dos genes
devido ao fato de no serem transmitidos pelo plen. Isto observado na
maioria das espcies de plantas cultiva-

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das, como milho, arroz, trigo, algodo,


feijo e outras. A figura 5 mostra sementes de tabaco de plantas transgnicas
(transplastmicas) contendo o gene nptII
germinadas em meio de seleo em presena de canamicina (200mg/ml). As
sementes de planta autopolinizada (Self)
e de F1, planta transgnica (feminino)
fertilizada pelo plen da planta-controle
(masculino), apresentam-se todas resistentes canamicina, enquanto as sementes provindas de retrocruzamento (RF),
em que a planta-controle (feminino)
fertilizada pelo plen da planta transformada (masculino), apresentavam-se totalmente sensveis ao antibitico. Utilizando esta caracterstica, quando um
gene de resistncia a herbicida, por exemplo, for introduzido no cloroplasto de
uma planta de interesse comercial, podese garantir que no vai ocorrer disseminao deste gene de resistncia para as
espcies relacionadas no campo. Temse, assim, a possibilidade de controle da
disseminao de transgenes no ambiente. Alta expresso de protenas: Sendo o
sistema gentico de cloroplastos altamente poliplide, os transgenes so amplificados para um grande nmero de
cpias. A introduo do transgene sob
corretos sinais de controle da traduo
leva a protena a ser expressa em alta
concentrao. Este potencial de alta expresso de protena em cloroplastos foi
demonstrado por McBride et al., 1995
(Biotechnology 13: 362-365). Os autores
introduziram um gene modificado do
Bacillus thuringiensis em cloroplastos
via biolstica e verificaram o acmulo da
protoxina com ao inseticida ao nvel
de 3 a 5% da protena solvel total. Tal
nvel de expresso no poderia ser conseguido utilizando-se o mesmo gene no
ncleo. A figura 6 apresenta o resultado
do efeito txico da protoxina nas folhas
de tabaco transformadas para as larvas
do inseto Spodoptera exigua. Efeito de
local de integrao do gene: Na transformao nuclear um mesmo transgene
poder apresentar diferentes nveis de
expresso, dependendo do local de
integrao no genoma. Em contraste, a
integrao do transgene no genoma de
cloroplasto ocorre em local especfico,
produzindo somente um nico evento
de integrao, devido transformao
no cloroplasto ocorrer atravs de
recombinao homloga. Desta forma,
fica eliminada a necessidade de se caracterizar um grande nmero de plantas
transformadas independentemente. Utilizando esta particularidade, genes de
cloroplastos podem ser trocados pelo
mesmo gene mutado in vitro para estudo
da funo destes genes. O gene ycf3

(hypothetical chloroplast reading frame


N3) est relacionado ao fotossistema I,
o que auxiliou nas elucidaes de questes fundamentais da biologia de
cloroplastos, incluindo tambm os mecanismo de regulao dos genes (Ruf et
al., 1997, J. Cell Biol 139, 95-102). Ausncia de co-supresso: Integrao de vrias cpias de um gene ou de um segmento do gene pode resultar em co-supresso, termo que se refere inativao
no-intencional do gene nuclear, devido
interferncia entre os transgenes ou
entre um transgene e um gene nativo.
Como o sistema gentico dos cloroplastos
naturalmente poliplide, ocorre a falta
de um mecanismo de inativao do gene.
Integrao de transgene sem marcador
seletivo: Atravs de cotransformao foi
estudada a integrao de dois transgenes
independentes sem haver seleo para
um deles. Atravs da anlise de Southern
foi observada a presena do gene sem
seleo em aproximadamente 20% dos
eventos de transformao (Carrer e
Maliga, 1995. Biotechnology 13: 791-794).
Alta taxa de cotransformao demonstra
a facilidade em integrar mais de um gene
no ptDNA, no havendo a necessidade
de estarem fisicamente ligados a um
gene marcador seletivo. Estes resultados
apontam para uma metodologia importante na manipulao de genes
fotossintticos, na qual o marcador seletivo poderia influenciar no funcionamento dos genes. Apesar de a tecnologia
de transformao de cloroplastos ter
apresentado resultados reprodutivos em
plantas de tabaco, acreditamos ser de
total importncia a transferncia desta
tecnologia para outras espcies cultivadas. Isto vem sendo objetivo de estudo
em vrios laboratrios de pesquisa de
universidades e empresas privadas como
Monsanto e outras. O nosso laboratrio
mantm colaborao com o Dr. Pal
Maliga, Waksman Institute, Rutgers
University, EUA e Dr. Ralph Bock,
University of Freiburg, Alemanha.