LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

Materi Isolasi DNA

Nama
NIM
Kelompok
Asisten

: Nikmatus Saadah
: 135040207111034
: C2 / Selasa 09.15-10.55
: Endah Nurmala

UNIVERSITAS BRAWIJAYA
FAKULTAS PERTANIAN
PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI
MALANG
2014

BAB I
PENDAHULUAN
I.1

Latar Belakang
DNA dapat diisolasi dari berbagai sel atau
jaringan baik hewan, tumbuhan maupun manusia.Isolasi
DNA merupakan teknik awal dalam pemanfaatan DNA
untuk berbagai tujuan.Sebenarnya telah ada metode
standar dalam mengisolasi DNA, misalnya teknik atau
metode yang dikemukakan oleh Sambrook (1989).Isolasi
DNA dari sel maupun jaringan eukariotik, misalnya dari
jaringan tumbuhan maupun hewan dilakukan melalui
tahap penghancuran sel (lisis), penghilangan RNA dan
protein serta pemurnian DNA. isolasi DNA ini
membutuhkan alat-alat canggih dan bahan-bahan yang
cukup mahal, misalnya EDTA ( Etilendiamin tetra asetat )
yang berfungsi sebagai merusak sel dengan cara
mengikat
ion
Magnesium
yang
berfungsi
mempertahankan integritas sel, SDS ( Sodium dodesil
sulfat ) yang dapat melarutkan membrane sel,
mendenaturasi protein, enzim proteinase K yang
mendegradasi protein, RNAse mendegradasi RNA serta
NaCl dan chloroform untuk memurnikan DNA.
Modifikasi teknik isolasi DNA telah dilakukan pada
beberapa laboratorium, misalnya pada takaran bahanbahan yang digunakan atau penguraian/ penggantian
jenis bahan yang digunakan sesuai denga sel/ jaringan
sumber DNA.Teknik/ metode isolasi DNA yang sangat
sederhana adalah metode Kitchen Preparation. Metode
isolasi ini memanfaatkan bahan-bahan yang biasanya
digunakan ibu rumah tangga yaitu sabun cuci (cair,
bubuk atau krim) untuk menggantikan bahan utama

yang berfungsi untuk melisis sel, ekstrak buah nanas

sebagai sumber enzim protease serta garam dapur.
1.2 Tujuan
1. Untuk mengetahui definisi isolasi DNA
2. Untuk mengetahui macam metode isolasi DNA
3. Untuk mengetahui tahap isolasi DNA
4. Untuk mengetahui manfaat isolasi DNA
1.3 Manfaat
1. Mengetahui definisi isolasi DNA
2. Mengetahui macam metode isolasi DNA
3. Mengetahui tahap isolasi DNA
4. Mengetahui manfaat isolasi DNA

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pengertian Isolasi DNA
Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari
berbagai teknologi analisis DNA yang bertujuan
untuk mendapatkan DNA murni yang dapat
digunakan untuk keperluan pemeriksaan atau
diagnosa. (Aditia, 2010)
Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari
DNA. Salah satu prinsip isolasi DNA yaitu
dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan
teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan
berat molekul komponennya. Molekul yang
mempunyai berat molekul besarakan berada di
bagian bawah tabung dan molekul ringan akan
berada pada bagian atas tabung.(Jusuf, M, 2001)
DNA isolation is a routine procedure to collect
DNA for subsequent molecular or forensic
analysis.
(Isolasi DNA adalah prosedur rutin untuk
mengumpulkan DNA untuk analisis molekuler
atau forensik berikutnya)(Doyle, 1987)
2.2 Macam Metode Isolasi DNA
Isolasi DNA menggunakan metode isolasi
Karsinah et al.(2002) yang telah dimodifikasi dengan
langkah kerja sebagai berikut :
1. Tabung eppendorf diisi dengan 1 ml buffer
ekstraksi CTAB (CTAB 3%, NaCl 1,4 M, EDTA
0,002M dan Tris-HCl 0,1M) dan 5 l
mercaptoethanol.

2. Daun Bawang merah disterilisasi dengan alkohol

dan ditimbang 0,5 gram.
3. 0,5 gram daun bawang merah digerus dalam
mortar dengan bantuan nitrogen cair dan
ditambah PVP 10 mg, kemudian dimasukkan
kedalam eppendorf yang sudah berisi 1 ml buffer
ekstraksi CTAB dan 5 l mercaptoethanol.
Setelah itu ekstrak daun divortex hingga
homogen.
4. Ekstrak daun diinkubasi dalam suhu 65C
selama 30 menit sambil dibolak-balik tiap 10
menit. Kemudian ditambahkan 700 l Chloroform
: Isoamylalcohol/CHISAM (24:1). Setelah itu
ekstrak daun divortex hingga homogen.
5. Ekstrak daun kemudian disentrifugasi selama 10
menit dengan kecepatan 6000 rpm. Supernatan
dimasukkan tabung baru dan ditambahkan 700 l
CHISAM.
6. Larutan supernatan dan CHISAM disentrifugasi
selama 10 menit dengan kecepatan 6000 rpm.
Fase atas dimasukkan tabung baru ditambah
isopropanol dingin. Larutan tersebut dibolak-balik
perlahan hingga tampak benang-benang putih
dalam larutan. Larutan diinkubasi dalam freezer
selama 30 menit.
7. Setelah diinkubasi, larutan disentrifugasi selama
10 menit dengan kecepatan 6000 rpm setelah itu
supernatan dibuang dengan hati-hati agar
endapan DNA pellet tidak ikut terbuang.
8. Endapan DNA pellet dicuci dengan buffer
pencuci dengan cara menambahkan 200 l
buffer pencuci ke dalam tube, kemudian cairan di

buang. Pencucian ini dilakukan 2 kali. Setelah itu

endapan DNA pellet dikering anginkan.
9. Endapan DNA kemudian diresuspensi dengan
500 l buffer TE lalu ditambah 1 l RNAse.
10. Larutan DNA yang sudah ditambah RNAse
diinkubasi selama 30 menit pada Suhu 37C.
11. Setelah larutan DNA diinkubasi, ditambahkan 1
ml ethanol absolute dingin dan dibolak-balik
perlahan.
12. Larutan DNA lalu diinkubasi pada freezer selama
30 menit.
13. Setelah inkubasi selesai kemudian disentrifugasi
selama 10 menit pada kecepatan 6000 rpm.
Pelet kemudian dikering anginkan.
14. Pelet diresuspensi dengan 100 l buffer TE dan
disimpan dalam lemari es.
2.3

Tahap Isolasi DNA

a. Perusakan dinding sel
Penggunaan nitrogen cair
b. Lisis membran sel
Penggunaan detergen kationik (CTAB)
c. Pemurnian
Beberapa kontaminan seperti senyawa sekunder
(fenol) polisakarida, RNA,dan protein
d. Presipitasi
Penggumpalan DNA menggunakan isopropanol
dingin (Puspita, 2010)

2.4 Manfaat Isolasi DNA

Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.
Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan
secara enzimatik melalui teknik Hibridisasi
Southern
Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan
pustaka genomik.
Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur
rutin peminakan DNA
Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan
(template) dalam prosedur perbanyakan DNA
secara in vitro melalui teknik PCR (Puspita,
2010).

BAB III
METODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan (beserta fungsi)

Alat
1. Sarung latex
: untuk melindungi tangan saat
praktikum
2. Timbangan
: untuk menimbang bahan
3. Mangkuk
: wadah tempat meletakan bahan
4. Mortar
: wadah menghaluskan bahan
5. Pestle
: alat untuk menghaluskan bahan
6. Tube 1,5ml
: wadah/tabung unutk pengamatan
7. Pipet Pasteur : untuk mengambil bahan cair
8. Mikropipet
: untuk mengambil bahan cair
9. Vortex
: untuk menghomogenkan
campuran
10. Inkubator(freezer): untuk menginkubasi bahan
pengamatan
11. Sentrifuge
: untuk menghomogenkan larutan
Bahan
Daun kacang tanah
: sebagai bahan praktikum
Daun Jagung
: sebagai bahan praktikum
Nitrogen cair
: membantu proses penggerusan
PVP
: memisahkan fase organic dan fenol
CTAB
: melisis membran sel
CHISAM (chloroform isoamil alcohol) : untuk
mengurangi kontaminasi protein
7. Betha-Mertacaptoethanol
:
menghilangkan
kontamian polisakarida
8. Isopropanol dingin
: untuk presipitasi
9. Buffer pencuci : untuk mencuci DNA
10. TE buffer
: sebagai penyangga
3.2 Langkah Kerja
1.
2.
3.
4.
5.
6.

+buffer
ekstrasi
CTAB 1ml
CT

Timbang daun 0,1gr

+N2 cair & PVP

0,1 -1980 C

mercoptoetanol5l
inkubasi 650 C, 30

500l chisam

Klorofor :
isoamialkohol
24

Sentrifuge 6-8x103 RPm 10

Ambil super
natan

Sentrifuge 6-8x103 RPm 10+chisam 0,5

Ambil super
natan

+Isopropanol 1x volume (diputar pelan-pelan)

Inkubasi frezer 30
Sentrifuge (9000 rpm)
Buffer pencuci 2x(500 l)
Resuspensi TE buffer 200 l
RNAse 1 l
Inkubasi 370C 30
Simpan di frezer

+ etanol
dingin

3.3 Analisa Perlakuan

Pertama tama, yang merupakan langkah awal
praktikum adalah menimbang daun 0,1 gr kemudian
gerus tambahkan nitrogen cair dan PVP untuk
memudahkan
penggerusan.
Kemudian

menambahkan buffer CTAB 1 ml, fungsinya untuk

melisis membran sel. Setelah itu tambahkan 500 l
CHISAM untuk mengurangi kontaminan protein.
Tambahkan Betha-mercaptoetanol 5 l, fungsinya
untuk
menghilangkan
kontaminasi
polisakarida.Inkubasi 650C selama 30.Kemudian
sentrifuge 6000-8000 rpm selama 10 menit. Ambil
supernatan, tambah 0,5 ml CHISAM. Kemudian
sentrifuge 6000-8000 rpm, 10 menit. Ambil
supernatannya
tambahkan
isopropanol
dingin
1*volume, inkubasi freezer 30 menit.Sentrifuse 9000
rpm, 10 menit. Ambil pellet dan buang supernatan.
Tambah 500 l buffer pencuci 2x (500 ml) kering
anginkan 30 dan balik ditas tissue.Resuspensi 200
l buffer TE. Kemudian tambah 1 l RNAse, inkubasi
37oC, 30 menit.Tambahkan etanol dingin.Simpan
dalam frezeer.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil

DNA

HASIL

4.2 Pembahasan
. Zubaidah (2004) menyatakan bahwa isolasi
DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan
tetapi pada setiap jenis maupun bagian tanaman
dapat menimbulkan masalah berbeda, antara lain
karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida
dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat

pemurnian DNA dan juga mempengaruhi enzimenzim seperti polimerase, ligase, endonuklease
restriksi, atau enzim untuk kegiatan molekuler lain
yang dapat menyebabkan DNA tidak dapat
digunakan untuk aplikasi penelitian. Proses
ekstraksi DNA dari sel adalah langkah pertama
dalam prosedur pemisahan DNA dari substansi lain
yang tidak dionginkan dengansangat hati-hati
sehingga tidak menyebabkan kerusakan DNA.

BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
5.2 Saran
5.2.1 Kritik dan saran untuk praktikum tahun
depan
sebaiknya praktikum bioteknologi pertanian
lebih di perhatikan lagi, di buatkan jadwaljadwal yang sekiranya cukup untuk melakukan
praktikum untuk semua materi, tidak praktikum
cuman 2 kali, tapi langsung UAP. Untuk para
asisten lebih terkoordinir lagi.
5.2.2 Untuk asisten
Mbak dian cukup baik, tpi kalo udah buat janji
pengumpulan atau janji asistensi kalo udah
jam yang di tentukan, gag usah di majukin
lagi, kami selaku praktikan juga bingung,
karena juga ada kegiatan. Terimakasih mbak...

DAFTAR PUSTAKA
Aditia.

2010.
Isolasi
DNA.
http://sharkestaditia.blogspot.com
/
2010/03/isolasiDNA.html Diakses 01 Desember
2012

Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation

procedure
for small quantities of fresh leaf tissue.
Phytochem. Bull. 19: 11-15.
Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen,
Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas
(Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil
Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai
Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi
tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri
Malang.
Jusuf M. 2001. Genetika 1 Struktur dan ekspresi
Gen. Bogor : Sagung Seto.
Puspita, 2010. Tahapan Isolasi DNA. http://puspitt
.multiply.com
/journal/item/14/ISOLASI-DNA?
&show_interstitia l=1 &u=%2Fjournal%2Fitem.
Diakses tanggal 01 Desemb- er 2012
Zubaidah, 2004.Isolasi dan karakterisasi Gen Perbaikan
DNA
Baru
pada
Bakteri
Radioresisten
Deinococcus radiodurans.Prosiding Seminar
Nasional Sains dan Teknik Nuklir, Bandung, Juni
2004.