FOSFATASE ALCALINA

Ref.: 40

Instrues de Uso

MS 10009010081

Finalidade .

Sistema para determinao da Fosfatase Alcalina em

amostras de sangue por mtodo cintico de tempo fixo e medio de
ponto final.
[Somente para uso diagnstico in vitro.]

Princpio .

A fosfatase alcalina do soro hidrolisa a timolftalena

monofosfato liberando timolftalena, que tem cor azul em meio alcalino. A
cor formada, diretamente proporcional atividade enzimtica, medida
em 590 nm. O produto final da reao se constitui de uma mistura de cor
azul e a cor prpria do substrato.

Caractersticas do sistema . Com base nos trabalhos de King

e
3
Roy , a Labtest concentrou suas pesquisas na timolftalena monofosfato,
um substrato do ster do cido fosfrico. Com a utilizao do substrato
de timolftalena monofosfato possvel a medida direta do produto de
hidrlise, simplesmente alterando o pH.
A modificao no pH promove ao mesmo tempo a interrupo da
atividade enzimtica e a formao de cor azul caracterstica do produto da
reao, que medida fotometricamente.
O substrato de timolftalena monofosfato estvel a temperatura
ambiente sem apresentar hidrlise espontnea e o sistema de medio,
com colorimetria de ponto final, permite ensaios manuais em batelada.
A medio da atividade enzimtica realizada em 10 minutos com
cintica de ordem zero at concentraes iguais a 500 U/L, mostrando
uma resposta linear a atividades enzimticas 12 vezes maiores que os
valores de referncia.

Os reagentes no abertos, quando armazenados nas condies

indicadas so estveis at a data de expirao impressa no rtulo.
Durante o manuseio, os reagentes esto sujeitos contaminao de
natureza qumica e microbiana que podem provocar reduo da
estabilidade.

Precaues e cuidados especiais

Os cuidados habituais de segurana devem ser aplicados na
manipulao de reagentes.
O Reagente de Cor contm hidrxido de sdio que custico e pode
provocar queimaduras. Deve-se tomar cuidado para evitar a ingesto e,
no caso de contato com a pele, mucosa e os olhos, deve-se lavar
imediatamente com grande quantidade de gua e procurar auxlio
mdico.
Como ocorre em toda reao enzimtica, a rigorosa observao do
tempo e da temperatura de incubao de grande importncia para a
qualidade dos resultados obtidos. A diferena de 1 minuto no tempo de
incubao desta dosagem introduz um erro de 10% nos resultados.

Material necessrio e no fornecido

1. Banho-maria mantido temperatura constante (37 C ).
2. Fotmetro capaz de medir, com exatido, a absorbncia entre 580 e
590 nm.
3. Pipetas para medir amostras e reagentes.

4. Cronmetro.

Metodologia . Roy modificado.

Influncias pr-analticas . Citrato, fluoreto, oxalato e EDTA so

Reagentes

inibidores da atividade da fosfatase alcalina porque formam complexos

com o magnsio, que um importante ativador da ao enzimtica.

1.

1 - Substrato - Armazenar entre 15 - 25 C.

Contm timolftalena monofosfato 22 mmol/L. No refrigerar. O reagente
pode apresentar precipitado ou turvao, fato que no interfere na
qualidade do mesmo. Agitar antes de usar. Manter o frasco bem vedado
para evitar evaporao.

2.

- Tampo - Armazenar entre 15 - 25 C.

Contm tampo 300 mmol/L, pH 10,1.

3.

3 - Reagente de Cor - Armazenar entre 15 - 25 C.

Contm carbonato de sdio 94 mmol/L e hidrxido de sdio 250 mmol/L.

4.

- Padro 45 U/L - Armazenar entre 15 - 25 C.

Aps o manuseio sugere-se armazenar bem vedado para evitar

evaporao.

Amostra
Usar soro ou plasma (heparina). A atividade enzimtica estvel 7 dias
entre 2 - 8 C e vrios meses a 20 C negativos.
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padro (POP) que
estabelea procedimentos adequados para colheita, preparao e
armazenamento da amostra. Enfatizamos que os erros devidos amostra
podem ser muito maiores que os erros ocorridos durante o procedimento
analtico.
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras de sangue
no transmitem infeces, todas elas devem ser consideradas como
potencialmente infectantes. Portanto, ao manuse-las deve-se seguir as
normas estabelecidas para biossegurana.
Para descartar os reagentes e o material biolgico, sugerimos aplicar as
normas locais, estaduais ou federais de proteo ambiental.

01 Portugus - Ref.: 40

Interferncias
Valores de Bilirrubina at 38 mg/dL e Triglicrides at 250 mg/dL no
produzem interferncias significativas.
Amostras ligeiramente hemolisadas, com Hemoglobina at 30 mg/dL,
podem ser toleradas, mas hemlises mais acentuadas no devem ser
aceitas porque produzem resultados falsamente diminudos.
Valores de Triglicrides acima de 250 mg/dL produzem resultados
falsamente elevados por interferncia fotomtrica. A ao deste
interferente pode ser minimizada com o uso do branco da amostra, que
aplicvel para valores de Triglicrides at 1800 mg/dL.
Para avaliar a concentrao aproximada da Hemoglobina em uma
amostra hemolisada, pode-se proceder do seguinte modo: Diluir 0,05 mL
da amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L (0,85%) e medir a
absorbncia em 405 ou 415 nm, acertando o zero com gua deionizada
ou destilada.

O procedimento sugerido para a medio adequado para fotmetros

cujo volume mnimo de soluo para leitura igual ou menor que 2,5 mL.
Deve ser feita uma verificao da necessidade de ajuste do volume para o
fotmetro utilizado. Os volumes de amostra e reagente podem ser
modificados proporcionalmente, sem prejuzo para o desempenho do
teste, e o procedimento de clculo se mantm inalterado. Em caso de
reduo dos volumes fundamental que se observe o volume mnimo
necessrio para a leitura fotomtrica. Volumes da amostra menores que
0,01 mL so crticos em aplicaes manuais e devem ser usados com
cautela porque aumentam a impreciso da medio.

Clculos . Ver linearidade.

Absorbncia do Teste
Fosfatase Alcalina (U/L) =

x 45
Absorbncia do Padro

Exemplo
Absorbncia do Teste = 0,295
Absorbncia do Padro = 0,360

Hemoglobina (mg/dL) Absorbncia405 x 601

Hemoglobina (mg/dL) Absorbncia415 x 467

0,295
Fosfatase Alcalina (U/L) =

Minimizao da ao de interferentes

x 45 = 37
0,360

Branco da Amostra . Misturar 2,5 mL de NaCl 150 mmol/L (0,85%) com

0,05 mL da amostra. Medir a absorbncia em 590 nm, acertando o zero
com gua destilada ou deionizada. Subtrair a absorbncia assim obtida,
da absorbncia do teste e calcular a concentrao. Este sistema de
correo aplicvel apenas nos casos em que a amostra produz
interferncia fotomtrica.

Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com a metodologia

o mtodo do fator pode ser empregado.
45
Fator de calibrao =
Absorbncia do Padro
Fosfatase Alcalina (U/L) = Absorbncia do Teste x Fator

Procedimento
Ver observaes 1 e 2.

Exemplo

Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:

Fator de calibrao =

45
= 125
0,360

Substrato (N 1)
Tampo (n 2)
Padro (N 4)

Branco
0,05 mL
0,5 mL

Teste
0,05 mL
0,5 mL

Padro
0,05 mL
0,5 mL
0,05 mL

Incubar em banho-maria a 37 C durante 2 minutos. O nvel da gua no

banho deve ser superior ao nvel dos reagentes nos tubos de ensaio. No
remover os tubos do banho-maria para adicionar a amostra.
0,05 mL

Amostra

Misturar e incubar em banho-maria a 37 C durante 10 minutos

(cronometrados).
Reagente de Cor (n 3)

2,0 mL

2,0 mL

2,0 mL

Misturar e determinar as absorbncias do teste e padro em 590 nm ou

filtro laranja (580 a 590), acertando o zero com o branco. A cor estvel
120 minutos.

02 Portugus - Ref.: 40

Fosfatase Alcalina (U/L) = 0,295 x 125 = 37

Linearidade
O resultado da medio linear, com cintica de ordem zero, at 500 U/L.
Quando a absorbncia do teste for maior que 2,0, diluir o teste e o branco
com o Reagente de Cor, fazer nova leitura e multiplicar o resultado obtido
pelo fator de diluio. Se aps a diluio for obtido um valor igual ou maior
que 500 U/L, repetir a medio reduzindo o tempo de incubao aps a
adio da amostra, para 2 minutos. Multiplicar o resultado obtido por 5.

Controle interno da qualidade . O laboratrio deve manter um

programa de controle interno da qualidade que defina claramente os
regulamentos aplicveis, objetivos, procedimentos, critrios para
especificaes da qualidade e limites de tolerncia, aes corretivas e
registro das atividades. Materiais de controle devem ser utilizados para
avaliar a impreciso e desvios da calibrao. Sugere-se que as
especificaes para o coeficiente de variao e o erro total sejam
6.7
baseadas nos componentes da variao biolgica (VB) .

Intervalo de referncia . Estes valores devem ser usados apenas

como orientao. Recomenda-se que cada laboratrio estabelea, na
populao atendida, sua prpria faixa de valores de referncia.
Adultos . 13 a 43 U/L.
Crianas at 12 anos . 56 a 156 U/L.
Definio de Unidade: uma unidade igual a quantidade de enzima que
libera por hidrlise, 1 micromol de timolftalena por minuto, por litro de
soro nas condies do teste.
8

Caractersticas do desempenho

Exatido . Em duas amostras com valores de fosfatase alcalina iguais

a 56 e 159 U/L foram adicionadas quantidades diferentes da enzima,
obtendo-se recuperaes entre 100 e 112%. O erro sistemtico
proporcional mdio obtido em um valor de 50 U/L foi igual a 2,5 U/L ou
5,0%.
Especificidade . O mtodo proposto foi comparado com o mtodo
PNP Labtest utilizando 80 amostras com valores situados entre
17 e 182 U/L. A comparao resultou na equao da regresso: y = 13,4
+ 0,307x e um coeficiente de correlao (r) igual a 0,96. evidente uma
correlao positiva entre os dois mtodos, observando-se uma diferena
sistemtica de 42% quando se usa um nvel de deciso igual a 50 U/L, que
explicada pela diferena entre os substratos e as metodologias
utilizadas.

Repetitividade - Impreciso intra-ensaio

Amostra 1
Amostra 2

N
20
20

Mdia
50
91

DP
1,20
1,47

CV (%)
2,4
1,6

Amostra 1
Amostra 2

Mdia
52
88

DP
1,16
2,30

Nveis elevados de fosfatase alcalina ocorrem tambm em pacientes com

doenas obstrutivas das vias biliares, metstases hepticas, doenas
granulomatosas e na cirrose heptica. Nas doenas hepatocelulares
como a hepatite aguda viral, em geral ocorre um ligeiro aumento da
enzima.
Nveis diminudos da fosfatase alcalina so encontrados na desnutrio
crnica, na hipofosfatasemia e, ocasionalmente, no hipotireoidismo e
anemia perniciosa.

Observaes
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado so fatores
fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obteno de resultados
corretos.

2. O laboratrio clnico tem como objetivo fornecer resultados exatos e

precisos. A utilizao de gua de qualidade inadequada uma causa
potencial de erros analticos. A gua deionizada ou destilada utilizada no
laboratrio deve ter a qualidade adequada a cada aplicao. Assim, para
preparar reagentes, usar nas medies e para uso no enxge final da
vidraria, deve ter resistividade 1 megaohm.cm ou condutividade
1 microsiemens/cm e concentrao de silicatos <0,1 mg/L. Quando a
coluna deionizadora est com sua capacidade saturada ocorre produo
de gua alcalina com liberao de vrios ons, silicatos e substncias
com grande poder de oxidao ou reduo que deterioram os reagentes
em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de modo
imprevisvel. Assim, fundamental estabelecer um programa de controle
da qualidade da gua.

3. A metodologia tem uma grande especificidade para as fosfatases de

Reprodutibilidade - Impreciso total

N
20
20

Nveis elevados de fosfatase alcalina ocorrem em pacientes

com doenas sseas caracterizadas por aumento da atividade
osteoblstica como a osteite deformante, raquitismo, osteomalcia,
hiperparatireoidismo, metstase ssea, sarcoma osteognico e doena
de Paget.

CV (%)
2,4
2,6

origem heptica, ssea e intestinal, o que no ocorre para a isoenzima de

origem placentria. Por isso, soros controle que possuem atividades
elevadas desta isoenzima fornecem resultados mais baixos.

4. Para uma reviso das fontes fisiopatolgicas e medicamentosas de

Sensibilidade metodolgica . Utilizando-se a absorbncia do

interferncia nos resultados e na metodologia sugere-se consultar

www.fxol.org .

padro como parmetro, o limite de deteco fotomtrica 0,125 U/L,

correspondendo a uma absorbncia igual a 0,001.

Referncias

Efeitos da diluio da matriz .

Duas amostras com valores

iguais a 844 e 1026 U/L foram utilizadas para avaliar a resposta do
sistema na avaliao da diminuio do tempo de incubao. Usando
tempos de incubao que variaram de 1 a 5 minutos, encontrou-se
recuperaes entre 95 e 103%.

Significado clnico . A fosfatase alcalina produzida por muitos

tecidos, principalmente pelos ossos, fgado, intestinos e placenta, e
excretada pela bile. A dosagem srica desta enzima particularmente til
na investigao das doenas hepatobiliares e sseas.

03 Portugus - Ref.: 40

1. Coleman CM, Stroje RC. Clin Chim Acta 1966;13:401.

2. King EJ. J Path Bact. 1943;55:31.
3. Roy AV. Clin Chem 1970;16:431.
4. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories, Warner-Chilcott
Laboratories, Diagnostic Reagents Division, Scarborough, Canada,
1972.
5. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T.l981;27:493-501.

6. Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa Molecular,

B a s e d e D a t o s d e Va r i a c i n B i o l g i c a . D i s p o n v e l
em:<http://www.seqc.es/ar ticle/ar ticleview/330/1/170>
(acesso em 04/2006).
7. Basques JC. Especificaes da Qualidade Analtica. Labtest
Diagnstica 2005.

Informaes ao consumidor
[Termos e Condies de Garantia]
A Labtest Diagnstica garante o desempenho deste produto dentro das
especificaes at a data de expirao indicada nos rtulos desde que os
cuidados de utilizao e armazenamento indicados nos rtulos e nestas
instrues sejam seguidos corretamente.

8. Labtest: Dados de arquivo.

Labtest Diagnstica S.A.

Apresentao
Produto

Referncia
1

Fosfatase Alcalina

CNPJ: 16.516.296 / 0001 - 38

Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - Vista Alegre - CEP 33400-000
Lagoa Santa . Minas Gerais Brasil - www.labtest.com.br

Contedo
2

40

1 X 5 mL
1 X 50 mL
1 X 200 mL
1 X 3 mL

Servio de Apoio ao Cliente

e-mail: sac@labtest.com.br

0800 031 34 11 (Ligao Gratuita)

Copyright by Labtest Diagnstica S.A.

Reproduo sob prvia autorizao

Reviso: Junho, 2009

Ref.: 170309

Smbolos utilizados com produtos diagnsticos in vitro

Smbolos usados con productos diagnsticos in vitro . Symbols used with ivd devices
Contedo suficiente para < n > testes
Contenido suficiente para < n > tests
Contains sufficient for < n > tests

Consultar instrues de uso

Consultar instrucciones de uso
Consult instructions for use

Controle
Control
Control

Txico
Txico
Poison

Data limite de utilizao (aaaa-mm-dd ou mm/aaaa)

Estable hasta (aaaa-mm-dd o mm/aaaa)
Use by (yyyy-mm-dd or mm/yyyy)

Nmero do catlogo
Nmero de catlogo
Catalog Number

Controle negativo
Control negativo
Negative control

Reagente
Reactivo
Reagent

Controle positivo
Control positivo
Positive control

Fabricado por
Elaborado por
Manufactured by

Nmero do lote
Denominacin de lote
Batch code

Material Calibrador
Material Calibrador
Calibrator Material

Adies ou alteraes significativas

Cambios o suplementos significativos
Significant additions or changes

Material Calibrador
Material Calibrador
Calibrator Material

Produto diagnstico in vitro

Dispositivo de diagnstico in vitro
In vitro diagnostic device

Controle
Control
Control

Limite de temperatura (conservar a)

Temperatura limite (conservar a)
Temperature limitation (store at)

Liofilizado
Liofilizado
Lyophilized

Risco biolgico
Riesgo biolgico
Biological risk

Representante Autorizado na Comunidade Europeia

Representante autorizado en la Comunidad Europea
Authorized Representative in the European Community

Corrosivo
Corrosivo
Corrosive

Marca CE
Marcado CE
CE Mark

Ref.: 170309

04 Portugus - Ref.: 40