LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM KIMIA ANALISIS

PENETAPAN KADAR PARACETAMOL

DENGAN
KLT-SPEKTRODENSITOMETRI

Oleh :
Kelompok 4
Golongan I
Ni Nengah Sri Wahyuni

(0908505018)

I Dw. Ag. Diah Yuniartha Dewi

(0908505019)

Luh Gede Evy Windarini

(0908505020)

JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
BUKIT JIMBARAN
2011

PENETAPAN KADAR PRACETAMOL

DENGAN METODE KLT-SPEKTRODENSITOMETRI
I. Tujuan
1. Memahami metode penetapan kadar zat aktif pada sediaan paracetamol dengan
KLT-Spektrofotodensitometer.
II. Dasar Teori
Suatu campuran zat dapat dipisahkan dengan teknik KLT berdasarkan
perbedaan afinitas masing-masing komponen terhadap fase gerak dan fase diamnya.
Komponen

yang

telah

terpisah,

besar

serapannya

dapat

diukur

dengan

spektrofotodensitometer. Kadar dari sampel dapat ditentukan dari perbandingan

antara serapan sampel dan bakunya (Susanti, 2011).
A. Paracetamol
Paracetamol memiliki nama lain Acetaminophen atau N-Acetylp
aminophenol N-(4-Hydroxyphenyl)acetamide. Berat molekulnya 151,2. Berupa
kristal putih atau terdiri dari serbuk kristal. Titik didihnya dalam air berkisar antara
169.0 sampai 170.5. Paracetamol sedikit larut dalam air dingin, sangat larut dalam
air panas, larut dalam etanol, metanol, dimetilformamide, etilene diklorida, aseton,
dan etil asetat;

sedikit larut dalam eter dan kloroform; serta tidak larut dalam

petrolium eter, pentane dan benzene.

Gambar 1 : Struktur paracetamol

Larutan asam encer245 (A11=668a); Larutan basa encer257 nm
(A11=715a)
(Anonim, 2005).
Paracetamol mengandung tidak kurang dari 98,0 % dan tidak lebih dari
101,0% C8H9NO2, dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan. Serbuknya hablur
1

atau serbuk hablur putih; tidak berbau; rasa sedikit pahit. Kelarutannya larut dalam
70 bagian air, dalam 7 bagian etanol (95%)P, dalam 13 bagian aseton P, dalam 40
bagian gliserol P dan dalam 9 bagian propilenglikol P; larut dalam larutan alkali
hidroksida (Depkes RI, 1979). Paracetamol memenuhi uji Identifikasi secara
Kromatografi Lapis Tipis dengan menggunakan 1 mg per ml dalam methanol P dan
fase gerak diklorometana P- methanol (4:1) (Depkes RI, 1995).
B. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber
pada tahun 1938. KLT merupakan bentuk kromatrografi planar , selain kromatograi
kertas dan elektroforesis. Berbeda dengan kromatografi kolom yang mana fase
diamnnya diisikan atau dikemas didalamnya, pada kromatografi lapis tipis, fase
diammnya berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar
yang didukung oleh lempeng kaca, Pelat aluminium, atau pelat plastik (Gandjar dan
Rohman, 2007)
Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah suatu metode pemisahan campuran
analit dengan mengelusinya melalui fase diam yang datar pada plat penyangga.
Dalam KLT, fase gerak ini berupa cairan. Pemisahan akan terjadi jika salah satu
komponen dari campuran diadsorpsi lebih kuat dari komponen yang lainnya. Karena
adsorpsi merupakan fenomena permukaan, maka derajat pemisahan dipengaruhi oleh
luas permukaan yang ada atau secara tidak langsung dipengaruhi oleh ukuran partikel
fase diam (adsorben) Walaupun demikian koefisien distribusi/partisi senyawa antara
kedua fase dalam sistem merupakan faktor kunci setiap bentuk kromatogram
(Widjaja dkk., 2008).

Koefisien distribusi/partisi (K) =

(Widjaja dkk., 2008).

Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya
jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin.
Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang lain, jika sampel yang digunakan
terlalu banyak akan menurunkan resolusi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa
2

penotolan sampel secara otomatis lebih dipilih daripada penotolan secara manual
terutama jika sampel yang akan ditotolkan lebih dari 15l. Penotolan sampel yang
tidak tepat akan menyebabkan bercak yang menyebar ke puncak ganda. Pelebaran
bercak dapat mengganggu proses scanning dengan spektrodensitometri karena
memungkinkan terjadinya himpitan puncak (Kusmardiyani dan Nawawi, 1992).
Untuk memperoleh reprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling
sedikit 0,5 l. Jika volume sampel yang akan ditotolkan lebih besar dari 2-10 l
maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar
totolan. Bila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan
sampel tersebut ke dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi
dengan uap fase gerak. Untuk melakukan penjenuhan fase gerak, biasanya bejana
dilapisi dengan kertas saring. Jika fase gerak telah mencapai ujung kertas saring,
maka dapat dikatakan bahwa fase gerak telah jenuh. Selama proses elusi, bejana
kromatografi harus ditutup rapat, misalkan dengan lembar aluminium dan
sebagainya. Kemudian tepi bagian bawah lempeng lapis tipis yang telah ditotoli
sampel dicelupkan ke dalam fase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak
dalam bejana harus di bawah lempeng yang telah berisi totolan sampel. Setelah plat
KLT dicelupkan ke dalam bejana, kemudian dilakukan pengembangan . Ada
beberapa teknik untuk melakukan pengembangan dalam KLT yaitu pengembangan
menaik (ascending), pengembangan menurun (descending), melingkar, dan
mendatar. Meskipun demikian, cara pengembangan menaik merupakan cara yang
paling populer dibandingkan dengan cara yang lain (Gandjar dan Rohman, 2007).
Setelah proses pengembangan mencapai batas akhir lintasan, plat KLT lalu
dikeringkan pada temperatur yang sesuai dengan titik didih pelarut yang digunakan.
Tujuan dari aktivasi tersebut adalah untuk menguapkan metanol dan amonia yang
digunakan sebagai larutan pengelusi agar tidak mengganggu analisis saat discanning dengan spektrofotodensitometri (Kusmardiyani dan Nawawi, 1992).

Gambar 2 : Kromatografi lapis tipis

Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang
berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan
akan tampak sebagai perbedaan bercak warna.

Gambar 3 : menunjukan Lempengan setalah pelarut bergerak setengah dari

lempengan.
Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini akan
memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk
kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam. (Clark, 2007)
Parameter migrasi analitik pada KLT dinyatakan dengan Rf (waktu tambat).
Rf (waktu tambat) adalah waktu yang diperlukan untuk mengelusi maksimum suatu
sampel dihitung dari titik awal penotolan. Oleh karena itu bilangan Rf selalu lebih
kecil dari 1. Waktu tambat dapat dihitung dengan rumus:

Rf= jarak yang ditempuh senyawa

jarak yang ditempuh pelarut
Fase diam pada KLT adalah adsorben dengan partikel halus yang dilapiskan
pada lempeng penyangga kaca, logam, atau plastik. Adsorben yang dapat digunakan
diklasifikasi berdasarkan sifat kimia atau daya ikatannya (Widjaja dkk., 2008). Fase
diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan
diameter partikel antara 10-30m. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam
dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam
hal efisiensi dan resolusinya (Gandjar dan Rohman, 2007).
Untuk fase diam yang non polar (sistem fase balik) biasanya digunakan fase
gerak larutan berair, metanol, asetonil, dan isopropanol. Pemilihan fase gerak sangat
bergantung pada jenis pemisahan yang hendak dicapai. Secara umum pemilihan fase
gerak harus dihindari menggunakan pelarut yang berbahaya atau beracun. Beberapa
hal yang harus diperhatikan dalam pemilihan pelarut adalah:
a. Pelarut harus tidak toksik agar tidak menyebabkan masalah kesehatan baik
jangka pendek maupun panjang
b. Tidak mudah meledak pada kondisi normal
c. Tidak reaktif atau beraksi secara kimia dengan analit atau fase diam
d. Tidak memberikan masalah pada pembuangan (ramah lingkungan)
(Widjaja dkk., 2008)
Fase gerak ialah medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa pelarut.
Fase gerak bergerak di dalam fase diam, yaitu suatu lapisan berpori, karena ada gaya
kapiler. Yang digunakan hanyalah pelarut bertingkat mutu analitik dan bila perlu,
sistem pelarut miltikomponen ini harus berupa suatu campuran sesederhana mungkin
yang terdiri atas maksimum tiga komponen. Angka banding campuran dinyatakan
dalam bagian volum sedemikian rupa sehingga volume total 100, misalnya benzenkloroform-asam asetat 96% (50:40:10) (Stahl, 1985).
Sistem pelarut yang paling sederhana ialah campuran dua pelarut organik
karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat diatur sedemikian rupa sehingga
pemisahan dapat terjadi secara optimal atau sempurna. Berikut ini adalah beberapa
petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak:

1. Fase gerak harus memiliki kemurnian yang sangat tinggi karena KLT
merupakan teknik yang sensitif
2. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak
antara 0,2 sampai 0,8 untuk memaksimalkan pemisahan
3. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel,
polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti
juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar
seperti dietil eter kedalam pelarut non polar seperti metil benzen akan
meningkatkan harga Rf secara signifikan
4. Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut
sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan metanol dengan
perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia
masing-masing akan meningkatkan solut-solut yang bersifat basa dan asam
(Gandjar
dan
Rohman,
2007).
Paracetamol merupakan senyawa yang bersifat basa sehingga sebelum
penotolan diperlukan aktivasi fase diam silika dengan cara plat KLT disemprot
dengan larutan KOH dalam methanol. Perlakuan ini bertujuan untuk memperoleh
kromatogram senyawa dalam bentuk basa bebasnya daripada dalam bentuk
garamnya. Garam-garam amina akan bergerak sangat lambat dalam fase gerak
pelarut organik karena senyawa-senyawa basa cenderung berinteraksi secara kuat
dengan gugus silanol yang ada di fase diam sehingga jika ada KOH dalam fase diam
akan menekan interaksi ini. Fase gerak yang digunakan untuk jenis ini biasanya
mengandung komponen yang bersifat basa (Gandjar dan Rohman, 2007). Aktivasi
plat KLT bertujuan untuk menghilangkan pengotor dan air yang masih terdapat
dalam plat KLT (Kusmardiyani dan Nawawi, 1992).
Ada 2 cara yang digunakan untuk analisis kuantitatif dengan KLT. Pertama,
bercak diukur langsung pada lempeng dengan menggunakan ukuran luas atau dengan
teknik densitometri. Cara kedua adalah dengan mengerok bercak lalu menetapkan
kadar senyawa yang terdapat dalam bercak tersebut dengan metode analisis yang
lain, misalkan dengan metode spektrofotometri. Pada cara pertama tidak terjadi
kesalahan yang disebabkan oleh pemindahan bercak atau kesalahan ekstraksi,
sementara pada cara kedua sangat mungkin terjadi kesalahan pengambilan atau
karena ekstraksi (Gandjar dan Rohman, 2007).

C. Spektrodensitometri
Analisis kuantitatif dari suatu senyawa yang telah dipisahkan dengan KLT
biasanya dilakukan dengan densitometer langsung pada lempeng KLT (atau secara in
situ). Densitometer dapat bekerja secara serapan atau fluoresensi. Kebanyakan
densitometer mempunyai sumber cahaya, monokromator untuk memilih panjang
gelombang yang cocok, sistem untuk memfokuskan sinar pada lempeng, pengganda
foton, dan recorder. (Gandjar dan Rohman, 2007).
Semua densitometer pemayar mempunyai rancang bangun tertentu, yang
meliputi sumber cahaya, perangkat pemilih panjang gelombang, sistem pengumpul
dan pemusat cahaya, serta detektor. Selain itu diperlukan mekanisme gerak lempeng
di bawah cahaya terpusat untuk memayar lempeng. Dalam hal ini pemilihan
panjang gelombang adalah monokromator (MK) dan perangkat indera adalah tabung
photomultiplier (PM) (Munson, 1991).
Pada cara pantulan, yang diukur adalah sinar yang dipantulkan, yang dapat
menggunakan sinar tampak maupun ultraviolet. Sementara itu, cara transmisi
dilakukan dengan menyinari bercak dari satu sisi dan mengukur sinar yang
diteruskan pada sisi lain. Gangguan utama pada sistem serapan adalah fluktuasi latar
belakang (background) yang dapat dikurangi dengan beberapa cara, misalnya dengan
menggunakan alat berkas ganda, sistem transmisi dan pantulan secara bersamaan,
atau dengan sistem 2 panjang gelombang. Kurva baku dibuat untuk setiap lempeng
dan kadar senyawa dihitung seperti pada metode instrumental yang lain. Presisi
penetapan termasuk penotolan cuplikan, pengembangan kromatogram, dan
pengukuran adalah 2-5% .Sistem fluoresensi biasanya lebih disenangi jika senyawa
itu dapat dibuat berfluoresensi. Batas deteksi sistem ini lebih rendah dan kelinieran
respon dan selektifitasnya lebih tinggi. Gangguan fluktuasi latar belakang juga lebih
rendah. Bercak yang diukur dengan sistem fluoresensi, serapan ultraviolet, atau sinar
tampak dapat ditetapkan lebih teliti daripada bercak yang disemprot dengan pereaksi
warna. Faktor keseragaman pada penyemprotan merupakan hal yang sangat
menentukan (Gandjar dan Rohman, 2007).
Dasar teori terapan densitometri dalam analisis kuantitatif lempeng lapisan
tipis adalah persamaan Kubelka dan Munk. Bentuk persamaan Kubelka-Munk dapat
dinyatakan :

( I R) 2
C

2R
S
Keterangan :
R = cahaya terpantul pada permukaan lempeng
= koefisien serapan terokan
C = kadar terokan dan
S = koefisien hambur lempeng
Persamaan ini meramalkan ketidaklurusan yang sering teramati pada
pengukuran pantul. Tetapi persamaan ini dapat diluruskan dengan pendekatan seperti
menggambarkan (luas puncak)2 versus kadar atau log luas puncak versus log kadar
(Munson, 1991).
D. Penetapan Kadar
Kadar dari sampel dapat ditentukan dari perbandingan antara serapan sampel
dan bakunya. Untuk penentuan kadar, yang ditetapkan adalah absorpsi maksimum
kurva absorpsi. Jika absorpsi ini untuk penentuan kadar adalah sangat rendah atau
senyawa mula-mula mengabsorpsi di bawah 220 nm, maka seringkali senyawa
diubah dulu menjadi suatu zat warna melalui reaksi kimia, dan absorpsi ditentukan
dalam daerah sinar tampak (kolorimetri) (Roth dan Blaschke, 1988).
Berikut ini adalah contoh penyelesaiannya :
1. Menggunakan Hukum Lambert Beer
A=c d
Keterangan :
A adalah daya serap, adalah daya serap molar (dalam mole cm-1) ;
c adalah kadar (dalam mole liter-1) dan d adalah panjang jalur (dalam cm).
Persamaan di atas berlaku menyeluruh sebagai dasar pokok analisis
kuantitatif

dengan

spektroskopi

serapan.

Suatu

cara

sederhana

untuk

mengkuantitasi suatu bahan penyerap ialah dengan mengukur daya serapnya pada
panjang gelombang tertentu dan menyubstitusikan A, dan d ke persamaan di
atas untuk mendapatkan c (Munson, 1991).
2. Menggunakan Kurva Kalibrasi.

Bila tidak diketahui dan terokan murni analit tersedia, kurva kalibrasi dapat
dibuat (daya serap terhadap kadar). Lereng kurva tersebut adalah d dan bila d
diketahui maka dapat dihitung. Terokan tunggal yang diketahui kadarnya dapat
digunakan untuk menentukan , tetapi hal ini kurang handal daripada penggunaan
lereng kurva kalibrasi. Selain itu kadar terokan yang tak diketahui dapat dibaca
langsung dari kurva kalibrasi dengan mencari daya serap yang tak diketahui pada
kurva dan menarik garis tegak lurus ke bawah pada sumbu kadar. Metode ini
sangat bermanfaat terutama jika nyata terlihat adanya penyimpangan terhadap
hukum Beer (ketaklurusan) (Munson, 1991).

III. Alat dan Bahan

Alat:

Pipet kapiler

Chamber

Alat pemanas

Spektrofotodensitometer CAMAG TLC-Scaner

Oven

Plat KLT silica GF 254

Penotol nanomat

Lampu UV

Bahan:

Larutan sampel

Larutan baku pembanding (paracetamol 100, 200, 400, 800, 1600 ng)

Fase gerak (metanol)

Fase diam (silika gel)

IV. Cara Kerja

1.

Disiapkan larutan baku dan sampel (sediaan paracetamol).

2.

Plat dipotong dengan panjang 8 cm x 10 cm.

3.

Plat

dicuci dengan metanol sebanyak 10 ml dan kertas saring untuk

menyerap kotaoran dari plat.

4.

Plat diaktivasi selam 30 menit dengan suhu 1200 C.

5.

Chamber dijenuhkan dengan fase gerak.

6.

Larutan sampel, larutan baku dan larutan blanko ditotolkan pada plat
dengan penotol linomat dengan jarak tiap 1 cm tiap penotolan.

7.

Plat yang sudah ditotolkan dielusikan dalam chamber dengan jarak

pengembangan 8 cm.

8.

Plat diangkat dan dikeringkan pada oven dengan suhu 80 oC selama 15

menit.

9.

Plat discanning dengan CAMAG TLC-SCANNER pada = 248 nm.

10. Ditentukan serapan masing-masing komponen pada panjang gelombang

tertentu dengan spektrodensitometer.
V. Hasil dan Perhitungan
Diketahui:
1. Larutan baku
Konsentrasi larutan baku 1 ( C1 ) = 100 ng
Konsentrasi larutan baku 2 ( C2 ) = 200 ng
10

Konsentrasi larutan baku 3 ( C3 ) = 400 ng

Konsentrasi larutan baku 4 ( C4 ) = 800 ng
Konsentrasi larutan baku 5 ( C5 ) = 1600 ng
AUC larutan baku 1 ( AUC1 )
AUC larutan baku 2 ( AUC2 )
AUC larutan baku 3 ( AUC3 )
AUC larutan baku 4 ( AUC4 )
AUC larutan baku 5 ( AUC5 )

= 864,2
= 1110,5
= 1573,0
= 3098,0
= 4912,5

2. Larutan sampel
AUC larutan sampel ( AUCs )

= 4464,2

Ditanya:
a. Kurva kalibrasi larutan baku = ?
b. Persamaan regresi linier antara konsentrasi dan AUC =?
c. Konsentrasi sampel ( Cs ) =?
Jawab:
a. Kurva kalibrasi larutan baku

b. Persamaan regresi linier antara konsentrasi dan AUC

Persamaan ini diperoleh melalui perhitungan dengan menggunakan
kalkulator scientific Casio fx-570 MS. Jika konsentrasi (C) adalah x
dan Area Under Curve ( AUC ) adalah y maka diperoleh persamaan
regresi linier larutan baku parasetamol yaitu:
y = 2,762x + 599,125 dengan r = 0.995.
c. Konsentrasi sampel
y
= 2,762x + 599,125
AUCs
= 2,762x + 599,125
4464,2
= 2,762x + 599,125
11

4464,2 599,125 = 2,762x

2,762x
= 3865,075

= 1399,375 ng

VI. Pembahasan
Percobaan kali ini bertujuan untuk memahami metode penetapan kadar zat
aktif

pada

sediaan

paracetamol

secara

kuantitatif

dengan

KLT-

spektrofotodensitometer. Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah suatu metode

pemisahan campuran analit dengan mengelusinya melalui fase diam yang datar pada
plat penyangga. Suatu campuran zat dapat dipisahkan dengan teknik KLT
berdasarkan perbedaan afinitas masing-masing komponen terhadap fase gerak dan
fase diamnya. Komponen yang telah terpisah, besar serapannya dapat diukur dengan
spektrofotodensitometer. Kadar dari sampel dapat ditentukan dari perbandingan
antara serapan sampel dan bakunya (Susanti, dkk. 2009).
Ada 2 cara digunakan untuk analisis kuantitatif dengan KLT. Pertama, bercak
diukur langsung pada lempeng dengan menggunakan ukuran luas atau dengan teknik
densitometri. Cara kedua adalah dengan mengerok bercak lalu menetapkan kadar
senyawa yang terdapat dalam bercak tersebut dengan metode analisis yang lain,
misalkan dengan metode spektrofotometri. (Gandjar dan Rohman, 2007). Pada
praktikum kali ini yang dilakukan adalah pengukuran langsung menggunakan
spektrofotodensitometer.
Penentuan kadar paracetamol ini diawali dengan pengukuran absorbansi
larutan paracetamol yang telah diketahui kadarnya pada panjang gelombang yang
sama. Jika absorbansi suatu seri larutan diukur pada panjang gelombang, suhu,
kondisi pelarut yang sama, dan absorbansi masing-masing larutan diplotkan terhadap
12

konsentrasinya maka suatu garis lurus akan teramati sesuai dengan persamaan A=
bc. Pada percobaan ini, hal yang dilakukan adalah pemisahan dengan KLT dan
pembacaan hasil pemisahan dengan proses scanning dengan CAMAG TLCSCANNER.
Dalam percobaan ini, fase diam yang digunakan adalah silica gel GF 254 nm
berukuran

8 x 10 cm. Sedangkan, fase geraknya berupa metanol. Metanol

merupakan senyawa semipolar karena memiliki gugus OH yang bersifat polar dan
gugus CH3 yang bersifat non polar. Oleh sebab itu metanol digunakan sebagai fase
gerak untuk pemisahan senyawa yang menggunakan silika gel yang bersifat polar
sebagai fase diam.Selain itu pula, analit yang digunakan dalam percobaan ini adalah
paracetamol dimana paracetamol larut dalam 70 bagian air ( sukar larut) sehingga
paracetamol bersifat non polar.(Depkes RI, 1995). Penggunaan pelarut metanol yang
bersifat semi polar diharapkan agar proses pengelusian tidak berlangsung cepat
ataupun tidak berlangsung lambat. Proses pengelusian yang terlalu cepat ataupun
lambat juga tidak baik untuk hasil pemisahan nantinya.
Sebelum digunakan, plat KLT dicuci terlebih dahulu dengan cara dielusi
dengan metanol untuk menghilangkan pengotornya. Pada ujung plat KLT diletakkan
kertas tissue yang berfungsi untuk menyerap fase gerak apabila telah terelusi
melewati plat sehingga pengotor yang telah larut pada metanol langsung dapat
diserap dan tidak terjadi elusi balik. Setelah elusi selesai, dilakukan aktivasi plat
KLT dengan cara dikeringkan pada oven dengan suhu 120 0C selama 30 menit.
Aktivasi ini bertujuan untuk menghilangkan sisa air yang terdapat fase diam dan juga
untuk memindahkan pengotor agar berada pada ujung plat KLT sehingga tidak
mengganggu proses pemisahan (Kusmardiyani dan Nawawi, 1992). Digunakan suhu
1200C dikarenakan air memiliki titik didih 1000C, sehingga dengan cepat air dapat
menguap.
Setelah

aktivasi

selesai

kemudian

dilakukan

penjenuhan

chamber.

Penjenuhan chamber berfungsi untuk meratakan tekanan uap eluen dalam chamber
sehingga jumlah lempeng teoritis meningkat dan pengelusian dapat seragam
kecepatannya dan

untuk mengoptimalkan proses pengembangan fase gerak.

Penjenuhan chamber dilakukan dengan menambahkan fase geraknya yaitu metanol

ke dalam chamber dan meletakkan kertas saring pada chamber. Penambahan kertas
saring berfungsi agar penguapan yang terjadi dalam chamber merata sehingga udara
13

di dalam chamber tetap jenuh pelarut (Kusmardiyani dan Nawawi, 1992). Selama
proses penjenuhan, chamber harus

ditutup dengan baik,

kemudian didiamkan

selama 30 menit dan dijaga agar tidak mengalami pergeseran untuk mencegah
terjadinya ketidakjenuhan pelarut. Kondisi jenuh dalam chamber dengan uap pelarut
mencegah penguapan pelarut (Clark, 2007). Waktu penjenuhan chamber harus
diperhatikan agar chamber tidak lewat jenuh yang dapat memperlambat proses elusi
dan menghasilkan pemisahan yang kurang baik. Setelah itu dilakukan penotolan
sampel pada plat KLT dengan penotol linomat dengan jarak tiap 1 cm tiap penotolan.
Sampel yang ditotolkan harus memiliki ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin
karena jika sampel yang digunakan terlalu banyak akan menurunkan resolusi. Selain
itu, penotolan sampel yang tidak tepat akan menyebabkan bercak yang menyebar ke
puncak ganda. Pelebaran bercak dapat mengganggu proses scanning dengan
spektrodensitometri

karena

memungkinkan

terjadinya

himpitan

puncak

(Kusmardiyani dan Nawawi, 1992). Selain itu, apabila konsentrasi senyawa pada plat
sangat tinggi adalah maka ketika discanning dengan TLAC-CAMAG SCANNER
sinar yang mengenai sampel akan diabsorbsi oleh lapisan pertama larutan dan hanya
sedikit radiasi yang diserap oleh bagian lain sampel pada jarak yang lebih jauh
sehingga fluoresensi sampel yang berkonsentrasi tinggi ini tidak seragam dan tidak
proporsional dengan konsentrasi senyawa ( Gandjar dan Rohman, 2007). Setelah
dilakukan penotolan sampel, plat yang telah ditotolkan lalu dielusikan pada chamber
yang telah dijenuhkan. Volume fase gerak dibuat sedikit mungkin namun dapat
mengelusi lempeng sampai pada batas jarak pengembangan. Hal ini bertujuan agar
tidak terjadi kontaminasi dari kontaminan selama proses elusi/pengembangan
(Gandjar dan Rohman, 2009).
Setelah proses pengelusian plat selesai, plat dikeringkan pada oven dengan
suhu 800C selama 10 menit. Pengeringan ini bertujuan untuk menguapkan sisa
pelarut yang masih terdapat pada plat KLT sehingga tidak mengganggu proses
scanning dengan spektrofotodensitometer. Suhu yang digunakan disesuaikan dengan
suhu pelarutnya yaitu metanol.elanjutnya dilakukan scanning pada permukaan
lempeng dengan spektrofotodensitometer. Spektrofotodensitometer merupakan suatu
instrumen yang dapat mengukur intensitas radiasi yang direfleksikan dari permukaan
lempeng ketika disinari dengan lampu UV atau lampu sinar tampak. Solut-solut yang
mampu menyerap sinar akan dicatat sebagai puncak (peak) dan pencatat (recorder).
14

Dengan spektrofotodensitometer diperoleh konsentrasi zat aktif dari sampel

paracetamol berdasarkan sifat absorpsi yang dimiliki oleh paracetamol. Paracetamol
mampu berabsorbansi karena paracetamol terdiri dari inti cincin benzena, satu grup
hidroksil, dan atom nitrogen dari grup amida pada posisi para. Hal ini menyebabkan
konjugasi yang luas pada gugus-gugus yang terdapat pada paracetamol (Rusdiana
dkk., tt). Intensitas absorbansi berbanding langsung dengan absorpvitas molar, oleh
karena itu pada analisis fluorometri disarankan penggunaan panjang gelombang yang
memberikan absorpsi maksimal (Gandjar dan Rohman, 2009).

Gambar. Spektrum absorbansi larutan baku paracetamol

Dari praktikum yang dilakukan, diperoleh hasil yang berbeda antara panjang
gelombang maksimum pada percobaan dan literature. Pada literatur menyebutkan
bahwa dalam larutan asam encer, parasetamol menunjukkan absorbansi maksimum
pada 245 nm (Anonim, 2005). Sedangkan, pada praktikum diperoleh panjang

15

gelombang maksimum paracetamol adalah 248 nm, yang terlihat pada spektrum.
Perbedaan ini mungkin disebabkan karena perbedaan kondisi larutan paracetamol
yang digunakan pada praktikum dan saat penetapan panjang gelombang maksimum
pada literatur. Selain itu penyimpanan larutan paracetamol juga berpengaruh pada
hasil yang diperoleh praktikan. Setelah diperoleh kurva baku paracetamol kemudian
dilakukan pengukuran absorbansi sampel paracetamol.
Berikut ini merupakan spektrum absorbansi dari sampel paracetamol:

Gambar. Spektrum absorbansi larutan sampel paracetamol

Dengan membandingkan kedua kurva di atas , terlihat bahwa kurva yang
terbentuk pada sampel hampir sama dengan kurva baku paracetamol sehingga dapat
dipastikan bahwa senyawa yang dibaca absorbansinya adalah memang benar
paracetamol. Dari kurva baku yang dihasilkan,selanjutnya dibandingkan dengan
membaca absorbansi paracetamol pada berbagai konsentrasi. Setelah itu,

16

kurva

absorbansi dicari persamaan garisnya dengan menggunakan regresi linier. Dari hasil
perhitungan didapatkan persamaan regresi sebagai berikut:
y = 2,762x + 599,125

Dimana, y adalah

nilai AUC dan x

adalah

konsentrasi paracetamol.

Persamaan ini diperoleh melalui perhitungan dengan menggunakan kalkulator

scientific Casio fx-570 MS. Kadar dari sampel paracetamol ditentukan dari
perbandingan antara serapan sampel dan bakunya. Dari hasil perhitungan diperoleh
kadar sampel paracetamol yaitu 1399,375 ng .

VII.Kesimpulan
Kadar sampel

paracetamol

yang

spektrofotodensitometri sebesar 1399,375 ng.

17

ditentukan

dengan

metode

KLT-

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2005. Clarkes Analysis of Drug and Poison. London: Pharmaceutical Press
Clark, Jim. 2007. Kromatografi Lapis Tipis. (cited 18 Maret 2011)
http://greenhati.blogspot.com/2009/01/kromatografi-lapis-tipis.html
Depkes RI. 1995. Farmakope Indonesia Edisi Ketiga. Jakarta: Direktorat Jenderal
Pengawasan Obat dan Makanan.
Depkes RI. 1995. Farmakope Indonesia Edisi Keempat. Jakarta: Direktorat Jenderal
Pengawasan Obat dan Makanan.
Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rohman. 2007. Kimia Analisis Farmasi. Yogyakarta
: Pustaka Pelajar
Kusmardiyani, S. dan A. Nawawi. 1992. Kimia Bahan Alam. Jakarta: Universitas
Bidang Ilmu Hayati.

18

Munson, J.W. 1991. Analisis Farmasi Metode Modern. Surabaya: Airlangga

University Press.
Roth, H. J. dan G. Blaschke. 1988. Analisis Farmasi. Yogyakarta: UGM Press.
Rusdiana T., F. Sjuib, dan S. Asyarie. tt. Interaksi Paracetamol, (cited 25 March,
2011). Available from: http://www.chem-is-try.org/paracetamol.pdf
Stahl E. 1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi. Bandung:
Penerbit ITB.
Susanti, dkk, Petunjuk Praktikum Kimia Analisis. Jimbaran : Jurusan Farmasi FMIPA
Universitas Udayana.
Widjaja, I N.K., K.W. Astuti, N.M.P. Susanti, dan I M.A.G. Wirasuta. 2008. Buku
Ajar Analisis Farmasi Fisiko Kimia. Jimbaran: Jurusan Farmasi FMIPA
UNUD.

19

LAMPIRAN 1
DIAGRAM ALIR PROSEDUR KERJA
Disiapkan larutan baku dan sampel (sediaan paracetamol).
Plat dipotong dengan panjang 8 cm x 10 cm.
Plat dicuci dengan metanol sebanyak 10 ml dan kertas saring untuk
menyerap kotaoran dari plat.
Plat diaktivasi selam 30 menit dengan suhu 1200 C.
Chamber dijenuhkan dengan fase gerak.
Larutan sampel, larutan baku dan larutan blanko ditotolkan pada plat
dengan penotol linomat dengan jarak tiap 1 cm tiap penotolan.
Plat yang sudah ditotolkan dielusikan dalam chamber dengan jarak
pengembangan 8 cm.
Plat diangkat dan dikeringkan pada oven dengan suhu 80 oC selama 15
menit.
Plat discanning dengan CAMAG TLC-SCANNER pada = 248 nm.
20

Ditentukan serapan masing-masing komponen pada panjang gelombang

tertentu dengan spektrodensitometer.

LAMPIRAN 2
Tugas :
1. Buat spektrum (puncak absorbsi) masing komponen sampel dan baku.
2. Tentukan serapan (luas area di bawah puncak) tiap spektrum.
3. Hitung kadar sampel parasetamol.
Jawab :
1. a. Spektrum (puncak absorpsi) larutan baku:

b. Spektrum (puncak absorpsi) larutan sampel:

21

2. Serapan tiap spektrum :

a. Larutan baku
AUC larutan baku 1 ( AUC1 )
AUC larutan baku 2 ( AUC2 )
AUC larutan baku 3 ( AUC3 )
AUC larutan baku 4 ( AUC4 )
AUC larutan baku 5 ( AUC5 )

= 864,2
= 1110,5
= 1573,0
= 3098,0
= 4912,5

b. Larutan sampel
AUC larutan sampel ( AUCs )

= 4464,2

3. Kadar Sampel paracetamol:

4. Persamaan regresi linier larutan baku paracetamol yaitu dengan y = 2,762x +
599,125 dengan r = 0.995. Maka konsentrasi sampel dapat dihitung:
y
AUCs
4464,2
4464,2 599,125
2,762x

= 2,762x + 599,125
= 2,762x + 599,125
= 2,762x + 599,125
= 2,762x
= 3865,075

x
= 1399,375 ng
Jadi, kadar sampel parasetamol adalah : 1399,375 ng.

22