HPLC

Iswandi S.Si., M. Farm. Apt.

Fakultas Farmasi USB

HPLC
High Performance Liquid Chromatography
High Pressure Liquid Chromatography
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Atau dapat disingkat LC

Chromatography
Liquid
High Pressure

teknik pemisahan

Fase gerak berupa cairan

digunakan tekanan tinggi

untuk mengalirkan fase gerak melalui kolom

HPLC
Dikembangkan pada awal 1970-an
Dewasa ini merupakan teknik paling banyak
digunakan untuk pemisahan dan analisis dari
berbagai bidang seperti farmasi, bioteknologi,
lingkungan, polimer dan makanan.
Merupakan method of choice for the analysis of
a wide variety compounds

Keunggulan dan Kelemahan HPLC

Keunggulan

Kelemahan

Dilakukan pada suhu

kamar
Analisis kuantitatif yang
cepat dengan presisi dan
akurasi yang tinggi
Dapat dioperasikan secara
otomatis
Sensitivitas detektor yang
tinggi
Dapat diaplikasikan untuk
berbagai analit dalam jenis
sampel yang lebih luas

Sulit ditemukan
detektor yang
universal
Efisiensi pemisahan
lebih rendah daripada
GC
Lebih rumit dalam
pelaksanaannya
Lebih mahal

Klasifikasi HPLC Berdasarkan

Mekanisme
Kromatografi adsorpsi (adsorption
chromatography)
Kromatografi Partisi (partition chromatography)
Kromatografi Pertukaran ion (ion exchange
Chromatography)
Size exclusion chromatography (SEC)
Kromatografi Permeasi Gel
Kromatografi Filtrasi Gel

Fase normal dan Fase terbalik

Normal Phase (Fase normal)
Fase diam polar dan fase gerak non polar
Contoh Fase gerak: Chloroform, heksana
dll.

Reversed Phase (Fase terbalik)

Fase diam non polar dan fase gerak polar

Contoh fase gerak: air, metanol, asetonitril

dll.

Kromatografi Fase Normal

Disebut juga kromatografi
cair-padat atau kromatografi
adsorpsi (adsorption
chromatography)
Pemisahan didasarkan atas
adsorpsi/desorpsi analit pada
fase diam polar (silika atau
alumina)
Analit polar lebih tertahan
daripada analit non polar
karena gugus silanol pada
silika.

Kromatografi Fase terbalik

Pemisahan didasarkan atas
koefisien partisi analit dalam
fase diam dan fase gerak
Urutan elusi: analit polar terelusi
lebih dahulu, analit non plar
terelusi terakhir
Cocok untuk analisis zat-zat
yang larut dalam air, semipolar
atau beberapa senyawa non
polar.
Untuk analit berupa ion dapat
dianalisis dengan RP-HPLC
menggunakan dapar dan teknik
pasangan ion (ion-pair).

Instrumentation

Gradient
Controller

Column

Pump
Mobile Phases

Detector
Injector

Instrumentation

Instrumentation
Degasser
70 mbar
A

Pump

B
C
Eluent

Detector

Gradient mixer
Column

Fase Gerak
Fase gerak
diletakkan dalam
botol-botol
reservoir.

Fase Gerak
Zat cair yang
digunakan sebagai
fase gerak harus
saling campur.

HPLC Mobile Phase

High solubility for the sample components

Non corrosive to HPLC system components
High purity, low cost, UV transparency
Others: low viscosity, low toxicity, non
flammability

Reversed-phase mobile phases

Water
Methanol
Acetonitrile
THF
Additives, salts, acids, bases
Ion pairing

Kemurnian Fase gerak

Diperlukan solvent dengan
kemurnian tinggi
Adanya pengotor
(impurities) pada solvent
dapat menimbulkan
gangguan analisis.
Gunakan HPLC grade
Air sebagai fase gerak:
digunakan water for
injection

Solvent

UV Cutoff (nm)

Acetonitrile
Water
Cyclohexane
Hexane
Methanol
Ethanol
Diethyl Ether

190
190
195
200
210
210
220

Dichloromethane

220

Chloroform
Carbon Tetrachloride

240
265

Tetrahydrofuran

280 (220)

Toluene

285

Isocratic and Gradient Elution

Isocratic elution:
Constant mobile phase composition during run

Gradient elution:
Programme a changing (stepwise or continuous) mobile
phase composition during the run
For more complex
mixtures

Gradient Analysis
Advantages:
Better suited for complex samples
Better resolution of early and late eluting peaks
Better sensitivity of late eluting peaks
Higher peak capacity (fit more peaks in the
chromatogram)
Disadvantages
More complex HPLC instrument
Method development, implementation and transfer are
more difficult
Typically longer analysis times since column must be
calibrated with initial mobile phase

Degasser
Menghilangkan udara (gas nitrogen dan oksigen)
yang terlarut.
Adanya udara dapat menimbulkan variasi tekanan
pada pompa atau timbulnys noise pada detektor
tertentu (RID, FLD dan Amperometric Detector)
Cara: vacuum degassing, pengaliran gas helium
atau ultrasonikasi.

Pompa HPLC
Pompa Pencampur
untuk menarik solvent
fase gerak dari botol reservoir
Pompa Analisis
mengalirkan fase gerak ke
dalam kolom
Sistem Pompa:
Tekanan Tinggi
Tekanan rendah

van Deemter Equation

H = A + B/u +(Cs + Cm)u

H = A + B/u + Cu
A = 2 dp

depends on particle size distribution, the

narrower the distribution the smaller the
dp = particle size
Independent of mobile phase flow rate
Also known as eddy diffusion

Skoog and Leary: Principals of Instrumental Analysis, 5th ed. Suanders, 1998

Longitudinal Diffusion (B)

H = A + B/u + Cu
B/u = 2DM/u
1.

= constant depending on
quality of packing

2.

DM is the mobile phase

diffusion coefficient

3.

Inversely related to mobile

phase flow rate

Mass Transfer (Cs + Cm)

H = A + B/u + (Cs + Cm)u

CS = fS(k)df2 / DS
CM = fM(k)dp2 / DM

DM is the mobile phase diffusion

coefficient
DS is the stationary phase
diffusion coefficient
df is film thickness
dp is particle size
Directly related to mobile phase
flow rate

Skoog and Leary: Principals of Instrumental Analysis,

5th ed. Suanders, 1998

Pada : HPLC Mengapa perlu tekanan

tinggi?
Pada HPLC digunakan ukuran partikel packing kolom
(silika) yang sangat kecil, umumnya 3-10um.
Faktor C pada hukum van Deemter sebanding dengan
dp2
Ukuran partikel makin kecil
luas permukaan makin
besar
transfer massa dari fase gerak ke fase diam
atau sebaliknya makin besar
kolom semakin efisien
dan resolusi peak semakin baik.
Penggunaan ukuran partikel kecil
diperlukan tekanan
tinggi
Pada kecepatan alir 0.5 sampai 5 ml/menit, panjang
kolom 10-30 cm dibutuhkan tekanan 70-400 atm (1000
6000 psi)

Van Deemter Plot (smaller particles have smaller A & C terms)

Pressure =

Force
Area

(force = mass x acceleration)

Units of Pressure
1 pascal (Pa) = 1 N/m2
1 atm = 760 mmHg = 760 torr
1 atm = 101,325 Pa
1 atm = 1,013 bar = 14,7 psi
(Pound-force per square inch)
psi = lb/in2 = 6894.757 Pa

Barometer

5.2

Sample Injection
Load and Inject -Position

Load Inject
Position

Sample Injection
Load and Inject -Position

HPLC Columns
Column: the key part of the
separation

HPLC Column Categories

Column Hardware: Standard or Cartridge,
stainless, PEEK, titanium
Chromatographic Modes: Normal-phase (NPC),
reversed-phase (RPC), ion-exchange (IEC), size
exclusion (SEC)
Dimensions (: Prep, semi-prep, analytical, fast
LC, micro, nano
Support Types: Silica, polymer, zirconia, hybrid

HPLC Column: Specification

CS-Chromatographie Service
Multospher 120 RP-18 HP 5

Length x ID
Art.-Nr. xxxx HPLC-column 250x3 mm
Multospher 120 RP-18 HP-5
Ch. 70801
Column-Nr. 0103-01 Flow --------

Particle size in m
Modification of silicagel
Pore size (Angstrm)
Producer of silica gel
Flow direction

HPLC Columns
Column Dimensions
Length and internal diameter of packing bed
Short (30-50mm) - short run times, low backpressure
Long (250-300mm) - higher resolution, long run times
Narrow ( 2.1mm) - higher detector sensitivity
Wide (10-22mm) - high sample loading

Particle Shape
Spherical or irregular
Spherical particles
reduced back
pressures and longer column life

HPLC Columns
Particle Size
The average particle diameter,
typically 3-20m
Smaller particles offer higher efficiency
but also cause higher backpressure
< 2m
UPLC

Surface Area
Sum of particle outer surface and interior pore
surface, in m2/gram
High surface area generally provides greater
retention, capacity and resolution
Low surface area packings generally
equilibrate quickly, especially important in
gradient analyses.

Van Deemter Plot (smaller particles have smaller A & C terms)

Particle Size and Column Performance

(300 psi)
(1300 psi)
(10,000 psi)
(34,000 psi)

HPLC Columns: Particle Physical Characteristics

Pore Size
Average size of pores or cavities in
particles, ranging from 60-10,000
Larger pores allow larger solute
molecules to be retained longer through
maximum exposure to the surface area
of the particles.
Choose a pore size of 150 or less for
sample MW 2000.

Chromatography Stationary Phases

Silica Gel

Derivatized Silica Gel

O
O
O
|
|
|
OSiOSiOSiOH
|
|
|
O
O
O
|
|
|
OSiOSiOSiOH
|
|
|
O
O
O

O
O
O
|
|
|
OSiOSiOSiOR
|
|
|
O
O
O
|
|
|
OSiOSiOSiOR
|
|
|
O
O
O

bulk (SiO2)x

surface

bulk (SiO2)x

surface

relatively polar surface

relatively nonpolar surface

normal phase

reversed phase

Where R = C18H37
hydrocarbon chain
(octadecylsilyl deriv.
silica or C18)

Bonded Phases
C-2

Ethyl Silyl

-Si-CH2-CH3

C-8

Octyl Silyl

-Si-(CH2)7-CH3

C-18

Octadecyl Silyl

-Si-(CH2)17-CH3

CN

Cyanopropyl Silyl

-Si-(CH2)3-CN

HPLC Columns: Particle Physical Characteristics

Carbon Load
Amount of bonded phase attached to
base material, expressed as %C
Higher carbon loads generally offer greater
resolution and longer run times.
Low carbon loads shorten run times and
many show a different selectivity.

Endcapping
Capping of exposed silanols with short
hydrocarbon chains after the primary
bonding step

Protection of Siloxane Bonds With Bulky Alkyl Groups

Recommended starting conditions for RP-HPLC

Column: C18 or C8, endcapped

Particle Size: 3 - 5m
Dimensions:
50-100 mm x 4.6 mm i.d

for simple samples (e.g. assays

of the main component)

100-150 mm x 3.0-4.6 mm i.d

for purity testing or
Component of complex samples
20-150mm x 2.0mm i.d

for LC/MS

Pemeliharaan kolom
Kolom umumnya tahan 3-24 bulan atau 1000-3000
x injeksi tergantung jenis fase gerak dan sampel
Tutup ujung kolom bila tidak dipakai
Cuci kolom sebelum dan sesudah digunakan
Gunakan guard column (jika bekerja dengan
sampel-sampel kotor)
Untuk kolom silika, jangan bekerja di luar pH yang
diperbolehkan
Hindari bekerja pada temperatur tinggi

HPLC Detectors
To detect the separated analytes

An ideal Detector:
UNIVERSAL (i.e. detects everything)
SENSITIVE (i.e. detects a very small amount of analytes)
LINEAR RESPONSE (i.e. linear relationship between
intensity of response and amount of analyte).
give STRUCTURAL INFORMATION (i.e. tell you what the
analyte is, even if you didnt know beforehand).

HPLC Detectors

UV-Vis Detector
Photodiode array Detector (PDA = DAD)
Refractive Index Detector (RID)
Fluorescence Detector (FLD)
Evaporative Light Scattering Detector (ELSD)
Electrochemical Detector (ECD)
Conductivity Detector
Radiometric Detector

Hyphenated Systems
LC-MS; LC-MS/MS; LC-NMR

HPLC Detectors
UV-Vis
Good detection limits (0.1-1 ng; linear range 105)
Can be used with gradient elution
Requires chromophore
Refractive Index
Poor detection limits (100-1000 ng; linear range 102)
Isocratic only
Nearly universal detection
Evaporative Light Scattering
Good detection limits (0.1-1 ng; linear range 105);
Non-linear calibration required
Can be used with gradient elution
Nearly universal detection

Pilihan pertama
UV/Vis atau DAD
Untuk analit non chromophor
RID atau ELSD

UV-Vis Detector
Paling banyak digunakan
Tersusun dari Lampu deuterium, monokromator dan flow
cell
Monokromator terdiri dari grating atau prisma yang dapat
bergerak dan dapat memilih panjang gelombang spesifik
yang masuk melalui celah (slit)
190 600nm
Ditambah lampu tungsten untuk meningkatkan
sensitivitas pada daerah visibel.
Macam UV-Vis:

Fixed wave length

Variable wave length
Multiple variable wave length
Photo diode-array

UV-Vis Detector
Lamp

Cut-off filter
Holmium oxide filter

Slit
Sample diode
Mirror 1

Grating

Flow cell

Mirror 2
Reference diode

UV-VIS Diode Array Detector

PDA
Disebut juga diode array detector
Untuk mengukur spektrum UV dari peak yang
terelusi
Mampu melakukan identifikasi peak
Sensitivitas detektor lebih rendah pada model
terdahulu tetapi pada model terkini memiliki
sensitivitas tinggi
PDA umumnya menggunakan charge coupled
diode-array with 512-1,024 diode (or pixels)
mampu resolusi spektro 1 nm.

PDA
Dengan software pengevaluasi spektra
dapat
menampilkan kromatogram dan spektra sampel
Dapat mengenali panjang gelombang maksimum,
peak matching (menghitung match factor atau
MF), library search dan evaluasi kemurnian peak
(peak purity)
Dapat menampilkan 3-D spektra dan countor
maps.

Overlay spectra

200

250

300

350

400

nm

Peak Purity test: HPLC

Spektra UV/Vis analit dan zat standar (authentic
reference material) dengan diode array detector
overlay
Evaluasi korelasinya (r, MF, FTIR, MS)
Pengukuran spektra pada upslope,
apex dan down slope
Peak harus pure

Match Factor

MF = 1000
r = 1 100% pure peak
MF > 990
pure
MF < 900
not pure
900 < MF < 950
contaminated

Pure and Impure HPLC peaks

Peak purity tests can also be evaluated with

The 3D-spectra of Photodiode array detectors
Mass spectrometry

Comparison by 3 Point Spectrum

Acetyl Salicylic Acid

up slope, peak top

down slope

Refractive index
Mengukur perubahan indeks refraksi antara sel sampel
yang mengandung analit yang terelusi dengan sel
pembanding.
Sensitivitas lebih rendah (0,01-0,1 ug)
Dapat mendeteksi hampir semua senyawa dan digunakan
umumnya untuk analit yang memiliki gugus kromofor
lemah seperti gula, trigliserida, asam-asam organik dll.
Detektor standar untuk GPC
Tidak dapat digunakan untuk gradien

Refractive Index Detector

Evaporative Light Scattering Detector

Memilih Panjang Gelombang

Detektor UV

Pemilihan
Panjang
Gelombang
(UV)