Anda di halaman 1dari 23

3.3.

1 Fraksinasi dengan Metode Kromatografi Kolom Lambat


a. Pembuatan Fase Gerak CHCl3 : MeOH (9 : 1 v/v) Sebanyak 5 mL
Untuk Penyiapan Fraksi

D
spd
ehn
d4g
mhm
ECm
Cgm
r

ma
u iu
p k k
t i
kn
a,g
5
l a
L
o
r H o l
e l e n

a
k

e
a
e
y

n
e

b. Pembuatan Fase Gerak CHCl3 : MeOH (9 : 1 v/v) Sebanyak 50 mL


Untuk Penyiapan Kolom

D
psd
ehn
4dg
mhm
CEm
Cgm
r

ma
u iu
p k k
t i
kn
5ag
l a
L
o
rH o l
e l e n

a
k

e
a
e
y

c. Pembuatan Gradien Eluen Untuk Eluasi

n
e

D i ap di pu ek t hM i ne gO Ha ma s i n g - m a s i n g 2 mL , 4 m L , 6 m L , 8 m L d a n 1 0 mL ma s i n g - m a s i n g d i m a s u k a n k e
Cdh aoHl Cmo lg Ee nr l e n m e y e r y a n g t e l a h b e r i s C H C l
d. Penyiapan Fraksi

FD
r i
kn e b
t e rt
c a
C
H

at
n
el
m

ak

m s i b e a t hi l k a a s e t a
e t ba l e r d a i p t i a m
b a n
es b i h
d a h u l u
p u r a n
C
l

e. Penyiapan Kolom

t
g

BDSeargsbiuadknesbiaglwknaah kol m
DKB uriabnarptasmidleknbaj gdiimbnausb kwr sahinl kaed lam kol m dengan hati-hati secar konti u dengan bantuan
FSCdiHtsCeldaghenrsgkamnua bu r sil ka m asuk, ol m diekuil brasi
dpieitnmgtbeatnCgsHmCel a ui d nding kol m
kdCoeHnlCgmand5ib0umk L cam puran C H C l
f. Eluasi

LDF rai er kul st ai nsd i f tder a m kn sgapungi din mpedea l sa nur gakkat n n ke da l a m kol o m s e c a r a ha t i - h a t i de n ga n
bagrvi an ldt usi ea bn acpina yamp e purkt t5 e atmen sL m e l a l u i di n di n g kol o m
3.3.6

KLT Hasil Fraksi dan Identifikasi dengan Pereaksi


a. Pembuatan Fase Gerak CHCl3 : MeOH (9 : 1 v/v) sebanyak 10 mL

D
kij

d9h
lmg
uCh
moC

po
a

mpg
a

eg
k
ai
n l
a bL
ko H
um
g l L e

o
t

ag
u

io m pa j s
ue a
pm g a
ts au 1
o L

m
r

b. Pembuatan Pereaksi Semprot H2SO4 10%

DD
ii ptmg a
eano tn g a 1 qk
mdsh a ai nL m l a g
lab a a rb t u au
n1h 0o H m m
g e n

bu ak
d e
i t
k 0u

hk k a
s t
a n d a
rm
L

DiP l ap t o dst oiapn og t op nl ag t dKLe n gT a Aln u k u r a n 5 , 2 c m x 5 c m d e n g a n b a t a s b a w a h 1 c m , b a t a s a t a s 0 , 5


Scd migl ukd a nGek j anlr aGFk a n t a r t o t o l a n 0 , 6 c m

c. Penyiapan Plat KLT Al Silika Gel GF254

CPrDK hieolmarest taa sskups kaea rniajn nekgne ur tha s n s ad r ihn egn t i k a n , a p a b i l a f a s e g e r a k t e l a h
mdmfd aii beks ben aclguaeiprraank ikadbna ldta amsr it a s d a r i k e r t a s s a r i n g
rC H C l

d. Penjenuhan Chamber

FPSPrlleattkKKsaihLLeTTtprlAAoaslseSSetiilkkuIas,iGGfreeallkssiaei,kpsltaratkdimkeeltuaanrokl,nfradkasrii2,6 1 , 3 17 dan 19 hasilkrom atografikol m dito lkan p da pl tKLT AlSi ka


aDic t hasilnya d n ih tung harg Rfnya.Fr ksiyang m e ilk profilyang sam digabungkan,diuapk n
GGeFl F
d a n it m b a n g
e. Analisis dengan KLT

4.1 Fraksinasi dengan Metode Kromatografi Kolom Lambat


Tabel 4.5.1 Pemisahan dengan Kromatografi Kolom Lambat
No

Data

Jumlah

.
1.
2.
3.

Berat botol vial kosong


Berat botol vial + fraksi etil asetat II
Fraksi etil asetat II

9,6685 g
9,8762 g
0,2077 g

4.
5.

Diameter kolom
Tinggi kolom

2 cm
10 cm

Tabel 4.5.2 Hasil Fraksinasi Kromatografi Kolom Lambat


No
.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.

Data Fraksi

Warna

Intensitas

Fraksi 1
Fraksi 2
Fraksi 3
Fraksi 4
Fraksi 5
Fraksi 6
Fraksi 7
Fraksi 8
Fraksi 9
Fraksi 10
Fraksi 11
Fraksi 12
Fraksi 13
Fraksi 14
Fraksi 15
Fraksi 16
Fraksi 17
Fraksi 18

Kuning
Bening
Bening keruh
Bening
Keruh
Putih Keruh
Putih Keruh
Bening
Kuning
Bening
Kuning
Kuning
Bening
Bening
Kuning
Kuning
Kuning
Bening

+
+
+
+
++++
+++
+
+
+
+
++
+
+

a. Perhitungan
- Pembuatan fase gerak CHCl3 : Metanol (9 : 1 v/v) sebanyak 5 mL untuk
penyiapan fraksi

Volume CHCl3

9 mL
x 5 mL=4,5 mL
10 mL

Volume MeOH

1 mL
x 5 mL=0,5 mL
10 mL

Pembuatan fase gerak CHCl3 : Metanol (9 : 1 v/v) sebanyak 50 mL


untuk penyiapan kolom
Volume CHCl3

9 mL
x 50 mL=45 mL
10 mL

Volume MeOH

1 mL
x 50 mL=5 mL
10 mL

Pembuatan pelarut gradien campuran CHCl3 : MeOH (9 : 1 v/v 5 : 5


v/v) masing-masing sebanyak 20 mL untuk eluasi. Perbandingan yang
dibuat 9 : 1 v/v; 8 : 2 v/v; 7 : 3 v/v; 6 : 4 v/v; 5 : 5 v/v.
- CHCl3 : MeOH (9 : 1 v/v)
9 mL
x 20 mL=18 mL
Volume CHCl3 = 10 mL
Volume MeOH
-

CHCl3 : MeOH (8 : 2 v/v)


Volume CHCl3

8 mL
x 20 mL=16 mL
10 mL

Volume MeOH

2mL
x 20 mL=4 mL
10 mL

CHCl3 : MeOH (7 : 3 v/v)


Volume CHCl3

7 mL
x 20 mL=14 mL
10 mL

Volume MeOH

3 mL
x 20 mL=6 mL
10 mL

CHCl3 : MeOH (6 : 4 v/v)


Volume CHCl3
Volume MeOH

1 mL
x 20 mL=2 mL
10 mL

6 mL
x 20 mL=12 mL
10 mL

4 mL
x 20 mL=8 mL
10 mL

CHCl3 : MeOH (5 : 5 v/v)


Volume CHCl3

5 mL
x 20 mL=10 mL
10 mL

Volume MeOH

5 mL
x 20 mL=10 mL
10 mL

4.2 KLT Hasil Fraksi dan Identifikasi dengan Pereaksi


Tabel 4.6.1 Harga Rf di UV 254 nm dan UV 366 nm sebelum disemprot
H2SO4 10%
Totolan

Rf

Warna

Rf

Warna

(UV 254nm)
Spot 1 = 0,25

Biru

(UV 366 nm)


Spot 1 = 0,26

Biru

Spot 1 = 0,21

Biru

Spot 1 = 0,24

Biru

Spot 2 = 0,47

Biru

Spot 1 = 0,24

Biru

Spot 2 = 0,39

Biru

Spot 3= 0,45
Spot 1 = 0,26

Biru
Biru

Spot 2 = 0,39

Biru

Spot 3= 0,45
Spot 1 = 0,21

Biru
Biru

Spot 1 = 0,08

Biru

Spot 2 = 0,26
Spot1 = 0,08

Biru
Biru

Spot 2 = 0,24
Spot 1 = 0,05

Biru
Biru

Spot 2 = 0,26

Biru
Biru
-

(standar)
II
(Fraksi
metanol)
III

Spot 1 = 0,26

Biru pudar

(Fraksi Etil
Asetat II)
IV

Spot 1 = 0,24

Biru pudar

(Fraksi 1)
V
(Fraksi 2)

Spot 1=0,22

VI
(Fraksi 8)
VII

Spot1 = 0,11

Biru

(Fraksi 9)
VIII
(Fraksi 12)

IX

Spot 3 = 0,86
-

(Fraksi 14)
X

(Fraksi 15)
XI

(Fraksi 17
Tabel 4.6.2 Harga Rf di UV 254 nm dan UV 366 nm setelah disemprot
H2SO4 10%
Totolan
I

Rf
(UV 254nm)
Spot 1 = 0,24

Warna
Biru

Rf
(UV 366 nm)
Spot 1 = 0,32

Warna
Biru

(standar)
II

Biru

(Fraksi
metanol)
III

Biru

Spot 2= 0,47
Spot 1 = 0,18

Biru

(Fraksi Etil
Asetat II)
IV

Spot 1 = 0,18

Spot 1 = 0,18

Biru

Spot 2= 0,45
Spot 1 = 0,18

Biru

Spot 1 = 0,24

Biru

Spot 1 = 0,21

Biru

Spot 2=0,47
Spot 1 = 0,24

Biru
Biru

VI

Spot 1 = 0,02

Biru

Spot 1 = 0,11

Biru

(Fraksi 8)
VII

Spot1 = 0,11

Biru

Spot 2 = 0,29
Spot1 = 0,11

Biru
Biru

Spot 2 = 0,25
Spot 1 = 0,13

Biru
Biru

Spot 2 = 0,26
Spot 1 = 0,08

Biru
Biru

VIII

Spot 2 = 0,26

Biru

(Fraksi 12)

Spot 3 = 0,81

kehijauan

(Fraksi 1)
V
(Fraksi 2)

(Fraksi 9)

IX

Spot 1= 0,25

Biru

Biru
-

(Fraksi 14)
X

(Fraksi 15)
XI

(Fraksi 17

a. Pengamatan pada UV254 dan U366

Gambar 9. Kalkir
plat KLT di
bawah UV 254 nm sebelum
disemprot H2SO4 10%.

Gambar 10. Plat KLT di bawah UV


254 nm sebelum disemprot H2SO4
10%.

Gambar 11. Kalkir plat KLT di


bawah UV 254 nm setelah
disemprot H2SO4 10%.

Gambar 12. Plat KLT di bawah UV


254 nm setelah disemprot H2SO4
10%.

Gambar 13. Kalkir plat KLT di


bawah UV 366 nm sebelum
disemprot H2SO4 10%.

Gambar 14. Plat KLT di bawah UV


366 nm sebelum disemprot H2SO4
10%.

Gambar 15. Kalkir plat KLT di


bawah UV 366 nm setelah
disemprot H2SO4 10%.

Gambar 16. Plat KLT di bawah UV


366 nm setelah disemprot H2SO4
10%.

b. Perhitungan
- Pembuatan fase gerak CHCl3 Metanol (9 : 1 v/v ) sebanyak 10 mL
Diketahui: Perbandingan CHCl3-Metanol
= 9 : 1 v/v
Volume fase gerak yang dibuat
= 10 mL
Ditanya: Volume CHCl3 = ?
Volume MeOH = ?
Jawab:
9 mL
x 10 mL=9 mL
Volume CHCl3
= 10 mL
Volume MeOH
-

1 mL
x 10 mL=1 mL
10 mL

Pembuatan Pereaksi Semprot H2SO4 10%


Diketahui : Konsentrasi larutan H2SO4 stok (C1)
= 96 %
Konsentrasi larutan H2SO4 yang dibuat (C2) = 10 %
Volume pereaksi semprot yang dibuat (V2) = 10 mL
BM H2SO4

= 98,08 g /

mol
BJ

= 1,84 g / ml pada suhu 200C

Ditanya

: Volume yang diambil dari larutan stock (V1) ?

Jawab

Konsentrasi larutan stock H2SO4 96 % :


Massa = % ( v x BJ ) = 96% ( 100 ml x 1,84 g / mol )
= 176,64 gram
massa
Mol
BM

176,64 g
98,08 g mol -1

= 1,801 mol
M

mol 1,801 mol

18,01 M
V
0,1 L

Konsentrasi pereaksi semprot H2SO4 10 % :


Massa = % ( v x BJ ) = 10% ( 10 mL x 1,84 g / mol )
= 1,84 gram

Mol

massa
BM
1,84 g
98,08 g mol -1

= 0,01876 mol
M

mol 0,01876 mol

1,876 M
V
0,01 L

Pembuatan H2SO4 10 % dan H2SO4 96 % :


M1
18,01 M

x
x

V1
V1

Perhitungan Harga Rf

=
=

V1

V1

2. Fraksi metanol (penotolan II)


0,74 cm
=0,21
3,5 cm

3. Fraksi etil asetat II (penotolan III)


Spot 1 =

0,9 cm
=0,2
6
3,5 cm

4. Fraksi 1 (penotolan IV)


Spot 1 =

V2
10 mL

1,042 mL

di UV 254 nm dan UV 366 nm sebelum

disemprot H2SO4 10%.


- Perhitungan Rf UV 254 nm
1. Fraksi kinin standar (penotolan I)
0,87 cm
Spot 1 =
3,5 cm = 0,25

Spot 1 =

M2
x
1,876 M
x
1,876 M x 10 mL
18,01 M

0,8 cm
=0,2 4
3,5 cm

5. Fraksi 2 (penotolan VI)


Spot 1 =

0,77 cm
=0,22
3,5 cm

6. Fraksi 9 (penotolan VIII)


Spot 1 =
-

0,4 cm
=0,11
3,5 cm

Perhitungan Rf UV 366 nm
1. Fraksi kinin standar (penotolan I)
0,9 cm
Spot 1 = 3,5 cm = 0,26
2. Fraksi metanol (penotolan II)
Spot 1 =

0,85 cm
=0,2 4
3,5 cm

Spot 2 =

1,65 cm
=0,47
3,5 cm

3. Fraksi etil asetat II (penotolan III)


Spot 1 =

0,85 cm
=0, 24
3,5 cm

Spot 2 =

1,4 cm
=0,39
3,5 cm

Spot 3 =

1,6 cm
=0,45
3,5 cm

4. Fraksi 1 (penotolan IV)


Spot 1 =

0,9 cm
=0, 26
3,5 cm

Spot 2 =

1,4 cm
=0,39
3,5 cm

Spot 3 =

1,6 cm
=0,45
3,5 cm

5. Fraksi 2 (penotolan V)

Spot 1 =

0,75 cm
=0, 21
3,5 cm

6. Fraksi 8 (penotolan VI)


Spot 1 =

0,3 cm
=0, 08
3,5 cm

Spot 2 =

0,9 cm
=0, 26
3,5 cm

7. Fraksi 9 (penotolan VII)


Spot 1 =

0,3 cm
=0,08
3,5 cm

Spot 2 =

0,85 cm
=0,24
3,5 cm

8. Fraksi 12 (penotolan VIII)

Spot 1 =

0,2cm
=0, 05
3,5 cm

Spot 2 =

0,3 cm
=0, 26
3,5 cm

Perhitungan Harga Rf di UV 254 nm dan UV 366 nm setelah disemprot


H2SO4 10%.
- Perhitungan Rf UV 254 nm
1. Fraksi kinin standar (penotolan I)
0,85 cm
Spot 1 =
3,5 cm = 0,24
2. Fraksi etil asetat II (penotolan III)
Spot 1 =

0,63 cm
=0, 18
3,5 cm

3. Fraksi 1 (penotolan IV)


Spot 1 =

0,63 cm
=0, 18
3,5 cm

4. Fraksi 2 (penotolan V)
Spot 1 =

0,74 cm
=0,21
3,5 cm

5. Fraksi 8 (penotolan VI)


Spot 1 =

0,7 cm
=0,2
3,5 cm

6. Fraksi 9 (penotolan VII)


Spot 1 =

0,4 cm
=0,11
3,5 cm

Spot 2 =

0,85 cm
=0,2 5
3,5 cm

7. Fraksi 12 (penotolan VIII)


Spot 1 =

0,45 cm
=0, 13
3,5 cm

8. Fraksi 14 (penotolan IX)


0,85 cm
=0,25
Spot 1= 3,5 cm

Perhitungan Rf UV 366 nm
1. Fraksi kinin standar (penotolan I)
1,1 cm
Spot 1 = 3,5 cm = 0,32
2. Fraksi metanol (penotolan II)
Spot 1 =

0,6 cm
=0,18
3,5 cm

Spot 2 =

1,65 cm
=0,47
3,5 cm

3. Fraksi etil asetat II (penotolan III)


Spot 1 =

0,6 cm
=0,18
3,5 cm

Spot 2 =

1,6 cm
=0,45
3,5 cm

4. Fraksi 1 (penotolan IV)


Spot 1 =

0,85 cm
=0,24
3,5 cm

Spot 3 =

1,6 5 cm
=0,47
3,5 cm

5. Fraksi 2 (penotolan V)
Spot 1 =

0,85 cm
=0,24
3,5 cm

6. Fraksi 8 (penotolan VI)


Spot 1 =

0,4 cm
=0,11
3,5 cm

Spot 2 =

1 cm
=0,29
3,5 cm

7. Fraksi 9 (penotolan VII)


Spot 1 =

0,4 cm
=0,11
3,5 cm

Spot 2 =

0,9 cm
=0,26
3,5 cm

8. Fraksi 12 (penotolan VIII)


Spot 1 =

0,3 cm
=0,08
3,5 cm

Spot 2 =

0,9 cm
=0,26
3,5 cm

5.1 Fraksinasi dengan Metode Kromatografi Kolom Lambat

Pada praktikum ini dilakukan pemisahan ekstrak etil asetat II yang


dengan kromatografi kolom lambat. Kromatografi kolom lambat merupakan
metode pemisahan preparatif. Metode kromatografi ini memungkinkan untuk
melakukan pemisahan satu sampel yang berupa campuran dengan berat
beberapa gram (Kristanti dkk., 2008). Prinsip kromatografi kolom adalah
suatu teknik pemisahan yang didasarkan pada peristiwa adsorpsi. Sampel
yang biasanya berupa larutan pekat diletakkan pada ujung atas kolom. Eluen
atau pelarut dialirkan secara kontinu ke dalam kolom. Dengan adanya
gravitasi atau karena bantuan tekanan, maka eluen atau pelarut akan melewati
kolom dan proses pemisahan akan terjadi (Kristanti dkk., 2008). Pada
kromatografi kolom lambat, aliran eluen hanya disebabkan oleh gravitasi.
Fraksi etil asetat II yang dipisahkan diuapkan terlebih dahulu hingga
diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental ini kemudian direkonstitusi dengan
beberapa tetes fase gerak kloroform : metanol (9 : 1 v/v) sampai larut dan
diusahakan dibuat sepekat mungkin. Fase diam yang digunakan dalam
kromatografi kolom lambat ini adalah silika gel. Kolom yang digunakan
memiliki tinggi 10 cm dan diameter 1 cm. Pembuatan kolom dilakukan
dengan cara basah karena pada umumnya cara basah lebih sering digunakan
untuk pembuatan kolom silika gel, sedangkan cara kering digunakan untuk
pembuatan kolom alumina (Kusmardiyani dan Nawawi, 1992). Selain itu,
pembuatan dengan cara basah juga bertujuan agar kolom yang terbentuk lebih
kompak karena adsorben telah dibuat dalam bentuk bubur sehingga
diharapkan terjadi pemisahan yang optimal. Bagian bawah kolom diisi
dengan glass wool untuk menahan adsorben (Kusmardiyani dan Nawawi,
1992). Glass wool ini berfungsi mencegah fase diam melewati kran yang
dapat menyumbat kran saat dilakukan pengelusian. Silika gel yang digunakan
sebagai adsorben sebanyak 4,21 gram. Pembuatan dengan cara basah juga
bertujuan supaya kolom yang terbentuk lebih kompak karena adsorben telah
dibuat menjadi bubur terlebih dahulu sehingga diharapkan terjadi pemisahan
yang optimal. Bagian bawah kolom diisi dengan glass wool untuk menahan
adsorben (Kusmardiyani dan Nawawi, 1992). Glass wool ini berfungsi

mencegah fase diam melewati kran yang dapat menyumbat kran saat
dilakukan pengelusian. Silika gel ini dibuat bubur dengan cara dilarutkan
dengan kloroform. Digunakan pelarut kloroform untuk memberikan pelarut
yang cenderung non-polar. Dengan adanya pelarut non-polar, pengotorpengotor non-polar yang melekat pada silika gel akan dialirkan bersama
aliran eluen. Bubur yang telah terbentuk dimasukkan sedikit demi sedikit
secara kontinyu ke dalam kolom yang telah diisi kloroform setinggi 10 cm
melalui dinding kolom dan diusahakan tidak terbentuk gelembung udara.
Apabila terbentuk gelembung udara, kolom yang dihasilkan tidak kompak
dan dapat menyebabkan kolom menjadi pecah sehingga proses pemisahan
tidak optimum. Gelembung yang terbentuk dapat diatasi dengan mengetuk
dinding kolom secara perlahan. Setiap memasukan bubur silika ke dalam
kolom, dinding kolom diketuk-ketukkan agar lapisan adsorben yang
terbentuk benar-benar mampat (tidak ada gelembung udara). Selain itu, pada
saat penuangan bubur silika, bubur silika diaduk dan ditambahkan kloroform
secara kontinyu untuk menghindari keringnya silika. Silika yang menempel
pada dinding kolom harus segera dibilas dengan eluen untuk menghindari
mengerasnya silika pada dinding kolom.
Kolom yang baik adalah kolom yang adsorbennya kompak dan tidak
terdapat gelembung udara didalamnya karena gelembung udara dan celah
pada adsorben mengakibatkan kolom akan pecah dan dapat mengganggu
proses pemisahan. Saat pengisian bubur silika gel ke dalam kolom, kran
dibuka untuk mengalirkan eluen dengan kecepatan tertentu dan dijaga supaya
silika tidak kering dan terbasahi oleh eluen. Setelah semua bubur dimasukkan
ke dalam kolom, pada bagian atas silika diberi eluen kira-kira setinggi 5 cm
kemudian ditutup dengan plastik ikan dan aluminium foil untuk mencegah
keringnya silika selama penyimpanan. Kolom yang telah dibuat didiamkan
selama satu malam bertujuan agar kolom yang terbentuk lebih kompak dan
proses pemampatan fase diam menjadi lebih sempurna dan selama didiamkan
harus terdapat sejumlah tertentu fase gerak di bagian atas kolom untuk
mencegah kering dan rusaknya kolom. Pecahnya kolom atau fase diam yang

mengering dapat mengganggu proses pemisahan, sehingga pemisahannya


tidak maksimal. Selain itu, kolom harus dalam keadaan tertutup rapat agar
tidak memungkinkan udara untuk masuk (Kristanti dkk., 2008).
Kolom yang telah didiamkan selama semalam diekuilibrasi dengan 50
mL fase gerak kloroform : metanol (9 : 1 v/v) sebelum diisi sampel yang akan
dipisahkan. Hal ini dilakukan agar kolom lebih kompak dan menghilangkan
kloroform yang ada di dalam kolom yang sebelumnya digunakan sebagai
eluen pembuatan kolom. Pemisahan dengan kromatografi kolom dilakukan
dengan meletakkan campuran yang akan dipisahkan pada bagian atas kolom
adsorben yang berada dalam suatu tabung. Pelarut karena gaya berat
dibiarkan mengalir melalui kolom membawa serta pita linarut yang bergerak
dengan kecepatan berbeda. Linarut yang telah terpisah dikumpulkan berupa
fraksi yang keluar dari bagian bawah kolom (Kusmardiyani dan Nawawi,
1992). Pengisian cuplikan dilakukan dengan memasukkan cuplikan ke dalam
kolom dengan bantuan pipet secara hati-hati melalui dinding kolom agar tidak
merusak kolom yang telah dibuat. Sampel yang menempel pada dinding
kolom dibilas dengan menggunakan eluen kloroform : metanol (9 : 1 v/v).
Elusi dilakukan dengan mengalirkan pelarut gradien kloroform : methanol
berturut- turut dengan perbandingan 9 : 1 v/v; 8 : 2 v/v; 7 : 3 v/v; 6 : 4 v/v;
dan 5 : 5 v/v masing masing sebanyak 20 mL. Alasan digunakannya pelarut
gradien adalah dengan pengelusian dengan pelarut gradien dapat mengelusi
semua komponen yang ada dalam sampel. Eluat yang keluar dari kolom
diatur kecepatannya agar konstan. Eluat yang keluar ditampung setiap 5 mL
pada botol vial yang telah ditera. Kecepatan elusi tidak boleh terlalu cepat
sehingga senyawa berada dalam keseimbangan antara fase diam dan fase
gerak, sebaliknya jika kecepatan elusi ini terlalu kecil, maka senyawasenyawa akan terdifusi ke dalam eluen dan akan menyebabkan pita makin
lama makin lebar yang akibatnya pemisahan tidak dapat berlangsung dengan
baik kecepatan elusi yang besar dapat dilakukan jika yang akan dipisahkan
adalah campuran senyawa yang memiliki kepolaran yang sangat berbeda
(Kristanti dkk., 2008).

Pemisahan dengan kolom kromatografi ini menghasilkan 18 fraksi yang


memiliki warna yang berbeda beda pada setiap fraksinya. Fraksi bening
adalah pada fraksi 2,4,8,10,13,14, dan 20. Sedangkan fraksi 5 sampai 7
warnanya keruh dengan intensitas yang berbeda. Warna kuning dihasilkan
oleh fraksi 1,9,11,12,15,16, dan 17 intensitas yang berbeda-beda. Fraksi yang
memiliki profil (warna) sama digabung untuk dilakukan analisis lebih lanjut
dengan kromatografi lapis tipis.
5.2 KLT Hasil Fraksi dan Identifikasi dengan Pereaksi
Setelah dilakukan pemurnian dengan kromatografi kolom, maka fraksifraksi yang dihasilkan diidentifikasi lebih lanjut dengan metode kromatografi
lapis tipis (KLT). Identifikasi pada KLT dilakukan untuk mengetahui ada atau
tidaknya alkaloid kinin pada fraksi hasil pemisahan pada kromatografi kolom.
Prinsip dari Kromatografi Lapis Tipis berdasarkan perbedaan afinitas
senyawa-senyawa yang sedang dianalisis terhadap dua fase yaitu fase diam
dan fase gerak (Kristanti dkk., 2008). Metode ini digunakan karena dapat
mengidentifikasi lebih cepat dan prosesnya sederhana. Pada praktikum ini,
fase diam yang digunakan yaitu silika gel yang bersifat polar. Hal ini
mengakibatkan senyawa-senyawa yang bersifat polar akan cepat tertambat
sehingga harga Rf yang diperoleh kecil. Sebaliknya senyawa yang bersifat
non polar akan tertambat jauh dari tempat penotolan dan mempunyai harga Rf
besar.
Fraksi yang memiliki profil yang sama hasil kromatografi kolom
diuapkan hingga menjadi ekstrak kentalnya. Selain fraksi tersebut, ditotolkan
pula standar kinin sulfat dan fraksi metanol. Fraksi yang telah diuapkan,
direkonstitusi dengan menambahkan beberapa tetes metanol dan larutan
dibuat sepekat mungkin. Penambahan metanol bertujuan untuk menarik
kembali alkaloid kinin yang akan diidentifikasi pada fraksi. Selanjutnya
dilakukan analisis dengan KLT menggunakan fase diam (Aluminium silika
gel GF254) dengan tinggi 5 cm serta lebar 9,4 cm dan fase gerak (campuran
CHCl3 : MeOH dengan perbandingan 9 : 1 v/v). Pemisahan fraksi dengan
kromatografi lapis tipis pada praktikum ini menerapkan sistem TC yakni

mengunakan fase diam polar berupa silika dengan fase gerak berupa
kloroform : metanol dengan perbandingan 9 : 1 v/v (Moffat et al., 2005).
Penggunaan kombinasi dua pelarut ini akan memberikan hasil pemisahan
yang lebih baik dibandingkan dengan pelarut tunggal (Gandjar dan Rahman,
2007).
Chamber dijenuhkan dengan 5 ml fase gerak kloroform : metanol (9 : 1
v/v) untuk mengoptimalkan proses pengembangan fase gerak dan membuat
tekanan di dalam chamber merata sehingga proses eluasi dapat berjalan
serempak dan kompak. Penambahan kertas saring pada saat penjenuhan
chamber dilakukan agar penguapan yang terjadi dalam chamber merata
sehingga udara di dalam chamber tetap jenuh oleh pelarut (Kusmardiyani dan
Nawawi, 1992). Selama proses penjenuhan, chamber ditutup dengan baik,
dan dijaga pelarut. Kondisi jenuh dalam chamber dengan uap pelarut
mencegah penguapan pelarut (Moffat et al, 2005).
Pada saat menunggu chamber jenuh dilakukan penotlan fraksi pada fase
diam. Pada plat silika gel GF254 ditotolkan standar kinin, fraksi etil asetat II
dan fraksi methanol, fraksi 1,2,8,9,12,14,15, dan 17. Proses penotolan harus
dilakukan dengan hati-hati agar diperoleh ukuran bercak sekecil dan sesempit
mungkin karena jika bercak yang digunakan terlalu besar maka dapat
menurunkan resolusi. Jika volume sampel yang akan ditotolkan lebih besar
dari 2-10 l maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan
dilakukan pengeringan antar totolan (Sudjadi, 2007). Penotolan fraksi
metanol bertujuan sebagai pembanding setelah dilakukannya pemurnian.
Plat yang telah ditotolkan selanjutnya dielusi pada chamber yang telah
dijenuhkan.

Plat kemudian diangkat dan dikeringkan kemudian diamati

dibawah sinar UV 254 nm dan 366 nm. Plat KLT selanjutnya disemprot
dengan pereaksi semprot yaitu H2SO4 10%. Kemudian dideteksi lagi dibawah
sinar UV 366 nm. Penyemprotan ini bertujuan untuk mengintensifkan warna
fluoresensi biru muda dari alkaloid kinin saat diamati kembali pada sinar UV
366 nm. Setelah dikeringkan plat diamati kembali dan diperoleh hasil dengan
pendaran warna yang lebih intensif. Hasil positif adanya kinin adalah
timbulnya fluoresensi biru di bawah sinar UV (Moffat et al, 2005).

Setelah diamati di bawah UV 254 nm, pada spot 2 fraksi 11 dan fraksi 2
terjadi pemadapan fluoresensi, sedangkan spot pada fraksi yang lain tidak
terjadi fluoresensi dimana warna spot adalah biru pudar. Untuk fraksi metanol
menunjukkan spot 1 dengan warna spot biru pudar. Sedangkan pada fraksi etil
asetat II spot 1 menunjukkan warna biru. Pada UV 366 nm, spot 3 pada fraksi
etil asetat II dan spot 2 dan 3 pada fraksi 2 menunjukkan warna biru
kehijauan. Sedangkan spot pada fraksi yang lain tampak berwarna biru.
Sedangkan pada fraksi ekstrak metanol muncul 2 spot dengan urutan warna
biru. Berdasarkan pustaka, alkaloid kinin yang dideteksi dibawah sinar UV
366 nm akan menghasilkan fluoresensi berwarna biru (Sherma et al., 2008;
Wagner and Bladt, 2009).
Pada hasil pengamatan ini, dimana sebelum dan sesudah penyemprotan
terjadi pemunculan spot dengan fluoresensi biru pada setiap fraksi dengan
rentang Rf antara 0,05-0,5. Nilai Rf yang baik pada suatu kromatografi lapis
tipis adalah Rf yang memasuki rentang antara 0,2 - 0,8, dimana dalam
praktikum ini diperoleh 12 spot dengan nilai Rf yang

tidak memenuhi

rentang 0,2 - 0,8 (Kusmardiyani dan Nawawi, 1992). Selanjutnya dilakukan


penggabungan sampel dengan profil yang sama, dimana hasil penggabungan
ini diperoleh 2 fraksi yakni yang terdiri dari fraksi 11 dan fraksi 12. Selain itu,
berdasarkan acuan pada pustaka kedua fraksi ini dapat diduga mengandung
alkaloid kinin didalamnya karena menghasilkan fluoresensi biru saat diamati
dibawah sinar UV 366 nm dan semakin intensif dengan adanya penyemprotan
pereaksi asam sulfat 10% b/v. Fraksi ini kemudian akan digabung kembali
untuk selanjutnya diisolasi dengan KLT preparatif.
PRIMA KARNA AKU GATAU GAMBAR PLATNYA JADI
PEMBAHASANNYA AGAK

Anda mungkin juga menyukai