DIAGNOSTICO SEROLOGICO HEPATITIS B

INTRODUCCIN
La hepatitis B es una enfermedad producida por un virus (VHB) que posee un DNA de
pequeo tamao que pertenece a la familia de los hepadnaviridae. Tiene predileccin por
los hepatocitos dando lugar a un cuadro agudo o a una infeccin persistente (portador
crnico) que en ocasiones evoluciona a hepatitis crnica, cirrosis o carcinoma
hepatocelular.
El virus se transmite por contacto con la sangre u otros lquidos corporales de una
persona infectada.
El virus de la hepatitis B puede provocar una enfermedad aguda cuyos sntomas, que
pueden durar varias semanas, incluyen coloracin amarillenta de la piel y la esclertica
ocular (ictericia), orina oscura, cansancio intenso, nuseas, vmitos y dolor abdominal.
El perodo medio de incubacin de la hepatitis B es de 75 das, pero puede oscilar
entre 30 y 180 das. El virus, que se puede detectar entre los 30 y los 60 das de la
infeccin, persiste durante un perodo de tiempo variable.
Los marcadores sricos ms importantes en la prctica clnica para el diagnstico de la
hepatitis B son: el antgeno de superficie (HBsAg), los anticuerpos frente a este antgeno
(anti-HBs), el antgeno e (HBeAg), los anticuerpos frente a este antgeno (anti-HBe) y los
anticuerpos frente a las protenas del core (anti-HBc), que a su vez incluyen el anti-HBc
IgM y los anti-HBc totales (IgM e IgG).
OBJETIVO
-Determinar la presencia del antgeno de superficie del virus de la hepatitis B en suero
mediante la tcnica de ELISA.

INMUNOLOGA II

Pgina 1

DIAGNOSTICO SEROLOGICO HEPATITIS B

HEPATITIS B: DIAGNOSTICO SEROLOGICO
El diagnstico de laboratorio de la hepatitis B se centra en la deteccin del antgeno
superficial del virus de la hepatitis B (HBsAg). La OMS recomienda que se analice la
presencia de este marcador en todas las donaciones de sangre, a fin de evitar la
transmisin del virus a los receptores.

La infeccin aguda se caracteriza por la presencia del HBsAg y de

inmunoglobulina M (IgM) en el antgeno del ncleo HBcAg. En la fase inicial de la
infeccin los pacientes tambin son seropositivos para el HBeAg.

La infeccin crnica se caracteriza por la persistencia (ms de seis meses) del

HBsAg (con o sin concurrencia de HBeAg). La persistencia de HBsAg es el principal
marcador del riesgo de ulterior desarrollo de hepatopata crnica y carcinoma
hepatocelular.
MARCADORES SEROLOGICOS:
HBs Ag: Antgeno de superficie, aparece al final del periodo de incubacin, si la evolucin
es favorable, desaparece antes de que se normalicen las aminotransferasas y, en caso de
cronificacin, persiste indefinidamente. til para detectar portador crnico.
Infeccin actual.
Portador (detectable a los seis meses de la hepatitis).
HBsAc: Anticuerpo de superficie, aparece semanas despus de la normalizacin
analtica y de la desaparicin del HBsAg. Hay una fase en la que no se detecta periodo
ventana. Su positividad indica immunocompetencia e inmunoproteccin frente VH-B.
Infeccin Pasada.
Inmunizacin.
HBcAc: Anticuerpo del core, aparece en las primeras fases de enfermedad y persiste
indefinidamente.
IgG indica infeccin crnica o pasada.
IgM indica infeccin aguda (marcador eleccin hepatitis aguda VHB, positivo

incluso en periodo ventana [HbsAg]).

HbeAg: Antgeno e. Se detecta cuando existe una elevada replicacin viral, alta
infecciosidad.
Replicacin activa e infectividad.
HBeAc: Anticuerpo e. Aparece tras negativizarse el HBeAg. Su positividad indica
evolucin favorable y baja infecciosidad. En la hepatitis crnica su presencia es paralela al
HBsAg.
Cese de la replicacin (excepto en formas mutantes procore e menos).
INMUNOLOGA II

Pgina 2

DIAGNOSTICO SEROLOGICO HEPATITIS B

INTERPRETACION DE LAS PRUEBAS SEROLOGICAS

INMUNOLOGA II

Pgina 3

DIAGNOSTICO SEROLOGICO HEPATITIS B

DETECCIN DEL ANTIGENO DE SUPERFICIE DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B

El antgeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) aparece en el suero de 1-10 semanas
tras la exposicin aguda al VHB, y lo hace antes del comienzo de la sintomatologa clnica
y de la elevacin de la alanina-aminotransferasa (ALT) srica. Su persistencia al cabo de
6 meses implica infeccin crnica. Por otro lado, los pacientes en los que se detecta
HBsAg en el suero que no presentan marcadores de replicacin viral, ni signos de lesin
heptica se conocen como portadores sanos del VHB.
SEGN LA TECNICA DE ELISA:
FUNDAMENTO DEL METODO:

HBsAg ELISA es un mtodo inmunoenzimatico directo tipo sndwich. Los pocillos de las
policubetas estn recubiertos con anticuerpos anti HBs (anti-HBsAg) que acta como
anticuerpo de captura. La muestra se incuba en los pocillos. Si la misma contiene HBsAg,
este formara un complejo con el anticuerpo unido a la placa. El material no unido se
elimina por lavado. En el siguiente paso se agrega un anticuerpo de cabra anti HBs
conjugado con enzima, que se unir a los complejos formados. El conjugado no unido se
remueve mediante lavado. Posteriormente se agrega una solucin contendiendo
tetrametilbencidina y perxido d hidrogeno, luego se para la reaccin con cido sulfrico.

INMUNOLOGA II

Pgina 4

DIAGNOSTICO SEROLOGICO HEPATITIS B

PROCEDIMIENTO:
Componentes del Kit:

Pocillos de microtitulacin en tiras separables, cada una

ellas con ocho pocillos individuales recubiertos
con Anti-HBs (En total son 96). 1 bastidor.

Recubiertas con anticuerpos

monoclonales de ratn que tiene la

misma reactividad.
Control positivo (listo para usar)
Control negativo (listo para usar)
Anti-HBs-HRP-conjugado(Anticuerpo de cabra
anti-HBs conjugado con peroxidasa de rbano

picante)
Concentrado de dilucin de lavado
Solucin buffer.
Cromgeno: 3,3', 5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB)
disuelta en dimetilsulfxido (DMSO)

Material necesario pero no suministrado

- solucin de parada 0.45M

-fotmetro para placas de microtitulacin con filtro.
- incubadora a 37 C
- cmara de hmeda
- agua destilada
-pipetas automticas y tips
Papel toalla.

Procedimiento de la prueba:
INMUNOLOGA II

Pgina 5

de

DIAGNOSTICO SEROLOGICO HEPATITIS B

Prepare una hoja de protocolo

2
Muestra 43

3
Muestra 6

4
Muestra 15

5
Muestra 18

6
Muestra26

Muestra 44

Muestra 7

Muestra 16

Muestra 19

Muestra28

Muestra 45

Muestra 8

Muestra29

Muestra 46

Muestra 9

Muestra 21

Muestra 30

Muestra 1

Muestra 10

Muestra 22

Muestra31

Muestra 2

Muestra 11

Muestra 23

Muestra32

Muestra 41

Muestra 3

Muestra 12

Muestra 24

Muestra33

Muestra 42

Muestra 5

Muestra13

Control
negativo
Control
negativo
Control
negativo
Control
positivo
Control
positivo
Muestra 17

Muestra 20

1
Control
negativo
Control
negativo
Control
negativo
Control
positivo
Control
positivo
Muestra 40

Muestra 25

Muestra34

A
B
C
D
E

Preparacin de Solucin de lavado

Diluya la solucin amortiguadora de lavado (V1) 1:10 con agua destilada hasta un
volumen final de V2 .
Concentrado de solucin Volumen final (V2)
amortiguadora (V1)
100 ml 1.000 ml

Preparacin de solucin substrato

Diluya cromgeno TMB en DMSO (V1) 1:50 con buffer sustrato hasta un volumen final
de V2
TMB- cromgeno (V1)
1 ml

+49ml

INMUNOLOGA II

buffer
50 ml

Pgina 6

Volumen final (V2)

DIAGNOSTICO SEROLOGICO HEPATITIS B

Aada 50 l de conjugado
Aada 100 ul muestra y controles listos para
usar en los pocillos apropiados de las tiras de
prueba de microtitulacin.

Incubacin de la muestra durante 60 minutos

(+/- 5 min) a 37 C (+/- 1C)
Tras la incubacin lave todos los pocillos con
solucin de lavado.5x
Squelo dando ligeros golpecitos a la placa de
microtitulacin sobre una toallita de papel.
papel

Aada 100 l de solucin de sustrato listo para

usar a cada pocillo.
Incubacin del sustrato durante 30 minutos a
temperatura de ambiente en cmara humeda.

INMUNOLOGA II

Pgina 7

DIAGNOSTICO SEROLOGICO HEPATITIS B

Aada 100 l de solucin de parada H2SO4

0.45 M a cada pocillo, agite suavemente la
placa de microtitulacin para mezclar.

Lectura de la extincin
Lea la densidad ptica (DO) a 405 nm

INMUNOLOGA II

Pgina 8

DIAGNOSTICO SEROLOGICO HEPATITIS B

RESULTADOS

Primero calculamos el valor del control negativo (NCx)

Control negativo
1
2
3
Total

Absorbancia
0.121
0.056
0.076
0.253

NCx = Total de absorbancia = 0.253 = 0.084

3
3

Segundo calculamos el valor Cut-Off (CO)

CO = NCx + 0.025 =0.084 + 0.025 =0.109

REPORTE:
No Reactivo(NR):
La prueba se considera no reactivo para HBsAg si el resultado de la absorbancia
es menor al valor Cut-Off = 0.109
Reactivo(R):
La prueba se considera reactivo para HBsAg si el resultado de la absorbancia es
igual o mayor al valor Cut-Off = 0.109

CN
0.121

S43
0.114
R

S6
0.156
R

S15
0.104
NR

S18
0.162
R

S26
0.072
NR

CN
0.056

S44
0.058
NR

S7
0.100
NR

S16
0.058
NR

S19
0.103
NR

S28
0.086
NR

CN
0.076

S45
0.059
NR

S8
0.085
NR

CN

S20
0.087
NR

S29
0.061
NR

CP

S46

S9

CN

S21

S30

INMUNOLOGA II

Pgina 9

DIAGNOSTICO SEROLOGICO HEPATITIS B

0.372

0.066
NR

0.206
R

0.079
NR

0.086
NR

CP
0.418

S1
0.057
NR

S10
0.092
NR

CN

S22
0.108
NR

S31

S40
0.106
NR

S2
0.064
NR

S11
0.090
NR

CP

S23
0.075
NR

S32

S41
0.140
R

S3
0.050
NR

S12
0.149
R

CP

S24
0.074
NR

S33
0.556
R

S42
0.066
NR

S5
0.060
NR

S13
0.078
NR

S17
0.083
NR

S25
0.059
NR

S34

Algunos pocillos se encuentran en blanco porque no dieron la absorbancia

correcta, debido a que no hubo suficiente solucin de parada y no se le agreg a
esos pocillos.

REPORTE FINAL:
TOTAL DE POCILLOS: 48

NO REACTIVO

REACTIVO

28

INMUNOLOGA II

CONTROLES

BLANCOS

TOTAL

10

48

Pgina 10

DIAGNOSTICO SEROLOGICO HEPATITIS B

CONCLUSIONES
La hepatitis B es una enfermedad producida por un virus (VHB)
Los marcadores sricos ms importantes en la prctica clnica para el diagnstico
de la hepatitis B son: HBsAg, anti-HBs, HBeAg, anti-HBe, anti-HBc totales, antiHBc IgM y los anti-HBc IgG).
El diagnstico de laboratorio de la hepatitis B se centra en la deteccin del
antgeno superficial del virus de la hepatitis B (HBsAg).
HBsAg ELISA es un mtodo inmunoenzimatico directo tipo sndwich.
El antgeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) aparece en el suero de 1-10
semanas tras la exposicin aguda al VHB, y lo hace antes del comienzo de la
sintomatologa clnica y de la elevacin de la alanina-aminotransferasa (ALT)
srica. Su persistencia al cabo de 6 meses implica infeccin crnica.
Se reporta no reactivo para HBsAg si el resultado de la absorbancia es menor al
valor Cut-Off y reactivo para HBsAg si el resultado de la absorbancia es igual o
mayor al valor Cut-Off.
Los resultados obtenidos en la prctica fueron, nuestro valor Cut-Off igual 0.109,
segn ese valor nuestro reporte es 28 NO REACTIVOS y 7 REACTIVOS,

BIBLIOGRAFIA
http://www.jano.es/ficheros/sumarios/1/0/1722/39/00390045_LR.pdf
http://www.svmfyc.org/fichas/f048/ficha048.pdf
Inserto de HBsAg EIA plus ANI labsystem

INMUNOLOGA II

Pgina 11