G.p.bioquimica y Nutricion

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
CURSO DE BIOQUMICA Y NUTRICION
GUIA DE PRACTICAS
Dr. Jos Chuquipiondo Ludea

Dr. Jos Martn Chuquipiondo Arana
LIMA PERU
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
NORMAS PARA EL USO Y TRABAJO EN EL LABORATORIO

Realizar las prcticas de laboratorio con el debido inters y responsabilidad.
Presentarse vestido correctamente con su correspondiente guardapolvo y
distintivo de la Universidad.
Poner maletines y mochilas en el estante, llevar a las mesas solo lapiceros
y cuadernos.
Est terminantemente prohibido beber o comer dentro del laboratorio.
Leer cuidadosamente la gua de prctica y tener en cuenta las indicaciones
de los profesores de prctica sobre el uso del material y equipos de
laboratorio, as como el orden, limpieza y seguridad que debe mantenerse.
Por cada prctica de laboratorio cada mesa de trabajo presentar un nico
informe, el cual consta de las siguientes partes:
- Cartula.
- Objetivos.
- Marco Terico.
- Desarrollo Experimental.
- Discusin de los resultados.
- Conclusiones.
- Cuestionario.
- Bibliografa
Dicho informe se presentar en la siguiente prctica en el horario y grupo
Respectivo.
El inicio de la prctica es en la hora exacta programada. Se tendr una
tolerancia de 10 minutos, luego de ese lapso de tiempo no se podr
ingresar al laboratorio, por lo tanto se le considerar como una inasistencia
y no tendr derecho a nota de informe de prcticas.
Las inasistencias en las prcticas no son recuperables en ninguno de los
grupos, calificndose al alumno con nota cinco (05). Aquel alumno que
acumule 30% de inasistencias no tiene derecho a nota prctica.
Cada alumno ser integrante de una mesa de trabajo, a la cual pertenecer
a lo largo del semestre acadmico.
Por mesa de trabajo, ser nombrado un responsable que se har cargo del
material y equipos recibidos as como de la presentacin de los informes.
En caso de dao, deterioro o prdida del material y/o equipos, el
responsable de mesa informar del hecho al profesor de prcticas, TODO
GRUPO ES RESPONSABLE DEL DAO CAUSADO, y deber repararlo a la
brevedad posible, no ms de una (01) semana despus del incidente.
Al final de la prctica, se proceder a limpiar el material usado, con el fin
de entregarlo en las mismas condiciones en las que fueron recibidos, caso
contrario se le descontar un punto en la nota de informe a todo el grupo.
Una vez limpio el material, el responsable de mesa lo devolver a la
persona encargada del laboratorio.
El laboratorio deber quedar completamente limpio, las mesas secas y
limpias, debiendo arrojar todos los desechos al tacho de basura.

CURSO: BIOQUMICA Y NUTRICION
PRACTICA No 1
ESPECTROFOTOMETRIA
GENERALIDADES:
Se denomina Anlisis Colorimtrico al conjunto de mtodos de anlisis
cuantitativos que se fundamentan en la medicin de la intensidad de la luz
transmitida a travs de una solucin coloreada, ya sea que se trate de sustancias
naturalmente coloreadas que se han hecho de tal calidad mediante reacciones
qumicas adecuadas.
Cuando una haz de luz (luz incidente, Io) atraviesa una solucin, una parte de la
radiacin queda absorbida por las molculas del soluto coloreado, sufriendo una
reduccin de su intensidad (Luz transmitida, I), proporcional a la capacidad de
absorcin de dichas molculas.
Io
Luz incidente
I
Luz transmitida
Casi todas las sustancias en solucin tienen la capacidad de absorber en forma

selectiva determinadas radiaciones luminosas unas ms que otras dejndolas
pasar. La longitud de onda en la que las molculas de dicha sustancia absorbe con
mayor intensidad la luz, se denomina longitud de mxima absorcin o lambda
mximo.
Si consideramos que cada molcula absorbe una determinada cantidad de luz, la
intensidad de la luz transmitida por una solucin disminuir en relacin con el
aumento del nmero de molculas que se interpongan entre la fuente luminosa y
el observador. Este nmero vara de acuerdo con la concentracin del soluto y el

espesor del recipiente que contiene la solucin, estos factores estn considerados
en la Ley de Lambert y Beer, que rige los principios de la Espectrofotometra y
cuyas formas de expresin son:
Log (Io/I) = E. b. c = A = D.O.
Donde:
Io = Intensidad de la luz incidente.
I = Intensidad de la luz transmitida.
E = Coeficiente de extincin molar, valor constante dependiendo de la
naturaleza de la
Sustancia y de la longitud de onda
I = Espesor del recipiente en cm.
C = Concentracin de la solucin.
A = D.O. = Absorbancia (A) aumenta conforme disminuye la Transmitancia (T)
y la relacin entre ambas es logartmica.
CALCULO DE LA CONCENTRACIN DE UNA SOLUCION PROBLEMA:
Para calcular la concentracin de una solucin problema con el empleo de un
Espectrofotmetro, existen dos formas:
- Mtodo de la curva standard o curva de calibracin.
- Factor de calibracin.
a)
CURVA STANDARD.- Este mtodo consiste en utilizar varios estndares de

concentraciones conocidas y progresivas para luego construir un grfico en
un sistema de coordenadas en el que se colocan las lecturas en las
ordenadas (Eje Y) y las concentraciones en las abscisas (Eje X). En la recta
obtenida (Funcin lineal), se puede extrapolar la absorbancia o densidad
ptica de la muestra problema, hallando la concentracin de la misma en
el eje de las abscisas.
b)
FACTOR DE CALIBRACIN.- (Fc), El factor de calibracin es un trmino

que se relaciona con la concentracin de una sustancia con su
absorbancia, es decir la intensidad que absorbe una sustancia de
concentracin conocida (Standard o Patrn).
As tenemos:
Fc = [ Standard ] / A
Donde:
Fc = factor de calibracin.
A = absorbancia del tubo standard.
[Standard] = concentracin del standard.
Con el factor de calibracin se puede fcilmente determinar la concentracin de
una muestra desconocida o problema (MP), conociendo su absorbancia.
Si la muestra problema y el standard son procesados de la misma manera
(diluciones) se podr usar directamente la siguiente frmula:
[ MP ] = A. Fc
Si la muestra problema sufre diluciones previas se encontrar el factor de dilucin

(Fd) que es matemticamente la inversa de la dilucin (dil) y esta a su vez es:
Dil = Vol / Vol
Donde:
Vol
= Volumen de la muestra problema tomada para hacer la dilucin.
Vol o
= Volumen total.
Para este segundo caso cuando se quiere saber la concentracin de una muestra
problema se proceder usando la siguiente frmula:
[ MP ] = A. Fc. dil
Donde:
A = Absorbancia de la muestra problema.
Fc
= Factor de calibracin.
Dil
= Factor de dilucin.
[MP] = Concentracin de la muestra.
EXPERIMENTO
1. Preparar la siguiente batera de tubos:
Bicromato de potasio
Agua destilada
Concentracin (mg %)
Muestra X
2.
3.
4.
5.
-
Tubo I
0.8 ml
9.2 ml
-----
Tubo II
1 ml
9 ml
-----
Tubo III
1.3 ml
8.7 ml
-----
Tubo IV
1.5 ml
8.5 ml
-----
TUBO X
--9 ml
--1 ml
Solucin stock: Bicromato de Potasio 80 mg%.

Calcular la concentracin en mg% de bicromato de K en cada uno de los
tubos Standard (I-II-II-IV).
Leer las absorbancia de los cuatro tubos a 350 nm de longitud de onda ()
en el espectrofotmetro contra el H2O destilada (Abs. H2O=0).
Con los datos obtenidos construir en un papel milimetrado la grfica de
absorbancia en el eje de las Ordenadas vs concentracin de bicromato de K
en el eje de las Abscisas.
Una vez obtenida la curva de calibracin, medir la absorbancia de la
muestra problema (Problema X).
Obtener el factor de calibracin (Fc) promedio con las soluciones standard y
sus Absorbancia utilizadas para construir las curvas de calibracin ajustadas.
Calcular la concentracin de la muestra problema por los siguientes
mtodos:
A.- Grficamente extrapolando su absorbancia en la curva de calibracin.
B.- Usando Factor de Calibracin, multiplicando su absorbancia por el factor
de calibracin del standard.
CUESTIONARIO:
1.- Explique el mecanismo de funcionamiento de un espectrofotmetro.
2.- Qu diferencias existen entre un fotocolormetro y un espectrofotmetro?.
3.- Grafique el espectro de luz, tanto en el rango visible como no visible con sus
respectivas longitudes de ondas.
4.- Qu relacin matemtica existe entre Absorbancia y Transmitancia?
5.- Construya una curva de calibracin con los siguientes valores:
Standard 1
Concentration 5 mg/dl
Absorbancia 0.025
Standard 2
10 mg/dl
0.050
Standard 3
20 mg/dl
0.100
Standard 4
30 mg/dl
0.150
Standard 5
40 mg/dl
0.200
Con la curva obtenida hallar la concentracin de las siguientes muestras, sabiendo

que sus absorbancia fueron:
Muestra A........................0.015
Muestra B........................0.125
Muestra C........................0.350

PRACTICA No 2
LOS AMINOCIDOS Y LAS PROTEINAS COMO ELECTROLITOS: SU
CAPACIDAD AMORTIGUADORA EN EL ORGANISMO HUMANO
FUNDAMENTO BIOQUIMICO:
Una propiedad importante de los aminocidos, consecuencia del hecho de que
todos ellos tienen grupos carboxilo (-COOH) y grupos amino (-NH2) es su conducto
como electrolitos. Es costumbre considerar los grupos COOH como de naturaleza
acdica y los grupos NH2 como de carcter bsico.
Hemos estudiado en las clases tericas el comportamiento de los aminocidos
como iones dipolares y la conducta de ellos durante su titulacin con cido y lcalis
de modo que se comportan como verdaderas sustancias tampones,
amortiguadores buffers, para el sostenimiento del pH del medio interno dentro
de estrechos lmites (7.35 a 7.45). Explicamos tambin el comportamiento
amortiguador del ion dipolar glicina al aadirle iones H+ o al aadirle OHimpidiendo las variaciones bruscas del pH sanguneo. La representacin de un
aminocido tal como la glicina por la frmula NH2CH2COOH sugiere que se trata de
una sustancia en la que el grupo amino acta como una base conjugada y el grupo
COOH como un cido. Se ha observado, sin embargo, que esta formulacin no es
la correcta del estado inico de un aminocido en solucin acuosa. La verdadera
representacin es aquella que dimos del ion dipolar (A) y que es la siguiente:
(Estructura A)
Estructura (A)
H
R C COONH3
R
Estructura (B)
H
C COOH
NH2
Y que es la forma en la cual se encuentran en el torrente circulatorio, es decir, al

pH fisiolgico (7.4) los grupos carboxilo existen como la base conjugada, esto es,
como in carboxlico R-COO-; y al mismo pH, la mayora de los grupos amnicos
estn predominantemente en la forma protnica R-NH3+
La estructura (A) inica es la prevalente en la sangre y en la mayora de los
tejidos. La estructura (B) no puede existir a ningn pH. La conveniencia nos
ensea sin embargo que la estructura (B) se use por razones didcticas y para
explicar la mayora de las ecuaciones que entraan reacciones distintas a las de
los equilibrios protnicos. La contribucin ms importante a la conducta de una
protena como electrolito procede de los grupos ionizables existentes en las
cadenas laterales de los aminocidos. La curva de titulacin de una protena
aminocido con cido lcali vendr determinada en gran medida por el nmero
de cada uno de estos grupos ionizables de las cadenas laterales de sus unidades
de aminocidos. Por estas razones las soluciones de protenas tienen una poderosa
capacidad tampn.
Esta propiedad amortiguadora es de importancia decisiva en los sistemas
biolgicos y ha sido estudiada con especial cuidado con relacin a los
amortiguadores de la sangre humana cuyo pH es controlado dentro de estrechos
lmites, tal como les expliqu en la clase terica. Les dije que los valores de pH
sanguneo varan dentro de lo normal entre 7.35 a 7.45, cuando la sangre alcanza
valores por debajo de 7.35 se produce acidosis; y cuando los valores de pH se
elevan por encima de 7.45 se produce alcalosis. La sangre contiene otros dos
sistemas tampones que son:
1) El Sistema bicarbonato/Acido carbnico (pK: 6,1)
2) El sistema fosfato mono sdico/di sdico (pK: 6,8)
La protena ms importante de la sangre del ser humano es la Hemoglobina que
tiene gran capacidad tampn en la proximidad del pH 7.4, lo cual se debe a su
elevado contenido de histidina (grupo imidazol) Aproximadamente el 60% de la
capacidad tampn de la sangre total se debe a la Hb, y un 20% es atribuible a las
protenas del plasma (seroalbminas y globulinas).
Recordemos que segn lo propuesto por Bronsted: un cido es una sustancia que
al ionizarse genera iones Hidrgeno, H+, una base es toda sustancia capaz de
aceptar estos iones hidrgeno. Como los cidos ceden protones y las bases los
captan, a cada cido le corresponde, como es lgico, una base conjugada. Es
decir, si un cido cede un protn, el ion, as formado, puede captarlo de nuevo
comportndose como base. Por lo tanto, los procesos de cesin captura de
protones transcurren de forma reversible:
AH
Acido
Cesin de protones
captacin de protones
A-
H+
Base
El cido y la base conjugada forman un par cido/base.

Las soluciones que contienen cidos dbiles y sus sales se llaman soluciones
tampn, buffers amortiguadores. Su finalidad es impedir amortiguar las
bruscas variaciones del pH.
El pH de una solucin amortiguadora puede calcularse utilizando la ecuacin de
Henderson-Haselbach:
SAL
pH = pK + log -----------ACIDO
A partir de esta ecuacin se deduce que el pH de una disolucin tampn depende
de la naturaleza del cido que la integra y de la proporcin entre la sal y el cido
(logaritmo de la relacin entre ambos) y no de las concentraciones absolutas de
cada uno de estos componentes. La eficacia amortiguadora es mxima cuando el
cociente de la relacin sal/cido es prximo a la unidad.
El objetivo de la presente prctica es demostrar la capacidad tampn de un
sistema amortiguador empleando un cido dbil y la sal del cido dbil y estudiar
la curva de titulacin valoracin de un cido dbil HA, como el cido actico
(0.1N) y una base fuerte NaOH 0.1N y las variaciones del pH con respecto a
diferentes proporciones relativas entre la sal y el cido de una solucin tampn. (el
pK del cido actico es 4.76) antes de agregar la base, el pH se debe solamente a
la presencia del cido. Pero tan pronto como se aade algo de la base (NaOH
0.1N), sta reacciona con una cantidad equivalente del cido y forma una cantidad
equivalente de sal y agua. El cido dbil ms su sal disuelta constituyen una
solucin tampn (par amortiguador), cuyo pH puede calcularse mediante el uso de
la ecuacin de H-H: pH = pK log sal/cido.
Se determinar el pH con el potencimetro y se evaluarn los cambios en el pH
con la adicin de volmenes definidos de una base conocida (NaOH 0.1N).
Graficaremos en un sistema de coordenadas cartesianas los valores de pH vs los
ml de base agregados y obtendremos as la curva de titulacin para el cido.
Se emplear el equipo potencimetro para determinar el pH, instrumento que
determina el pH en funcin de la fuerza electromotriz de una celda formada por un
electrodo de referencia, la solucin problema y un electrodo de vidrio muy sensible
a los hidrogeniones.
MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS:
Potencimetro.
Beakers de 50 ml de vidrio (11 para cada mesa de trabajo).
Baguetas de vidrio (3 por cada mesa).
Pipetas de 10 ml graduadas 1/10 (3 por cada mesa).
Agua destilada.
Solucin de CH3-COOH 0.1N.
Solucin de NaOH 0.1N.
Papel milimetrado cuadriculado.
PARTE EXPERIMENTAL:
Mezclar los volmenes de CH3-COOH 0.1N y de NaOH 0.1N con agua destilada
sealados en la tabla siguiente, mezclar bien y luego medir el pH en cada uno de
los 11 Beakers con el potencimetro:
Beaker N
Acido actico
0.1 N (ml)
NaOH
0.1N (ml)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Agua
destilada
(ml)
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
pH
En cada mesa los alumnos construirn su grfica de valoracin colocando en las

coordenadas los valores de pH en orden creciente y en el eje de las abscisas los
volmenes de NaOH 0.1N aadidos en cada Beakers.
pH
ml NaOH aadido
CUESTIONARIO:
1.- Graficar la curva de valoracin del cido actico 0.1N vs. NaOH 0.1N.
2.- Identificar el punto de semi-valoracin y mxima capacidad tampn.
3.- Explique que es un par tampn, como funciona y porqu las protenas
sanguneas son amortiguadores.
4.Describa las principales sustancias amortiguadoras del organismo
humano.

PRACTICA No 3
FACORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
Los biocatalizadores especficos sintetizados por el organismo, llamados enzimas
son protenas que intervienen en las reacciones biolgicas, acelerando la velocidad
de reaccin hasta alcanzar su punto de equilibrio. Las enzimas son sumamente
especficas en las reacciones que catalizan y en los compuestos (llamados
sustratos) sobre los que actan.
La cintica enzimtica es el estudio del comportamiento de la velocidad en
reacciones catalizadas por enzimas. Las mediciones de la cintica proporcionan
una herramienta bioqumica muy til para calcular la concentracin de una enzima
en una muestra biolgica y comparar su actividad cataltica con la de otras
enzimas. Adems, las mediciones cinticas permiten describir de manera
cuantitativa el efecto de un veneno o medicamento sobre la actividad de una
enzima.
La velocidad a la que procede una reaccin enzimtica est controlada en parte
por las concentraciones de la enzima y el sustrato. A medida que progresa la
reaccin, aumenta la concentracin de los productos a expensas de la desaparicin
de los correspondientes sustratos, en tanto que la concentracin de la enzima no
se altere.
La actividad enzimtica puede expresarse:
a) Por la desaparicin del sustrato (S).
b) Por la aparicin de productos (P).
c) Por modificacin de cofactores (C).
El mecanismo de reaccin enzima-sustrato puede simbolizarse as:
[E] + [S]
[E] + [P]
C
C'
Diversos factores modifican la actividad enzimtica, tales como:

1) Concentracin de sustrato [S]
2) Concentracin de la enzima [E]
3) pH del medio
4) Influencia de la temperatura
5) Efecto de inhibidores y activadores
En la presente prctica estudiaremos el efecto de estos factores sobre la actividad
enzimtica de la amilasa salival sobre el almidn.
La amilasa es una enzima que degrada molculas hidrocarbonadas complejas en
componentes ms pequeos, tiene un PM de 40,000 a 50,000 daltons. Es
producida por el pncreas exocrino y las glndulas salivales para ayudar a digerir
el almidn. La amilasa humana se denomina alfa-amilasa por su capacidad para
romper los enlaces polisacridos alfa-1,4 al azar. Los enlaces alfa-1,6 de los puntos
de ramificacin no se alteran. El producto final de la accin de la alfa-amilasa
sobre el almidn es la formacin de dextrinas, maltosas y algunas molculas de
glucosa. El pH ptimo al cual acta es 6.9 a 7 y se requiere cloro para su
activacin.
En la prctica la actividad enzimtica se medir por la desaparicin del sustrato
(disminucin de la turbidez en los tubos que contienen almidn), la cual se
determinar en el espectrofotmetro a 650 nm.
EXPERIMENTO A
EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE LA ENZIMA, DE LA TEMPERATURA Y

DEL ION CLORO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL
1) Preparar los siguientes tubos:
Tubos No.
Solucin almidn 1%
Buffer phosphate pH 6.6
Solucin salina (NaCl 1%)
Agua destilada
I
1 ml
5 ml
2.8 ml
II
1 ml
5 ml
2.6 ml
III
1 ml
5 ml
2.4 ml
---
---
---
IV
1 ml
5 ml
2.2
ml
---
V
1 ml
5 ml
--2.2
ml
VI
1 ml
5 ml
2.2
ml
---
VII-C
1 ml
5 ml
2.2 ml
---
2) Colocar los tubos I al V en un bao de agua a 37C, durante 5 minutos. El

tubo VI servir de comparacin para ver el efecto de la temperatura sobre
la accin enzimtica por lo que se deja a temperatura ambiente.
3) Agregar la solucin de enzima:
Tubos No.
Solucin amilasa
I
0.4 ml
II
0.8 ml
III
1.2 ml
IV
1.6
ml
V
1.6
ml
VI
1.6
ml
VII-C
---
4) Colocar nuevamente los tubos I al V en bao de agua a 37C durante 20

minutos, el tubo VI se mantiene a temperatura ambiente.
5) Luego hacer el control final de la reaccin con el reactivo de yodo, de la
siguiente manera:
Tubos No.
HCl 0.05 N
de los tubos de reaccin
correspondientes agregar
Solucin yodada
I
5 ml
0.5 ml
II
III
5 ml
5 ml
0.5 ml 0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml 0.5 ml
IV
5 ml
0.5
ml
0.5
ml
V
5 ml
0.5
ml
0.5
ml
VI
5 ml
0.5
ml
0.5
ml
VII-C
5 ml
0.5 ml
0.5 ml
6) Mezclar y dejar en reposo por 10 minutos.

7) Leer las absorbancia al espectrofotmetro a 650 nm.
8) La diferencia de las absorbancia entre los tubos nos indicar la actividad
enzimtica para cada tubo.
9) Graficar en papel milimetrado: Actividad enzimtica en el eje Y vs
concentracin de la enzima [E] en el eje X.
EXPERIMENTO B
EFECTO DE LA CONCENTRACIN DEL SUSTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD

DE LA AMILASA SALIVAL
Tubos No.
I
Solucin de almidn 1%
1 ml
2 ml
2 ml
Agua destilada
5 ml
2
2
2
4
II
ml
ml
ml
ml
3
2
2
3
III
ml
ml
ml
ml
4
2
2
2
IV
ml
ml
ml
ml
5
2
2
1
V
ml
ml
ml
ml
2) Mezclar bien los tubos. Hacer un control con la solucin yodada con todos
los cinco tubos de la misma manera que se hizo en el experimento anterior
y leer las absorbancia de dichos controles a 650 nm. Dichas absorbancia se
tomarn como lecturas iniciales.
3) Luego aadir 1 ml de solucin de enzima a cada tubo y colocarlos en el
bao de agua a 37C por 20 minutos.
4) Sacar los tubos y hacer un control con solucin yodada de cada uno. Las
lecturas de absorbancia se tomarn ahora como lecturas finales.
5) Hacer la diferencia:
Actividad enzimtica = Lectura inicial Lectura final
El resultado de esta diferencia se considerar como actividad enzimtica.
6) Determinar el Km experimental de la amilasa para el almidn a partir de
una grfica de actividad enzimtica contra [S] (Ecuacin de MichaelisMenten) y una grfica de dobles inversas: 1/actividad enzimtica contra
1/[S] (Ecuacin de Lineweaver-Burk). Graficar en papel milimetrado.
EXPERIMENTO C
EFECTO DEL PH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL

Tubos No.
Solucin de almidn 1%
I
5 ml
2 ml
2 ml
-----
II
5 ml
2 ml
--2 ml
---
2)
3)
4)
5)
III
5 ml
2 ml
----2 ml
Mezclar y colocar los tubos en bao de agua a 37C por 5 minutos.

Aadir a cada tubo 2 ml de solucin de enzima (amilasa).
Colocar nuevamente los tubos a 37C por 20 minutos.
Extraer los tubos del bao y realizar el control mediante la solucin yodada,
como en el experimento anterior.
6) Realizar el estudio crtico comparativo de ellos. Sacar conclusiones.
7) Graficar en papel milimetrado una curva de actividad enzimtica vs pH.
CUESTIONARIO:
1.2.3.4.5.-
Cul es la importancia del Km.

Qu efectos produce las altas temperaturas sobre las enzimas.
Como se clasifican las enzimas?
A que se llaman zimgenos e isoenzimas.
Que son cofactores y mencione ejemplos.


PRACTICA No 4
EVALUACIN NUTRICIONAL BIOQUMICA Y ANTROPOMETRICA
La evaluacin nutricional es parte de la evaluacin integral del estado de salud de
un individuo. Es un requisito indispensable siempre que se desea mejorar,
promover o mantener un buen rendimiento fsico, un buen estado de salud y
nutricin, adems de dar una idea ms exacta del nivel de rendimiento que se
tiene y que se puede alcanzar.
El objetivo general de la prctica es determinar el estado nutricional mediante un
diagnstico que permita conocer el nivel nutricional actual, sobre todo aquellos
mas frecuentes en nuestro medio como el Marasmo y el Kwashiorkor.
ESTADO NUTRICIONAL: Es la condicin de salud resultante en el tiempo, del
balance entre lo consumido y lo requerido, dependiendo de la Edad, Sexo, Peso,
Talla, etc. De cada persona. Es necesario considerar la calidad y cantidad de los
nutrientes consumidos y la utilizacin de estos en el organismo.
EVALUACIN NUTRICIONAL: Emplearemos mtodos Antropomtricos y
Bioquimico-Antropometricos adems del Balance Nitrogenado y Evaluacin
Inmunolgica.
1. Evaluacin antropomtrica :
Emplearemos los ndices PESO/TALLA; Circunferencia del Brazo(CB);

Circunferencia Muscular del Brazo (CMB); Espesor del Pliegue Cutneo del Trceps
(EPCT); ndice de Masa Corporal (IMC); entre otros.
2. Evaluacin bioqumica :
Utilizaremos la Protena Total y la Albumina Sricas como ndices de masa

proteica visceral.
El Balance Nitrogenado lo utilizaremos para evaluar los ingesta en relacin
con la excrecin de Nitrgeno.
Como Evaluador Bioquimico-Antropomedico (Mixto) utilizaremos el ndice
Creatinina Urinaria/Talla para la evaluacin de la masa muscular esqueltica.
3.Evaluacion Inmunolgica :
Empleando los TEST de Hipersensibilidad Cutnea Retardada: Tuberculina,

Candidina, etc.
3. Evaluacin Clnica :
Diferenciaremos el Marasmo del Kwashiorkor en sus mas importantes

diferencias Bioqumicas y Clnicas.
EXPERIMENTO A
EVALUACION DE LA MASA PROTEICA VISCERAL
DETERMINACIN DE PROTEINAS Y ALBMINA EN SUERO
FUNDAMENTOS DEL METODO:

Los enlaces peptdico de las protenas reaccionan en un medio alcalino con el ion
cprico del reactivo de Biuret, estabilizado por tartrato, para formar un complejo
de color violeta cuya mxima absorcin se da a 540 nm.
NaOH
Cobre +
protena
Complejo cupro-proteico
El dosaje de protenas totales tiene poco valor como prueba aislada porque la
alteracin en una de las fracciones puede ser balanceada por una alteracin
opuesta de otra fraccin. Por lo tanto, es importante que adicionalmente se
determine la concentracin de albmina.
La albmina tambin va a ser dosada por el mtodo de Biuret, pero previamente al
suero se le hace un tratamiento con sulfato de sodio y eter etlico para lograr la
separacin de las globulinas y permitir solo el dosaje de albminas.
REACTIVOS PROVISTOS:
Reactivo EDTA/Cu: Complejo EDTA/Cu 13 mmol/l en NaOH 875 mmol/l y alquil
aril poli ter (AAP).
Reactivo BCF: Solucin de 3,3,5,5-tetrabromo Cresolsulfon ftalenas (en
polioxietiln lauril ter).
Suero Patrn: Solucin de Albumina y Globulinas en estado nativo con titulo
conocido de protenas (Biuret o Kjeldhal) y Albumina (unin BCF).
PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DE PROTEINAS EN SUERO:
Preparar tres tubos y agregar en cada uno lo siguiente:
Agua Destilada
Estndar (Suero Patrn)
Muestra
Reactivo EDTA/Cu
Blanco
(ml)
50 ul
----3,5 ml
Standard
(ml)
--50 ul
--3,5 ml
Muestra
(ml)
----50 ul
3,5 ml
Mezclar, incubar a 37C.

Leer las absorbancia a una longitud de onda de 540 nm.
CALCULOS: Calcular la concentracin de protenas (en g/dl), utilizando el mtodo
del Factor de Calibracin.
La lectura del tubo blanco debe ser restada de la lectura de los tubos muestra y
standard para obtener una absorbancia neta, sin la intervencin del color propio
del reactivo.
PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DE ALBMINA EN SUERO:
Preparar tres tubos y agregar en cada uno lo siguiente:
Standard (Suero Patrn)

Muestra
Reactivo BCF
Blanco
(ml)
----3,5 ml
Standard
(ml)
10 ul
--3,5 ml
Mezclar y mantener los tubos entre 15 y 28C durante 10 minutos.

Leer las absorbancias a una longitud de onda de 625 nm.
Muestra
(ml)
--10 ul
3,5 ml
CALCULOS: Calcular la concentracin de albmina (en g/dl) utilizando el mtodo

del Factor de Calibracin, en forma similar que para el caso de las protenas
totales.
P.T.(g/dl)
PROTEINAS TOTALES (g/dl) =-------------------------S
Alb. (g/dl)
ALBUMINA (g/dl) =-----------------------------S
Albumina (g/dl)
RELACION A/G =--------------------------------------P.T. (G/DL) Alb. (g/dl)
VALORES NORMALES:
Protenas Totales= 6.1 7.9 g/dl.
Albmina =
3.5 4.8 g/dl.
Relacin A/G =
1,2 a 2,2
CUESTIONARIO.1.- Diga Ud. Como se evala la masa Proteica Visceral?
2.- Que cosa es la Presin Oncotica de las Protenas y como explica Ud. El Edema
por Desnutricin.
3.- Que tipo de Trastornos Nutricionales conoce segn lo explicado en clases?
4.- Investigue la importancia nutricional que tiene la Transferrina, pre albmina y
protena transportadora de retinol plasmtica.
5.- Qu es el ndice de Masa Corporal, como se calcula, valores normales e
interpretacin?

PRACTICA No 5
DETERMINACIN DE LA GLICEMIA, INVESTIGACIN DE GLUCOSURIA
El mantenimiento de la glicemia, o concentracin plasmtica de glucosa, en los
organismos superiores es fundamental para el funcionamiento de todos los
rganos, al ser la glucosa un metabolito energtico principal. La coordinacin de
los procesos metablicos implicados en este cometido se lleva a cabo por la
relacin insulina/glucagn. La ingestin de glucosa o sustancias que la produzcan
(almidn, fructosa, galactosa, protenas, pero no grasas) va seguida, en las
personas sanas, por un aumento de la glucosa en sangre. Este aumento origina la
puesta en marcha del mecanismo regulador: aumento de la utilizacin de glucosa
(por gluclisis, entre otras), aceleracin de la Gluconeognesis y disminucin
de la glucogenlisis; todo ello ocurre principalmente mediante la secrecin de
insulina, una hormona pancretica de tipo polipeptdico. En el caso de que la
produccin de insulina est disminuida, la glucosa no puede ser utilizada por las
clulas, lo cual ocasiona niveles elevados de glucosa en sangre (hiperglucemia);
as ocurre en las personas que sufren diabetes del tipo denominado "dependiente
de insulina" o "tipo I".
El diagnstico de la diabetes dependiente de insulina es sencillo y se basa en
antecedentes, sntomas clnicos y comprobacin de una hiperglucemia significativa.
Experimento A: DETERMINACIN DIRECTA DE LA GLICEMIA

(concentracin de glucosa en suero)
FUNDAMENTO TERICO
Como se ha indicado, la diabetes dependiente de insulina cursa con un aumento
de la concentracin de glucosa en sangre (glicemia), que se produce de manera
repentina y adems es severa. Una hiperglucemia superior a 124 mg/dl detectada
en ms de una ocasin en ayunas, adems se considera tambin un valor mayor a
200 mg/dl en cualquier momento son indicativos de posible diabetes, diagnstico
que debe confirmarse con otras pruebas.
La determinacin de glucosa sangunea es una prueba muy frecuente en
bioqumica y se puede llevar a cabo tanto por mtodos qumicos como
enzimticos, siendo estos ltimos los ms especficos.
Hay dos tipos de mtodos qumicos:
a. Reducimtricos, que se basan en la capacidad reductora de la glucosa.
Debido a la presencia en la muestra de otros compuestos reductores, estos
mtodos dan cifras superiores a las correspondientes a la glucosa
verdadera. Ejemplos son el mtodo de Folin-Wu y el de Somogy-Nelson.
b. Furfurlicos: se basan en la capacidad de la glucosa para formar furfural al
sufrir deshidratacin en un medio cido. Un ejemplo es el mtodo que
emplea orto-toluidina.
En cuanto a los mtodos enzimticos:
a. Mtodo de la hexoquinasa: emplea las enzimas hexoquinasa y glucosa-6fosfato deshidrogenasa. Por cada molcula de glucosa se forma una de
NADPH, que puede medirse espectrofotomtricamente a 340 nm. Es el
mtodo de referencia recomendado por las organizaciones internacionales.
b. Mtodo de glucosa oxidasa y peroxidasa (GOD-POD): es el que se utiliza en
esta prctica para medir los niveles de glucosa sangunea de la muestra
problema y de los estndares. Se explica a continuacin:
En el mtodo GOD-POD, en un primer paso la glucosa oxidasa cataliza la

oxidacin de la D-glucosa a cido D-glucnico con formacin de perxido de
hidrgeno. ste es utilizado por la peroxidasa para oxidar a la 4-aminofenazona y
al fenol, dando lugar a una quinonaimina coloreada. La intensidad de color ser
proporcional a la concentracin de glucosa presente inicialmente. El esquema de la
reaccin es el siguiente:
MATERIALES Y REACTIVOS
Tubos de ensayo de 10 ml.
Pipetas.
Espectrofotmetro.
Agua destilada.
Solucin patrn de glucosa (100 mg/dl).
Reactivo de color de glucosa, que contiene: Glucosa oxidasa, peroxidasa, 4aminofenazona, fenol, tampn fosfato pH: 7.0
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
La muestra de sangre extrada del paciente ser centrifugada y se separar el
suero. Hacer una dilucin del suero midiendo exactamente en un tubo de ensayo
0.2 ml de suero y agregar 4.8 ml de agua destilada, mezclar hasta homogenizar.
Luego se preparan los siguientes tubos:
Tubos:
Muestra (Suero diluido)
Estndar de glucosa
Reactivo de glucosa
Blanco
----2 ml
Standard
--20 ul
2 ml
Muestra
20 ul
--2 ml
Incubar los tres tubos en Bao Mara de 37C por 10 minutos. Mezclar bien la
solucin. Leer las absorbancias en el espectrofotmetro a 505 nm.
CALCULOS
Encontrar la concentracin de glucosa en la muestra utilizando el mtodo del
factor de calibracin.
VALORES NORMALES
La glicemia normal en ayunas es de 70 a 110 mg/dl.
Experimento B: INVESTIGACIN CUALITATIVA DE GLUCOSA EN ORINA
FUNDAMENTO TEORICO
En estado normal no existen cantidades detectables de glucosa en orina, por lo
menos con los mtodos habitualmente utilizados en el laboratorio. La glucosuria
(presencia de glucosa en orina) se presenta en la diabetes Mellitus pero cuando se
supera el umbral renal de glucosa que ocurre cuando la glicemia es mayor de 180
mg/dl.
Para la deteccin cualitativa de glucosa en orina se basa en la accin de la glucosa,
que reduce las sales de cobre en medio alcalino por ebullicin. Para ello
utilizaremos el reactivo de Benedict el cual contiene: sulfato de cobre, citrato de
sodio y carbonato de sodio.
Pipetas.
Mechero de Bunsen.
Reactivo de Benedict.
Pinzas porta tubos.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Tubos:
Orina normal (gotas)
Orina DM (gotas)
Reactivo de Benedict (ml)
I
10 gotas
--2 ml
II
--10 gotas
2 ml
Calentar directamente a la llama de un mechero hasta la ebullicin de la mezcla en

cuestin. Si la orina contiene glucosa, se observa un precipitado color verde,
amarillo rojo ladrillo dependiendo de la cantidad en que se halle presente la
glucosa en la orina. De ser negativa la reaccin permanecer de color azul.
CUESTIONARIO:
1.- Qu es la diabetes Mellitus y como se diagnostica desde el punto de vista del
laboratorio?
2.Explique en que consiste el umbral renal y la tasa de reabsorcin de la
glucosa.
3.- Describa los mtodos que existen para el dosaje de la glicemia.
4.- Explique el mecanismo de accin de los reactivos de Benedict y de Fehling.
5.- Que son la hemoglobina glicosilada y la fructosamina y cul es su importancia
en la diabetes?

PRACTICA No 6
TEST DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA Y GLUCOSA POST PRANDIAL
Definicin de DM
La diabetes Mellitus es un grupo de enfermedades metablicas caracterizadas por
la presencia de hiperglucemia resultante de un defecto en la secrecin de insulina,
en la accin insulnica, o en ambas.
Clasificacin de DM
Diagnstico
Es muy importante el diagnstico temprano de la enfermedad debido a que niveles
elevados de glucosa, an cercanos al lmite superior normal, producen daos en la
microvasculatura de retina y rin
Existen otras entidades fisiopatolgicas relacionadas con hiperglucemia que no

llegan a cumplir los criterios de diabetes pero que son muy importantes ya que
deben ser vigiladas ya que estos pacientes presentan riesgo elevado de
evolucionar a diabetes. Estas son la tolerancia disminuida a la glucosa y la glucosa
en ayunas anormal.
Tolerancia disminuida a la glucosa es aquel caso cuando despus de una

prueba de tolerancia con 75 g de glucosa se obtienen a las dos horas valores
mayores a 140 y menores a 200 mg/dl.
La glucosa anormal en ayunas es aquel caso en que los valores en ayunas
son mayores a 110 pero menores a 126 mg/dl.
Experimento A: TEST DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA Y GLUCOSA

POSTPRANDIAL
FUNDAMENTO TERICO
Las pruebas de tolerancia a la glucosa oral fueron utilizadas por mucho tiempo
para diagnstico de Diabetes Mellitus o intolerancia disminuida, pero ya no se
utilizan de rutina, pero si pueden servir tanto para la Diabetes como para la
intolerancia. Importante es recalcar que los niveles importantes en ambos casos
son los obtenidos a las dos horas, y que la cantidad de glucosa a ingerir debe ser
de 75 gramos. El disolver 75 gramos en por lo menos 300 ml de agua hace la
solucin ms agradable al paladar y por lo tanto tendrn ms aceptacin por parte
del paciente.
Ayunas
30 min
1 hora
2 horas
70-110 mg/dl
<200 mg/dl
<180 mg/dl
<140 mg/dl
En caso de la prueba de tolerancia de 75 gramos en adultos en nios se debe

utilizar una cantidad de glucosa correspondiente al peso del nio (1,75 g de
glucosa por Kg de peso). Es de suma importancia recordar que antes de iniciar
cualquier prueba de tolerancia a la glucosa oral, se debe pedir una muestra de
orina al paciente, para hacerle un anlisis cualitativo glucosa. Esto debido a que si
el paciente presenta glucosuria, no se debe realizar la prueba de tolerancia, ya que
la glucosuria indica en la gran mayora de los casos, niveles sanguneos de glucosa
elevados y la ingesta de altas concentraciones de glucosa le podra provocar al
paciente un shock hiperglicmico.
Existen otras pruebas de tolerancia que son aceptadas tanto por la
Organizacin Mundial de la Salud como por la American Diabetes Association, estas
son las relacionadas con la Diabetes Mellitus Gestacional.
La curva de tolerancia a la glucosa para tamiz de la DMG consiste en la ingesta

en ayunas de 50 gramos de glucosa, se mide la glicemia a la hora, si los niveles
son menores a 140 mg/dl se desecha la DMG, si los niveles son iguales o mayores
a 140 mg/dl se debe proceder a hacer la prueba confirmatoria para DMG. Esta
consiste en ingerir en ayunas 100 gramos de glucosa y hacer una curva de tres
horas. Si dos de los niveles obtenidos en dicha curva sobrepasan los valores
indicados en la siguiente tabla, se hace el diagnstico de DMG.
Ayunas
1 hora
2 horas
3 horas
105
190
165
145
mg/dl
mg/dl
mg/dl
mg/dl
La prueba de glucosa postprandial viene a ser una prueba de tolerancia a la

glucosa acortada, donde solo se considera el valor basal y el de las dos horas.
Ayunas
2 horas
70-110 mg/dl
<140 mg/dl
Micro pipetas automticas de 10 ul.
Espectrofotmetro.
Solucin patrn de glucosa (100 mg/dl).
Reactivo de color de glucosa, que contiene: Glucosa oxidasa, peroxidasa, 4aminofenazona, fenol, tampn fosfato pH: 7.0
Se determinar la glicemia en muestras obtenidas a una persona en forma basal,

a los 30 min, 60 min y 120 min. Luego de tomar la muestra sangunea basal se le
da de tomar al paciente 75 gr de glucosa disuelto en 300 mL de agua con unas
gotas de limn. Las muestras de sangre extradas de la persona sern
centrifugadas y se separarn los sueros. Para la determinacin de las glicemias se
utilizar el mtodo de la glucosa oxidasa peroxidasa (GOD-POD).
Tubos:
Blanco Standard Muestra Muestra Muestra Muestra

(0)
(30)
(60)
(120)
Muestra
----20 ul
20 ul
20 ul
20 ul
Estndar
--20 ul
--------Reactivo de glucosa 2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
Incubar los tubos en Bao Mara de 37C por 10 minutos. Leer las absorbancias
para cada una de los tubos en el espectrofotmetro a 505 nm.
CALCULOS
Encontrar la concentracin de glucosa en cada una de las muestras utilizando el
mtodo del factor de calibracin.
CUESTIONARIO:
1.- Con los datos de glicemia obtenidos en el experimento construir en un papel milimetrado una
grfica de tiempo vs. Glicemia y apreciar la curva de tolerancia a la glucosa.
2.- Como sera esta curva en el caso de una persona normal, un diabtico y un intolerante a la
glucosa.
3.- Que importancia tiene la deteccin de micro albuminuria en una persona.
4.- Qu son y en que casos se hace un dosaje de pptido C y de insulina en un paciente diabtico.
5.- Cules son las complicaciones agudas y crnicas de la diabetes?

PRACTICA No 7
DOSAJE DE AMILASA SERICA Y URINARIA
La amilasa, enzima del grupo de las hidrolasas, se produce principalmente en la
fraccin exocrina del pncreas y en las glndulas salivales.
Su accin se dirige particularmente a escindir los enlaces alfa 1-4 glucosdicos de
los polisacridos como almidn y glucgeno.
En pacientes con pancreatitis aguda, la amilasa srica empieza a elevarse en las
primeras 2 a 3 horas de la enfermedad, alcanzando los valores ms elevados entre
las 24 y 30 horas posteriores al ataque, declinando luego para volver a los niveles
normales entre el 3 y 6 da. Tambin se ve aumentada en este caso la excrecin
urinaria de la enzima, persistiendo la hiperamilasuria 3 a 5 das, luego de que la
actividad srica ha alcanzado los niveles normales.
Tambin es posible encontrar valores aumentados en pacientes con ulcera gstrica
o duodenal perforada, obstruccin intestinal, obstruccin de conductos biliares,
pancreatitis crnica, hipertiroidismo, carcinoma de cabeza de pncreas,
administracin de opiceos y en general cualquier caso de abdomen agudo o
intervencin quirrgica en regiones prximas al pncreas.
Las parotiditis bacterianas y virales, que producen bloqueo de la secrecin de
amilasa salival, se asocian tambin con elevaciones en los niveles de amilasa
srica.
PANCREATITIS AGUDA:
Definicin: Es un desorden inflamatorio del pncreas, en el cual la funcin
pancretica normal debe ser restaurada una vez que la causa primaria del evento
agudo es superado.
Causas:
- Pancreatitis por clculos biliares: 60% (en nuestro medio)
- Pancreatitis alcohlica: 80% (en pases Anglosajones)
- Pancreatitis de causa idioptica: 30%
- Pancreatitis por tumores
- Pancreatitis por condiciones metablicas asociadas
- Hipertrigliceridemia
- Hipoparatiroidismo
- Hipercalcemia
- Hiperlipoproteinemia Tipo V; tambin tipos I y IV
- Pancreatitis por Toxinas (Insecticidas)
- Pancreatitis por picadura de escorpin en Amrica del Sur y Central
- Pancreatitis por Metanol
- Pancreatitis traumtica (Trauma abdominal)
- Pancreatitis Iatrognica: ERCP, por corte esfnter de Oddi Ciruga
pancreatobiliar,
transplante renal-Vasculitis- SIDA-Parasitosis
PANCREATITIS CRNICA:
Definicin: Es un estado inflamatorio crnico que determina un dao irreversible
de la estructura y funcin pancretica. El curso clnico de la pancreatitis crnica
puede consistir en ataques recurrentes agudos o una relativa progresin de
sntomas.
En 1988 la clasificacin Marseilles - Roma de Pancreatitis reconoci la Pancreatitis
Crnica Obstructiva subsecuente a la pancreatitis crnica. sta es causada por la
lesin obstructiva, es la forma ms comn de pancreatitis, la que se caracteriza
por cambios crnicos irreversibles.
Causas:
-
Pancreatitis
Pancreatitis
Pancreatitis
Pancreatitis
Pancreatitis
Pancreatitis
Alcohlica
Idioptica
Crnica Tropical
Hereditaria
por Hipoparatiroidismo
por Lesiones Traumticas del Conducto Ductal
Experimento A: DETERMINACIN DE AMILASA EN SUERO
En este mtodo el sustrato, almidn tamponado, se incuba con la muestra,

producindose la hidrlisis enzimtica. Esta se detiene por el agregado de reactivo
de yodo, que al mismo tiempo produce color con el remanente de almidn no
hidrolizado. La disminucin de color respecto de un sustrato control (sin muestra)
es la medida de la actividad enzimtica, que se expresa en Unidades Amilolticas
(Smith & Roe)/decilitro (UA/dl), comparables con las Unidades Sacarognicas
(Somogy)/decilitro.
MATERIALES Y REACTIVOS:
-
Espectrofotmetro.
Micro pipetas y pipetas capaces de medir los volmenes indicados.
Tubos de ensayo y cubetas de lectura.
Bao Mara a 37C.
Reloj o timer.
Sustrato: solucin de almidn 500 mg/l, tamponada a pH 7 con buffer
fosfato 0.1 mol/l en NaCl 0.15 mol/l.
Reactivo de yodo: solucin 0.01 eq/l de yodo en HCl 0.02 mol/l.
Preparar los siguientes tubos:
Control
Muestra
Sustrato
1 ml
1 ml
Dejar unos minutos en bao de agua a 37C y agregar:
Muestra
--20 uL
Incubar a 37C. A los 730 exactos, agregar:
Reactivo de yodo
1 ml
1 ml
Mezclar por agitacin suave. Retirar los tubos del bao y agregar:
Agua destilada
8 ml
8 ml
Mezclar por inversin.
Leer en espectrofotmetro a 640 nm, llevando a cero el aparato con agua
destilada.
Experimento B: DETERMINACIN DE AMILASA EN ORINA

El procedimiento es igual que el caso anterior, solamente que en este caso la
muestra en lugar de suero es orina diluida la cual debe obtenerse de la siguiente
manera:
El paciente debe orinar descartando esta miccin, dos horas despus vuelve a
orinar y recoge toda la orina. Esta muestra, que corresponde a dos horas de
diuresis, se diluye a 200 ml con agua destilada. La determinacin se efecta con
20 uL de esta dilucin, obtenindose el resultado directamente en Unidades
Amilolticas/hora.
CALCULO DE LOS RESULTADOS:

Para ambos experimentos se emplear la siguiente frmula:
Abs. Control - Abs. Muestra
Amilasa UA/dl = --------------------------------------- x 1000
Abs. Control
Unidades: Una Unidad Amilolticas (UA) es la cantidad de enzima contenida en 100
ml de muestra, que puede hidrolizar 10 mg de almidn en 30 minutos, en las
condiciones de la reaccin. En esta tcnica se incuban 20 uL de muestra con 0.5
mg de almidn contenidos en 1 ml de Sustrato durante 7 minutos y medio, lo que
equivale a incubar 100 ml de suero con 10,000 mg de almidn durante 30
minutos. Si todo el almidn fuera hidrolizado, la actividad amilsica de la muestra
sera de 1000 UA/dl. Para obtener las unidades de actividad amilsica, la fraccin
de almidn digerido se multiplica por 1000.
VALORES DE REFERENCIA:
Suero
(UA/dl)
Normal
<120
Pancreatitis aguda
300 a 12000
Pancreatitis crnica
Hasta 200
Parotiditis
200 a 350
Parotiditis con complicacin pancretica
Ms de 350
Procesos
abdominales
agudos
(sin Normal
pancreatitis)
Orina
(UA/hora)
<260
Ms de 900
Ms de 300
350 a 750
Ms de 750
Normal
CUESTIONARIO:
1.- Explique como se produce la activacin de las enzimas producidas por el
pncreas exocrino?
2.- En una pancreatitis que importancia tiene el dosaje de las enzimas: lipasa,
tripsina, elastasa y fosfolipasa A2?
3.- Explique como se produce la digestin completa del almidn en nuestro tubo
digestivo.
4.- Cul es el cuadro clnico de una pancreatitis aguda?
5.Qu otros exmenes auxiliares se pueden realizar para confirmar el
diagnstico de pancreatitis?


PRACTICA N08
CETOACIDOSIS DIABTICA
BASE BIOQUMICA.
La Diabetes Mellitus se caracteriza por hiperglucemia y otros desarreglos que se
deben a una inadecuada accin de la Insulina sobre los tejidos corporales, ya sea
porque exista un reducido nivel circulante de Insulina una resistencia de los
tejidos blanco a sus acciones .La Diabetes se divide en dos categoras
a) Diabetes Tipo I Diabetes Insulina dependiente Diabetes juvenil (llamada as
porque se inicia en la juventud) y la Diabetes tipo II no insulina dependiente
(diabetes de inicio en la edad madura). Pueden haber tipos intermedios que se
superponen.
(A)LA DIABETES TIPO I afecta al 10 % de los pacientes diabticos y la
dependencia de la Insulina significa que no solamente que la insulina es necesaria
para el ptimo control de la glucosa sangunea, que tambin podra ser cierto para
la forma tipo II, sino que sin Insulina exgena el paciente es mas proclive a
desarrollar CETOACIDOSIS diabtica.
(1)
Se sabe que esto refleja una completa casi ausencia de insulina en estos
pacientes, en contraste con la falta parcial de insulina la resistencia a la insulina
caracterstica de los pacientes del tipo II.
(2)
Otra caracterstica clave de los pacientes con Diabetes tipo I es su
presencia en nios y adultos jvenes y su presencia en las personas mas bien
delgadas que obesas.
(B) LA DIABETES TIPO II comnmente afecta a las personas de edad madura, y
con sobrepeso.
(1) Como algo de insulina es producida en estos pacientes, no se produce
cetoacidosis
(2) Sin embargo puede ser necesario el tratamiento con insulina para prevenir la
severa hiperglucemia.
Debemos saber desde ahora que se puede producir Diabetes secundaria

alterarse la tolerancia a la glucosa de modo secundario a ciertas enfermedades
que afectan la produccin la accin de la Insulina, tales como la pancreatitis
crnica, el Sndrome de Cushing, la acromegalia, la alteracin de los receptores de
insulina y otras.
El sntoma mas comn que produce la hiperglucemia es la poliuria(Aumento del
volumen urinario) y la polidipsia( incremento en la ingesta de agua), lo cual se
debe a la diuresis osmtica inducida por la glucosa. El incremento en la ingesta de
agua es una respuesta a deshidratacin y sed..Se produce disminucin de peso
corporal, debido a la prdida de glucosa por la orina y a los efectos catablicos de
la disminucin de la accin de la insulina, a pesar de la mayor ingesta de alimentos
(Polifagia).La debilidad generalizada refleja las alteraciones metablicas .Las
infecciones de la piel, vulva y tracto urinario son frecuentes sobre todo en los
casos no controlados debido a que la hiperglucemia disminuye la resistencia a las
infecciones. La alteraciones en la retina son precoces.
CET0ACIDOSIS DIABETICA:
Se produce en los diabticos insulinodependientes cuyo nivel de insulina circulante
es insuficiente para permitir una utilizacin de la glucosa por los tejidos
perifricos y para inhibir la produccin de glucosa y el catabolismo tisular. El
incremento del Glucagn y el aumento de las hormonas que aumentan en
respuesta al stress ( como la adrenalina, noradrenalina, cortisol y hormona del
crecimiento) contribuyen a los desarreglos metablicos. La insuficiente cantidad
de insulina reduce la utilizacin perifrica de glucosa y junto con el exceso de
glucagn incrementan la produccin heptica de glucosa a travs de la
estimulacin de la Gluconeognesis y la glucogenlisis y la inhibicin de la
gliclisis. La degradacin de las protenas en los tejidos perifricos suministra un
flujo de aminocidos hacia el hgado como substrato para la Gluconeognesis. El
resultado es la hiperglucemia .La diuresis osmtica resulta de la elevacin de la
glucosa (y cuerpos cetnicos) y genera hipovolemia, deshidratacin y prdida de
sodio, fosfato de potasio y otras substancias por la orina. La deplecin del volumen
estimula la liberacin de catecolaminas lo cual se opone a la accin de la insulina
en el hgado y contribuye a la LIPOLISIS.
CETOGENESIS:
La liplisis acentuada que resulta de la falta de insulina y del exceso de
catecolaminas moviliza los cidos grasas libres desde sus depsitos en el tejido
adiposo y en lugar de reesterificarse con el glicerol para formar Triacilgliceroles, el
hgado desva
sus rutas metablicas hacia la produccin de cuerpos cetnicos. El glucagn
incrementa el nivel de carnitina, que capacita a los cidos grasos a entrar en la
mitocondria, donde ellos sufren beta oxidacin hacia cuerpos cetnicos.
Adems el glucagn disminuye el contenido heptico de malonil CoA, que es un

inhibidor de la oxidacin de cidos grasos.
ACIDOSIS: El incremento de la produccin heptica de cuerpos cetnicos
(Acetoacetato y beta hidroxibutrico) excede la capacidad corporal de
metabolizarlos excretarlos. Sus H+ son tamponados por el bicarbonato,
conduciendo a una cada del bicarbonato srico y del pH sanguneo. Se encontrar
entonces: hiperglucemia, hipercetonemia, acidosis metablica, disminucin del
bicarbonato, disminucin del pH sanguneo y presencia en la orina de glucosa
(glucosuria) y cuerpos cetnicos cetonuria.
OBJETIVO DE LA PRACTICA.Aprender a interpretar los niveles de bicarbonato srico, pH sanguneo y presencia
de cuerpos cetnicos en la orina en presencia de Cetoacidosis Diabtica.
EXPERIMENTO A:
DOSAJE DE BICARBONATO SRICO
Reactivos y materiales:
HCl 0.01 N
NaOH 0.01 N
Fenolftalena 20 mg% solucin alcohlica
Alcohol Etlico (corriente)
Muestras problemas de bicarbonato para titularlas..
Pipetas de 5 ml graduadas al dcimo
Pipetas de 1 ml graduadas al centsimo
Beakers de vidrio de 100 50 ml
Baguetas de vidrio
Bao Mara de 37C
Reloj de intervalos
Mtodo:
En un Beakers de vidrio colocar:
5 ml de HCl 0.01 N
1 ml de suero
2 gotas de alcohol
Agitar y luego reposo 2 min.
Aadir 3 gotas del indicador fenolftalena.
Colocar a 37 C en Bao Mara por 10 minutos.
Titular con NaOH 0.01N, hasta obtener un color rosado plido.
Anotar la cantidad de NaOH gastado.
Clculos:
(5 - X ml gastados de NaOH en la titulacin) x 10 = mMol/ Litro de HCO3Considerar que:
a) 1ml de NaOH 0.01 N equivale 0.01 mEq HCO3
b) Vol. de muestra usada en la titulacin: 1 ml
c) Expresar los valores de HCO3- en mMol/Litro
Valores Referenciales (Normales):
22 26 mMol/Litro
EXPERIMENTO B:
INVESTIGACION DE CUERPO CETONICOS en la ORINA
Test de Rothera.- Esta prueba depende de la la reaccin entre la Acetona y el
nitroprusiato para formar un complejo coloreado prpura rojizo. Indica la
presencia de acetoacetato y/o acetona.
Reactivos:
Cristales de sulfato de amonio
Solucin de Nitro prusiato al 10% en solucin acuosa, la cual deber ser fresca.
Amoniaco solucin (Hidrxido de amonio concentrado)
Muestra problema: orina
Tubos de prueba de vidrio de 13x 100 mm aproximadamente
Pipetas Pasteur capilares pipetas de vidrio de 1 ml terminales
Esptulas baja lenguas de madera.
Baguetas de vidrio.
Procedimiento:
NO SE DEBERA PIPETAR NINGUN REACTIVO CON LA BOCA. PROHIBIDO
HACERLO. Colocar aproximadamente 2 ml de orina en un tubo de prueba y
aadirle con la esptula aproximadam.0.5 g de sulfato de amonio en cristales.
Disolver con baguete. Aadir 2 3 gotas de sol. Nitro prusiato 10%.
Mezclar bien Por la pared lateral del tubo de prueba, sin pipetear con la boca,
lentamente, en zona deslizar el amoniaco con una pipeta Pasteur pipeta de
vidrio. Debern quedar dos capas bien definidas. Esperar unos minutos y ver la
formacin de un anillo morado en la interface en caso positivo para cuerpo
cetnicos .Si no aparece este color la prueba es negativa.
CUESTIONARIO:
1.- Explique la formacin de cuerpos cetnicos y porque se producen.
2.- Explique las diferencias entre cetoacidosis diabtica y coma hiperosmolar.
3.- Como se diagnostica a un paciente que est en cetoacidosis diabtica?
4.- A qu se llama: exceso de bases y reserva alcalina.
5.- Explique los diferentes mtodos de laboratorio que existen para el dosaje
tanto de bicarbonato en sangre como de cuerpos cetnicos en orina.


PRACTICA N 9
PERFIL LIPIDICO: COLESTEROL TOTAL Y FRACCIONADO
El nivel srico de colesterol ha sido objeto en los ltimos aos de numerosas
investigaciones tanto en individuos sanos como enfermos.
Desde un punto de vista mdico la determinacin de colesterol en forma aislada tiene
utilidad diagnstica limitada. Sin embargo, su concentracin vara de manera ms o
menos predecible en un gran nmero de condiciones clnicas. Se ha visto que el colesterol
es uno de los factores contribuyentes a la formacin de ateromas dado que las
complicaciones arterioesclerticas prevalecen en individuos hipercolesterolemicos.
Diversos estudios epidemiolgicos han permitido observar adems, que el riesgo de
contraer enfermedad cardaca coronaria (ECC) para los individuos (varones de ms de 40
aos) con colesterolemia menor igual a 200 mg% es 3 veces menor que entre
individuos con ms de 230 mg% y 6 veces menor que entre individuos con ms de 260
mg%.
Sin embargo, actualmente se sabe que es necesario conocer adems la distribucin de las
lipoprotenas encargadas del transporte: HDL (lipoprotenas de alta densidad),
considerada como el factor protector y LDL (lipoprotenas de baja densidad),
consideradas como el verdadero factor de riesgo. Las funciones biolgicas inherentes a
los distintos grupos de lipoprotenas, las variaciones en su composicin y los resultados
de los diversos estudios epidemiolgicos, indican que los valores aislados de colesterol
HDL y colesterol LDL no pueden tomarse como ndices predicativos de riesgo, sino que es
necesario conformar un perfil Lipidico con los valores de colesterol total, colesterol LDL y
colesterol HDL.
Experimento A: DETERMINACIN DE COLESTEROL EN SUERO

El colesterol es oxidado enzimticamente por la colesterol oxidasa (CHOD), previa
hidrlisis enzimtica de los esteres mediante una lipasa de origen fungal. El agua
oxigenada generada en la oxidacin, produce la copulacin oxidativa del fenol con la 4aminofenazona (4-AF) mediante una reaccin catalizada por la peroxidasa. El producto es
una quinonaimina roja con absorbancia mxima a 505 nm.
Lipasa
Esteres de colesterol
colesterol + cidos grasos

CHOD
Colesterol + O2
colesten-3-ona + H2O2
POD
H2O2 + 4-AF
4-(p-benzoquinona monoimino)-fenazona + 4 H2O
REACTIVOS:
Standard: solucin de colesterol 200 mg%
Enzimas: suspensin conteniendo lipasa fungal (300 U/ml), colesterol oxidasa (3 U/ml) y
peroxidasa (20 U/l).
Reactivo 4-AF: solucin de 4-aminofenazona (25 mmol/l).
Reactivo Fenol: solucin de fenol (55 mmol/l).
Reactivo de trabajo: de acuerdo al volumen de trabajo colocar en una probeta 50
partes de agua destilada, 5 partes de reactivo 4-AF, 5 partes de reactivo fenol y llevar a
100 partes con agua destilada. Agregar 2 partes de enzimas previamente homogenizadas.
Mezclar por inversin, sin agitar.
PROCEDIMIENTO:
En tres tubos colocar:
Tubos
Standard
Muestra
Reactivo de trabajo
Blanco
----2 ml
Incubar 15 minutos en Bao Mara a 37C.

Leer en el espectrofotmetro a 505 nm.
Standard
20 uL
--2 ml
Muestra
--20 uL
2 ml
CALCULO DE RESULTADOS:
Calcular la concentracin de colesterol total en suero, aplicando el mtodo del factor de
calibracin.
Recordar que la concentracin del standard de colesterol es de 200 mg%
Los valores de colesterol en sangre fluctan segn edad, sexo y hbitos de dieta y de
ejercicio. Sin embargo, es preferible no hacer referencia a valores normales, pues la
norma promedio de una poblacin no necesariamente refleja ausencia de riesgo
patolgico en el caso de colesterol.
Menos de 200 mg%
200
a 239 mg%
Mayor de 240 mg%
valor deseable
valor frontera
valor alto
Experimento B: DETERMINACIN DE COLESTEROL HDL EN SUERO

Las lipoprotenas de alta densidad (HDL) se separan precipitando selectivamente las
lipoprotenas de baja y muy baja densidad (LDL y VLDL) mediante el agregado de
Sulfato de Dextrn de PM 500,000 en presencia de iones Mg++.
En el sobrenadante separado por centrifugacin, quedan las HDL y se realiza la
determinacin del colesterol ligado a las mismas, empleando el sistema ms
conveniente.
REACTIVOS:
REACTIVO PRECIPITANTE.- Contiene una solucin de Sulfato de Dextrn y de
Cl2Mg.H2O
PROCEDIMIENTO:
En un tubo medir 0.5 ml de muestra y agregar 0.05 ml (50 ul) de Reactivo Precipitante.
Homogenizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos.
Dejar 30-40 minutos en refrigeracin (4-10C). No colocar en el congelador.
Centrifugar a 3000 rpm. X 03 minutos
Usar el sobrenadante como muestra.

Tubos
Standard
Muestra Sobrenadante
Reactivo de trabajo
Blanco
----2 ml
Standard
20 ul
--2 ml
Muestra
--100 ul
2 ml

CALCULOS:
De acuerdo al mtodo del factor de calibracin, considerando que la concentracin del
standard es de 45.7 mg%.
VALORES NORMALES:
40 65 mg%
Experimento C: DETERMINACIN DE COLESTEROL LDL EN SUERO

Las lipoprotenas de baja densidad (LDL) se separan del suero precipitndolas
selectivamente mediante el agregado de polmeros de alto peso molecular. Luego
de centrifugar, en el sobrenadante quedan las dems lipoprotenas (HDL y VLDL),
el colesterol ligado a las mismas se determina empleando el sistema ms
conveniente.
Por diferencia entre el colesterol total y el determinado en el sobrenadante, se
obtiene el colesterol unido a las LDL.
REACTIVOS:
REACTIVO PRECIPITANTE.- Solucin de sulfato de polivinilo disuelto en
polietilenglicol (PM 600).
PROCEDIMIENTO:
En un tubo, colocar 0.2 ml (200 ul) de suero problema y aadir 0.1 ml (100 ul) de
Reactivo Precipitante.
Homogenizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos.
Dejar 15 minutos en un bao de agua a 20-25C.
Centrifugar a 3000 rpm. X 03 minutos
Usar el sobrenadante como muestra.

Tubos
Standard
Muestra Sobrenadante
Reactivo de trabajo
Blanco
----2 ml
Standard
20 uL
--2 ml
Muestra
--100 uL
2 ml
Incubar 15 minutos en bao de agua a 37C.

CALCULOS:
LDL Colesterol = Colesterol total - (Abs muestra neta x factor de calibracin)
La concentracin del standard es de 62.4 mg%.
VALORES NORMALES:
Riesgo bajo o nulo: Menor de 140 mg%
Riesgo moderado: 140 a 190 mg%
Riesgo elevado
: Mayor de 190 mg%
CUESTIONARIO:
1.2.3.4.5.-
Qu es RIESGO CORONARIO y como se calcula?

Explique que diferencias hay entre la arterioesclerosis y la ateroesclerosis?
Describa como se produce la biosntesis de colesterol dentro del organismo.
Explique que es el colesterol VLDL y como se calcula.
Que rol cumplen los triglicridos y como se realiza su metabolismo.

PRACTICA N10
PERFIL LIPIDICO II: TRIGLICERIDOS
Los triglicridos forman la mayor parte del peso seco del tejido adiposo, constituyendo
por lo tanto una potente forma de almacenamiento de energa.
El movimiento de cidos grasos entre los distintos compartimientos del organismo, se
produce con gran rapidez en respuesta a diversos estmulos (dieta, actividad fsica,
stress, edad, etc.). Por este motivo es de esperar que los triglicridos (uno de los ms
importantes vehculos para el transporte de cidos grasos) varen tambin su
concentracin en respuesta a estos factores fisiolgicos.
Sin embargo, el equilibrio de estos mecanismos puede verse alterado, conduciendo a
niveles anormales de triglicridos circulantes. La persistencia de esta condicin, se
asocia con numerosas patologas, tales como enfermedad heptica, renal,
Hiperlipidemias esenciales, etc.
Un caso que resulta de particular inters es el aumento de triglicridos en individuos
obesos, en los cuales tiene importancia pronostica, respecto a la probabilidad de
desarrollar enfermedad cardaca coronaria. Alrededor del 50% de los lpidos de las
lesiones ateromatosas que ocurren en las arterias coronarias son triglicridos, por lo
que es posible relacionar a los triglicridos con la patognesis de la arteriosclerosis
coronaria. Este punto de vista est sustentado por el hecho de que un gran porcentaje
de pacientes con infarto de miocardio tambin exhiben Hipertrigliceridemia.
Para la determinacin de triglicridos en suero se usar la determinacin enzimtica de
glicerol a partir de glicridos.
Los mtodos enzimticos se basan en la determinacin del glicerol contenido en las
molculas de los triglicridos, tras la hidrlisis (qumica enzimtica) para remover los
cidos grasos. La determinacin enzimtica del glicerol ha sido usada durante muchos
aos; sin embargo, en estos mtodos se empleaba la hidrlisis alcalina de los
triglicridos. El reciente desarrollo del uso de enzimas (lipasa, usualmente combinada
con una proteasa) para catalizar la hidrlisis, ha posibilitado el empleo de mtodos
directos, rpidos y especficos. Los sistemas totalmente enzimticos eliminan el uso de
reactivos custicos, extraccin con solventes, baos de altas temperaturas y mezclas
de adsorcin para la remocin de Fosfolpidos. Estudios recientes se han concentrado
en desarrollar reactivos con lipasas, que hidrolizan completamente los triglicridos.
Experimento A: DETERMINACIN DE TRIGLICERIDOS EN SUERO

Se producen reacciones qumicas basadas en la determinacin qumica de glicerol a
partir de glicridos.
La primera etapa consiste en que los triglicridos son hidrolizados enzimticamente por
una lipoprotena lipasa especfica, produciendo glicerol y cidos grasos.
Triglicridos
Lipoprotena lipasa
Glicerol + 3 cidos grasos
En una segunda etapa el glicerol se fosforila a glicerol-1-fosfato en presencia de

glicerolkinasa.
Glycerol kinasa
Glycerol + ATP
Glicerol-1-P + ADP
En una tercera etapa el derivado fosforilado se oxida mediante la glicerol fosfato oxidasa
(GPO), con produccin de agua oxigenada.
GPO
Glicerol-1-fosfato + O2
H2O2 + dihidroxiacetonafosfato
Finalmente el agua oxigenada as formada produce la unin oxidativa del fenol y la 4aminofenazona, en reaccin catalizada por la peroxidasa (POD), con formacin de una
quinonaimina roja.
POD
2 H2O2 + 4-AF + clorofenol
4-(p-benzoquinona monoimino) fenazona + 4 H2O
REACTIVOS PROVISTOS:
-
Standard: solucin acuosa de glicerol equivalente a 200 mg% de

triglicridos.
Buffer: solucin de buffer conteniendo clorofenol a pH 7,5.
Enzimas: Viales conteniendo lipoprotena lipasa, glicerol kinasa (GK),
glicerol fosfato oxidasa (GPO), peroxidasa (POD), adenosina trifosfato (ATP)
y 4-aminofenazona (4-AF).
INSTRUCCIONES DE RECONSTITUCION Y MEZCLADO:

-
Standard: listo para usar.

Reactivo de trabajo:
*5/10 x 20 ml: agregar 20 ml de Buffer a un vial de Enzimas.
Mezclar hasta disolucin completa. Homogenizar y fechar.
*4 x 50 ml: reconstituir el contenido de un vial de Enzimas con una porcin
de Buffer y luego transferir al frasco de Buffer enjuagando varias veces.
Homogenizar y fechar.
MATERIAL REQUERIDO:
-
Espectrofotmetro.
Probeta, micro pipetas y pipetas capaces de medir los volmenes indicados.
Frasco de vidrio color mbar.
Cubetas espectrofotomtricas.
Bao de agua a 37C.
Reloj timer.
PROCEDIMIENTO:
Homogenizar la muestra antes de usar, especialmente frente a sueros lechosos.
En tres tubos de ensayo marcados B (Blanco), S (Standard) y M (Muestra), colocar:
Tubos
Muestra
Standard
Reactivo de Trabajo
Blanco
----2 ml
Standard
--20 uL
2 ml
Muestra
20 uL
--2 ml
Mezclar.
Enfriar y leer en espectrofotmetro a 505 nm llevando el aparato a cero con agua
destilada.
Corregir las lecturas con el blanco y usar las lecturas corregidas para los clculos.
Para hallar la concentracin de triglicridos en el suero problema, se debe utilizar el
mtodo del factor de calibracin.
Triglicridos (mg%) = M x Fc
El panel de expertos del National Cholesterol Education Program (NCEP) provee los
siguientes valores de triglicridos:
Deseable: < 150 mg%.
Moderadamente elevado a elevado: 150 199 mg%.
Elevado: 200 499 mg%.
Muy elevado: > 500 mg%.
CUESTIONARIO:
1.- Describa las caractersticas principales de los lpidos y su clasificacin.
2.- Explique la importancia biolgica de los triglicridos.
3.- Como se produce la digestin y absorcin de los triglicridos.
4.- Mencione la proporcin de triglicridos dentro de las lipoprotenas y la accin de la
lipasa lipoproteca.
5.- Enumere los diferentes mtodos tanto qumicos como enzimticos para el dosaje de
triglicridos.


PRACTICA N 11
MASA PROTEICA VISCERAL Y ESQUELTICA
Para evaluar el estado nutricional de una persona utilizamos el metabolismo

proteico (sntesis y degradacin).
Las protenas en el organismo se distribuyen didcticamente en dos
compartimientos:
a) Compartimiento Proteico Visceral.
b) Compartimiento Proteico Somtico esqueltico.
Las protenas del compartimiento visceral se evalan mediante los niveles de
Transferrina, Pre-albmina, Protenas totales y Albmina en suero, que por su
relativamente corto tiempo de vida (albmina es de 20 das) rinde una estimacin
razonable del compartimiento proteico visceral. En esta prctica utilizaremos la
Protena Total y la Albmina srica.
Las protenas del compartimiento somtico esqueltico la evaluaremos mediante
la relacin entre la excrecin de la Creatinina urinaria en 24 horas y la talla de la
persona, relacin que es un fiel ndice de la masa muscular esqueltica.
As mismo mediante el Peso y la Talla se evaluar la masa corporal total.
Experimento A: DETERMINACIN DE PROTEINAS TOTALES Y

ALBMINA EN SUERO
Determinacin de Protenas Totales:
Los enlaces peptdicos de las protenas reaccionan con el in cprico, en medio alcalino,
para dar un complejo color violeta con mximo de absorcin a 540 nm, cuya intensidad
es proporcional a la concentracin de protenas totales en la muestra.
Determinacin de Albmina:
La albmina reacciona especficamente (sin separacin previa) con la forma aninica de la
Bromo Cresolsulfon Ftalenas (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en medio
tamponado a pH 3,8. El aumento de absorbancia a 625 nm respecto al blanco de
reactivo, es proporcional a la cantidad de albmina presente en la muestra.
REACTIVOS:
Reactivo EDTA/Cu: complejo EDTA/Cu 13 mmol/l en NaOH 875 mmol/l y alquil aril poli
ter (AAP).
Reactivo BCF: solucin de Bromo Cresolsulfon Ftalenas (en polioxietiln lauril ter).
Suero Patrn: solucin de albmina y globulinas en estado nativo con ttulo conocido de
protenas (Biuret Kjeldhal) y albmina (unin BCF).
MATERIAL REQUERIDO:
Espectrofotmetro.
Tubos de ensayo.
Bao Mara a 37C.
Reloj timer.
PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DE PROTEINAS TOTALES:
Agua destilada
Suero Patrn
Muestra
Reactivo EDTA/Cu
Blanco
50 uL
----3,5 ml
Mezclar los tubos.

Incubar durante 15 minutos en Bao Mara a 37C.
Leer en espectrofotmetro a 540 nm.
Standard
--50 uL
--3,5 ml
Muestra
----50 uL
3,5 ml
PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DE ALBMINA:

Suero Patrn
Muestra
Reactivo BCF
Blanco
----3,5 ml
Standard
10 uL
--3,5 ml
Muestra
--10 uL
3,5 ml
Mezclar los tubos.

Mantenerlos a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Protenas totales (g/dl) = M x fc
Albmina (g/dl) = M x fc
fc = P.T. (g/dl) / S
fc = Alb. (g/dl) / S
Albmina (g/dl)
Relacin A/G = --------------------------------------Prot. Tot. (g/dl) - Alb. (g/dl)
PROTENAS TOTALES: 6,1 a 7,9 g/dl.
ALBMINA: 3,5 a 4,8 g/dl.
RELACION A/G: 1,2 a 2,2
Experimento B: DETERMINACIN DE CREATININA URINARIA

La Creatinina reacciona con el picrato alcalino en medio tamponado, previa
desproteinizacin con cido pcrico, obtenindose un cromgeno que se mide a 510 nm.
REACTIVOS:
Reactivo 1: cido pcrico 41,4 mmol/l.
Reactivo 2: buffer glicina/NaOH 1 mol/l, pH final 12,4.
Standard: solucin de Creatinina 2 mg%
MATERIAL REQUERIDO:
Espectrofotmetro.
Tubos de ensayo.
Reloj timer.
PROCEDIMIENTO:
Recolectar orina de 24 horas.
Medir la diuresis, tomar una alcuota y efectuar una dilucin 1:50 de la misma.
Luego en tres tubos de ensayo preparar lo siguiente:
Standard
Orina diluida (1:50)
Agua
Reactivo 1
Reactivo 2
Blanco
----1 ml
2 ml
0,5 ml
Standard
0,5 ml
--0,5 ml
2 ml
0,5 ml
Mezclar por inversin.

Incubar 20 minutos a temperatura ambiente.
M
Creatinina en orina (mg/24 horas) = ------ x 20 mg/l x 50 x V
S
Siendo:
V = volumen de la diuresis expresado en litros/24 horas.
M = Absorbancia neta del tubo muestra.
S = Absorbancia neta del tubo standard.
Muestra
--0,5 ml
0,5 ml
2 ml
0,5 ml
900 a 1,500 mg/24 horas.
VALORACIN DEL ESTADO NUTRICIONAL
Relacin Cr U 24h / Talla

(mg 24h/m)
Relacin Peso / Talla
(Kg/m)
Protenas totales (g/dl)
Albmina (g/dl)
PROMEDIO
POBLACIONAL
Hombres: 830
Mujeres: 680
Hombres: 37
Mujeres: 34
7
4
DESNUTRICIN
Hombres: < 660
Mujeres: < 430
Hombres: < 30
Mujeres: < 29
<6
< 3,5
CUESTIONARIO:
1.- Con los datos obtenidos en los experimentos, realizar la valoracin nutricional de
dicha persona sabiendo que es varn, pesa 60 Kg, su talla es 1,56 m y su volumen
urinario en 24 horas fue de 1000 ml.
2.- Como hubiera sido la valoracin nutricional en el caso que la persona hubiera sido
mujer?
3.- Mencione las caractersticas generales de las protenas y su clasificacin.
4.- Qu son las globulinas y cules son sus clases?
5.- Describa los mtodos de dosaje tanto qumicos como enzimticos para protenas
totales, albmina, globulina y Creatinina.


PRACTICA N 12
METABOLISMO DE LA BILIRRUBINA
Base Bioqumica.La bilirrubina es un pigmento amarillo , que se produce en el ser humano a
partir del Ncleo HEM ( que es una Protoporfirina Tipo IX Tetrapirrol
macrocclico, molcula que tiene insertado un tomo de Hierro ).Sobre este ncleo
HEM acta la enzima Oxigenasa Heme de los microsomas. Esta Oxigenasa rompe
el enlace alfa metano del anillo tetrapirrlico y se abre la molcula , convirtindose
en el pigmento verde Biliverdina, el cual es subsecuentemente hidrogenado y
forma Bilirrubina .Esta reduccin la realiza la enzima citoslica biliverdina
reductasa que es
una enzima NADPH dependiente. Por cada mol de HEME
catabolizado por esta ruta se produce un mol de bilirrubina, de CO2 y de in
frrico. La produccin diaria de bilirrubina a partir de todas sus fuentes en el
hombre es de 250 a 350 mg. Aproximadamente el 85% de la bilirrubina total
producida se deriva de la molcula del HEM de la Hb liberada a partir de los
eritrocitos senescentes que son destruidos en el sistema retculo endotelial del
hgado, bazo y mdula sea. El 15% remanente se produce a partir de la
destruccin de las clulas precursoras de los eritrocitos en la mdula sea (
llamada eritropoyesis inefectiva) y tambin proviene del catabolismo de otras
protenas que contienen ncleo Hem como la mioglobina, citocromos, peroxidasa
y que estn distribuidas a travs de todo el organismo.
Despus de su produccin en los tejidos perifricos, la bilirrubina es transportada
al hgado asociada a la albmina .La Bilirrubina es rpidamente captada por los
hepatocitos, se transporta y se conjuga al acido glucurnico ( UDP glucurnico
transferasa) para producir mono y diglucuronato de bilirrubina los cuales se
excretan en la bilis.
y despus de ser excretados hacia el intestino delgado . En el tracto intestinal los
glucornidos de bilirrubina se hidrolizan a la forma no conjugada por el pH al
alcalino del intestino delgado, y por la accin cataltica de la betaglucuronidasa

del hgado, clulas epiteliales intestinales y las bacterias. La bilirrubina no
conjugada es posteriormente reducida por la flora bacteriana anaerbica intestinal
para formar un grupo de tres tetrapirroles incoloros colectivamente llamados
Urobilingeno que luego se reducen y forman tres productos: estercobilingeno,
mesobilingeno y urobilingeno. Hasta el 20% de los urobilingeno producidos
diariamente son reabsorbidos desde el intestino hacia la circulacin para ir al
hgado(Circulacin entero. Heptica). La mayor parte del urobilingeno
reabsorbido es captado por el hgado y es re-excretado en la bilis y solamente un 2
a 5 % entra a la circulacin general y aparece en la orina. En la parte mas baja
del tracto intestinal, los tres urobilingeno se oxidan espontneamente y
producen los pigmentos estercobilina, mesobilina y urobilina, y as estos pigmentos
adquieren color marrn y que son los pigmentos que le dan color a las heces.
Existen enfermedades congnitas y enfermedades adquiridas que afectan uno
mas
de los pasos involucrados
en la produccin, captacin, depsito,
metabolismo y excrecin de la bilirrubina y la hiperbilirrubinemia es
frecuentemente el resultado de estos trastornos. Esta bilirrubinemia puede ser a
predominio No conjugado (Indirecta) Conjugado (Directa) dependiendo del tipo
de desorden.
La hiperbilirrubinemia causa Ictericia. Cuando la cifra de bilirrubina en la sangre
excede de l mg % , existe hiperbilirrubinemia .La hiperbilirrubinemia puede
deberse a la produccin de mas bilirrubina de la que el hgado normal puede
excretar o a la insuficiencia de un hgado daado para excretar la bilirrubina
producida en cantidades normales. Ante la ausencia de dao heptico, la
obstruccin de los conductos excretorios del hgado, previniendo la excrecin de la
bilirrubina, tambin causar hiperbilirrubinemia. En todos estos trastornos, la
bilirrubina se acumula en la sangre y cuando alcanza una cierta concentracin(
aproximadamente de 2 a 2. 5 mg%) se difunde dentro de los tejidos los cuales
adquieren color amarillo, este trastorno se denomina ictericia. La concentracin de
bilirrubina en el suero es de gran valor, por eso en la presente practica la
emplearemos.
Estado
NORMAL
Ictericia
Hemoltica
Hepatitis
Ictericia
Obstructiva
Bilirrubina Srica
Mg%
Conjugada: 0.1 a 0.4
No Conjugada 0.2 a
0.7
Urobilingeno
Urinario
Bilirrubina Urobilingeno
Urinaria
fecal
0.a 4 mg/24 hs
Ausente
40 a 280 mg/
24 hs
Aumentado
Ausente
Aumentado
Disminuido
Presente
Disminuido
Ausente
Presente
Escaso o
ausente
Elevacin No
Conjugada
Elevaciones de
Ambas, con
predominio.
Conjugada
Elevacin de ambas a
predominio
Conjugada
Dentro de las causas de Ictericia Hemoltica tenemos:

Anemias hemolticas, ictericia fisiolgica neonatal (Inmadurez heptica para
captacin, conjugacin y secrecin de la bilirrubina), Sndrome de Crigler-Najar
(Alteracin de la conjugacin de bilirrubina), Enfermedad de Gilbert,
Hiperbilirrubinemia txica (Agentes farmacolgicos).
Experimento A: DOSAJE DE BILIRRUBINA SERICA

FUNDAMENTO:
El suero sanguneo es tratado con el reactivo diazoico (Acido Sulfanlico + Nitrito
de sodio) y se produce un complejo coloreado de color rojo violceo debido a la
presencia de bilirrubina conjugada al acido glucurnico (Directa) color que
desarrolla directamente.. La Bilirrubina no conjugada (Indirecta) requiere adems
la presencia de cafena alcohol metlico para que se desarrolle el color. Entonces
para obtener la produccin de color debido a ambas bilirrubinas debemos aadir
cafena metanol y tendremos la produccin de un color debido a la suma de
ambas bilirrubinas que llamamos Bilirrubina Total. Estos colores son comparados
espectrofotomtricamente con el color producido por una solucin standard de
bilirrubina de concentracin conocida.
REACTIVOS NECESARIOS:
- Desarrollador: Solucin acuosa de Benzoato de Cafena 0,13 mol/l
tamponada y estabilizada.
- Nitrito de Sodio: Solucin de Nitrito de Sodio 0,07 mol/l.
- Reactivo Sulfanlico: Solucin de acido Sulfanlico 29 mmol/l y acido
clorhdrico o,17 mol/l
- Bilirrubina Estndar: Para la calibracin peridica del equipo.
- Agua Destilada.
INSTRUCCIONES DE USO.-
Desarrollador: listo para su uso.

Reactivo Sulfanlico: listo para usar.
Diazorreactivo: de acuerdo al volumen de trabajo, mezclar una parte de
nitrito de sodio con 21 partes de reactivo Sulfanlico. Rotular y Fechar
METODOLOGIA.Colocar los reactivos en tubos de prueba marcados ,segn la siguiente tabla:

Reactivos
Muestra (suero)
Agua destilada
Desarrollador
Rvo. Sulfanlico
Diazorreactivo
Standard
Tubo
Blanco
Tubo
Bilirrubina Directa
Tubo
Bilirrubina Total
(B)
200 uL
2,5 ml
--200 uL
---
(D)
200 uL
2.5 ml
----200 uL
(T)
200 uL
--2.5 ml
--200 uL
Tubo
Standard de
Bilirrubina
(mg %)
----2,5 ml
--200 uL
200 uL
Mezclar de inmediato, cada tubo por inversin.

Reposo 5 minutos a temperatura ambiente.
Lectura en espectrofotmetro en 530 nanmetros, colocando el espectrofotmetro
en cero de Absorbancia con Agua destilada.
Anotar los resultados de cada lectura.
CALCULOS:
Bilirrubina Total mg%
= (T - B) x Factor
Bilirrubina Conjugada (Directa) mg %
= (D B) x Factor
Bilirrubina No Conjugada (Indirecta Libre) = (Bilirrubina Total Bilirrubina
Directa)
-
Adultos = Directa: hasta 0.2 mg/%

Total: hasta 1.0 mg/%
Recin nacidos =
Sangre de cordn
Hasta las 24 horas
Hasta las 48 horas
Del 3 al 5 da
Nacidos a trmino
2.5 mg%
6.0 mg%
7.5 mg%
12.0 mg%
Prematuros
8.0 mg%
12.0 mg%
24.0 mg%
Loa valores comienzan luego a disminuir para alcanzar el nivel promedio del
adulto al mes del nacimiento.
En los prematuros, los niveles de Bilirrubina tardan ms en alcanzar la
normalidad, dependiendo del grado de inmadurez heptica
Experimento B: INVESTIGACION DE UROBILINOGENO EN ORINA
El Urobilingeno se forma en la fase intestinal del metabolismo de la bilirrubina y
se encuentra en todas las orinas normales en muy pequeas cantidades, menores
de 4 mg / 24 hs. Se forma en el intestino como hemos sealado en las clases
tericas por la accin de las bacterias sobre los pigmentos biliares excretados por
el hgado. Tambin dijimos que luego que se excreta la bilirrubina conjugada al
conductillo biliar llega al duodeno; la bilirrubina conjugada no es reabsorbida sino
que: o bien se excreta como tal en la heces, o bien se transforma en
UROBILINOGENO (y derivados asociados) por accin de las bacterias del colon. El
urobilingeno se puede reabsorber en el intestino delgado (leon) y en el colon y
pasa a la circulacin portal, llega al Hgado y all se re-excreta a la bilis y el resto
llega al rin y se excreta con la orina.
Cuando existe una alteracin en la captacin y excrecin heptica de urobilingeno
( como en la enfermedad hepatocelular) la sntesis de bilirrubina como en la
hemlisis, la excrecin diaria del urobilingeno aumentar en forma significativa
Por el contrario, si no pasa bilis al intestino, como en la colostasis u obstruccin
biliar extra heptica interfieren en la fase final del catabolismo de la bilirrubina y
ocasiona un descenso notable en la produccin y excrecin urinaria del
urobilingeno. Entonces, la medida del urobilingeno en la orina resulta muy til
para diferenciar las posibles causa de hiperbilirrubinemia como ocurre en la
obstruccin completa de los conductos biliares, la urobilina estar ausente en la
orina.
La excrecin se incrementar en todas aquellas condiciones en que exista una

excesiva destruccin de los eritrocitos y en aquellos casos de dao parcial del
parnquima heptico. En las nefritis muy avanzadas puede estar ausente la
Urobilina
Fundamento de la prueba de Ehrlich para
Urobilingeno en orina (Mtodo Cualitativo):
la
investigacin
de
Esta prueba se basa en la reaccin entre el urobilingeno y el reactivo de

paradimetil amino benzaldehdo, para rendir un complejo coloreado rojo cereza
Reactivo de Ehrlich:
Disolver 10 gm de Paradimetilaminobenzaldehido
en una mixtura de 75 ml de
agua y y 75 ml de HCl concentrado.
Procedimiento: A 2 ml de orina en un tubo de prueba , aadirle 0.5 ml del
Reactivo de Ehrlich y mezclar bien. Observar el color de la mixtura.
Interpretacin. Cantidades normales de Urobilingeno en la orina no producirn
color. Cantidades aumentadas(patolgicas) del pigmento urobilingeno producirn
un color rojizo cereza que se observa bien mirando el tubo desde arriba del
tubo(boca del tubo) contra un fondo blanco.
En la actualidad usamos para la investigacin de Urobilina en orina el mtodo de
las tiras reactivas que se introducen directamente en la muestra de orina. Estas
cintas estn impregnadas en el rea correspondiente de una sal de metoxibenceno
diazonio estable que produce con el urobilingeno, casi instantneamente un
complejo de color rojo azoico. Se considera normal que en la zona reactiva para
urobilingeno no se produzca decoloracin alguna o que los colores que aparezcan
sean mas claros que los observados para l mg % .Esta prueba es especfica para el
urobilingeno.
CUESTIONARIO:
1.- Explique la formacin de la bilirrubina.
2.- En que casos se produce una elevacin de la bilirrubina total , tanto a
expensas de la bilirrubina directa como de la indirecta.
3.- Como se forma el urobilingeno y qu importancia tiene?
4.- Qu es la ictericia y como se evala.
5.- Cules son los mtodos conocidos para el dosaje de bilirrubina


PRACTICA N13
TRANSAMINACION
IMPORTANCIA CLINICA:
Las transaminasas son enzimas ampliamente difundidas en el organismo, que
catalizan la transferencia de un grupo amino de un aminocido a un cetocido, en
una de las ms importantes reacciones del metabolismo proteico. El inters clnico
est centrado especialmente en dos de ellas: TGO (transaminasa glutmico
oxalactica) y TGP (transaminasa glutmico pirvica).
Estas enzimas tienen accin eminentemente intracelular, por lo que la actividad
srica en condiciones normales es baja o nula. Un aumento de la actividad ser
evidencia de un deterioro de los tejidos en que se encuentran, de los cuales
resultan particularmente importantes corazn e hgado.
Se ha observado que luego de un infarto de miocardio se produce en suero un
marcado aumento de la actividad de la TGO, debido a la liberacin al torrente
sanguneo de esta enzima, tan abundante en msculo cardaco.
En este caso no existir aumento en la actividad srica de TGP ser mnimo.
En hepatitis virales y otras formas de enfermedad heptica que involucren necrosis
de tejido, habr un incremento considerable de la actividad srica de
transaminasas, incluso antes de la aparicin de sntomas clnicos como ictericia.
En este caso, la TGP ser la enzima predominante debida a su gran concentracin
en el tejido heptico.
Una elevada actividad de transaminasas puede detectarse tambin en traumas
accidentales o quirrgicos y en distrofias musculares y miosis.
Una reaccin de transaminacin consiste en la interconversin de un grupo amino
(NH2-CH-COOH) de un aminocido, con un grupo cetnicos (O=C-COOH) de un
cetocido. Este intercambio est catalizado por enzimas conocidas con el nombre
de transaminasas. En el suero humano, por lo general, se determinan dos tipos
principales: la Glutmico Oxalactica (TGO) y Glutmico Pirvica (TGP).
Ellas catalizan las siguientes reacciones:

TGO
L-aspartato +
-cetoglutarato
Oxalacetato + glutamato
TGP
L-alanina +
-cetoglutarato
Piruvato + glutamato
El Oxalacetato y el Piruvato as formados, reaccionan con el reactivo 2,4dinitrofenilhidrazina (2,4 DNFH), generando fenilhidrazonas, las cuales en medio
alcalino (NaOH) producen un complejo coloreado cuya intensidad es proporcional
a la actividad enzimtica de transaminasas en la muestra.
REACTIVOS:
1.- Sustrato TGO:
Solucin conteniendo 100 mmol/l de l-aspartato y 2 mmol-l de alfacetoglutarato en buffer fosfatos 100 mmol/l, pH 7,4.
2.- Sustrato TGP:
Solucin conteniendo 200 mmol/l de l-alanina y 2 mmol/l de alfaCetoglutarato en buffer fosfatos 100 mmol/l, pH 7,4.
3.- Reactivo 2,4-DNFH:
Solucin conteniendo 1 mmol/l de 2,4-dinitrofenilhidrazina en cido clorhdrico
1 mmol/l.
Esta solucin es corrosiva y debe guardarse en frasco oscuro.
4.- Standard de Calibracin:
Solucin de Piruvato de sodio 2 mmol/l. Para efectuar la curva de calibracin.
Listo para usar en la curva de TGP. Diluir 1:2 con sustrato par la curva de
TGO.
5.- Hidrxido de Sodio Diluyente para Enzimas concentrado:
Solucin de hidrxido de sodio 4 mol/l
Antes de usarse, se deber diluir el contenido de este frasco a 1 litro de agua

destilada para as alcanzar la concentracin requerida de NaOH 0.4mol/l.
Es importante notar que el hidrxido de sodio debe conservarse en frasco de
plstico y no de vidrio. Conservar el frasco lejos del reactivo de color pues los
vapores pueden contaminar ambos reactivos.
EXPERIMENTO A
DETERMINACIN DE TRANSAMINASAS (TGO Y TGP) EN SUERO

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR TGO TGP EN SUERO:
Preparar los tubos:
Blanco
Sustrato (TGO TGP)
Muestra
0.5 ml
0.5 ml
Colocar en Bao Mara a 37C unos minutos y luego agregar:

Muestra (suero)
Agua destilada
--100 uL
100 Ul
---
Mezclar por agitacin suave e incubar exactamente 30 minutos y agregar:

Reactivo 2,4-DNFH
0.5 ml
0.5 ml
Mezclar. Dejar 10 minutos a 37C. Luego agregar:

NaOH 0.4 mol/l
5 ml
5 ml
Mezclar por inversin y retirar del bao. Despus de 2 minutos leer en el

espectrofotmetro a 505 nm, llevando el aparato a cero de absorbancia con agua
destilada.
NOTA: Para el clculo de resultados se debe emplear una curva de calibracin.
EXPERIMENTO B
PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIN DE LA CURVA DE

CALIBRACIN
Antes de utilizar por primera vez el juego de reactivos, preparar una curva de
calibracin para TGO y otra para TGP, de acuerdo a las siguientes indicaciones:
Pipetear en dos series de tubos:
Tubo
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
Agua
destilada
(ml)
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
Sustrato
(ml)
1.00
0.95
0.90
0.85
0.80
0.75
0.70
0.60
0.50
Standard de
calibracin
(ml)
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.40
0.50
TGO
(U/l)
TGP
(U/l)
0
7
12
20
28
37
48
81
---
0
9
18
25
37
46
56
79
113
Nota: Utilizar sustrato TGO para la curva de calibracin de TGO y sustrato TGP
para la curva de calibracin de TGP, respectivamente.
Mezclar y agregar a cada tubo, 1 ml de reactivo 2,4-DNFH.
Mezclar. Incubar 10 minutos a 37C.
Agregar 10 ml de hidrxido de sodio 0.4 mol/l a cada tubo.
Mezclar y esperar 10 minutos a temperatura ambiente antes de leer.
Leer la Transmitancia a 505 nm usando agua destilada como blanco de lectura. El
color es estable durante solo 30 minutos.
Restar a cada lectura la obtenida con el tubo N1, obtenindose las Absorbancias
Netas.
Graficar en papel milimetrado los valores de absorbancias netas en el eje vertical,
y en el eje horizontal las U/l de TGO TGP segn sea el caso, que se indica en la
tabla superior.
Determinar en el grfico los puntos correspondientes a cada tubo. Unindolos se
obtienen las curvas respectivas para TGO y TGP.
Tener en cuenta que para cada tcnica debe utilizarse el grfico correspondiente.
Se consideran valores normales de transaminasas (TGO y TGP) hasta 12 U/l. Si
bien se han hallado individuos normales con valores hasta 18 U/l, los niveles de
transaminasas que se encuentren entre 12 y 18 U/l deben considerarse
sospechosos.
CUESTIONARIO:
1.- Explique en que consiste el fenmeno de transaminacin y donde se realiza
en el organismo?
2.- Que relacin existe entre las transaminasas y las enfermedades hepticas?
3.- Como se encuentran las transaminasas en el infarto agudo de miocardio?
4.- Seale cules son los mtodos de anlisis conocidos para dosaje de
transaminasas?
5.- Existe variacin de transaminasas con la edad?


PRACTICA N14
BALANCE NITROGENADO
El objetivo de esta prctica es evaluar el metabolismo proteico empleando el
Balance Nitrogenado. Explicaremos los parmetros ms representativos de la
excreta nitrogenada en general.
Se evala los egresos de N mediante el nitrgeno ureico urinario en 24 horas y la
excrecin de nitrgeno creatinnico urinario en 24 horas empleando la formula de
nitrgeno total estimado (NTE), segn Ramrez Velazco.
FORMULA:
BN = INGESTA N (NTE + 2)
NTE = N. UREICO + N. CREATININICO
Excrecin fecal: 2 gr/24 horas.

N Ingerido: gr de protenas/6.25
Nota: Si el paciente presenta albuminuria, aadir a la excreta:
Protena urinaria/6.25
EXPERIMENTO A : DETERMINACIN DE CREATININA URINARIA

La Creatinina se forma endgenamente en el metabolismo muscular y es removida
de la sangre por filtracin glomerular y excretada en la orina sin ser reabsorbida en
los tbulos. Por lo tanto, es el rin el que regula, como nico rgano excretor, el
nivel de Creatinina en la sangre. Si se restringe la funcin renal aumenta la
Creatinina en el plasma, proporcionalmente a la lesin orgnica. Un aumento
continuo aunque escaso del nivel de Creatinina en suero debe considerarse como
un signo de pronstico desfavorable, ya que puede tratarse de una irreparable
restriccin de la funcin renal.
Como se forma en el organismo, los factores exgenos no pueden influir su nivel
srico. Por este motivo la determinacin simultnea de la Creatinina en suero y
orina permite el clculo del clarense o depuracin de Creatinina y representa un
mtodo excelente de la medida de la filtracin glomerular.
En un medio alcalino que contiene picrato, la Creatinina presente en la muestra,
reacciona con ste formando un complejo rojizo, cuya mayor absorcin se da a
530 nm.
Creatinina + picrato
Complejo Creatinina-picrato
REACTIVOS:
Reactivo 1.- Solucin de cido pcrico 0.05M
Reactivo 2.- Solucin de hidrxido de sodio 0.75N
PROCEDIMIENTO:
Recolectar orina de 24 horas.
Diluir la orina completando a 2000 ml con agua destilada.
Nota: Si el volumen de la orina recolectada durante las 24 horas supera los 2000
ml la prueba debe realizarse sin diluirla, pero en el momento de realizar los
clculos en vez de multiplicar el resultado por 2000, debe multiplicarse por el
volumen total (ml).
Orina diluida
Standard
Agua
Reactivo 1
Reactivo 2
Blanco (ml)
----2.5
3.5
1.0
Standard (ml)
--1.0
1.5
3.5
1.0
Muestra (ml)
0.02
--2.5
3.5
1.0
Mezclar bien.
Despus de transcurridos 20 minutos leer la absorbancia a una longitud de onda
de 530 nm contra el blanco.
CALCULOS:
Abs muestra
Creatinina en orina (mg/24 h) = ------------------ x 2000
Abs standard
VALORES NORMALES: 500 1500 mg/24 h.
Dato: Creatinina x 0.37 = Nitrgeno creatinnico.
EXPERIMENTO B : DETERMINACIN DE UREA URINARIA

El producto final ms importante del metabolismo proteico es la UREA. Esta es
excretada en la orina en mayor cantidad que cualquier otra sustancia.
Concentraciones elevadas de urea en sangre son indicador de una inadecuada
funcin excretora y por consiguiente de la funcin renal.
La urea sangunea puede aumentar por otras razones adems de excrecin renal
insuficiente, dichas causas se clasifican en: Pre-renal, son los estados en los cuales
se altera la circulacin por el rin y Post-renal por obstruccin de las vas
urinarias. Por ello la informacin ms exacta con respecto a la habilidad excretora
de la urea por los riones requiere de una comparacin de la concentracin de
urea en sangre (BUN) y en la orina. Fisiolgicamente la urea se eleva debido a una
dieta hiperproteica o con la edad y disminuye durante una dieta de bajo valor
proteico.
La urea presente en la muestra es hidrolizada hasta amonaco y dixido de
carbono, mediante una reaccin catalizada por la enzima ureasa:
Urea + H2O
Ureasa
CO2 + 2 NH3
El amonaco en presencia de una base reacciona con fenol e hipoclorito de sodio

formando azul de indo fenol. La intensidad de color azul es proporcional a la
cantidad de urea en la muestra.
REACTIVOS:
Reactivo 1.- Solucin de fenol y nitro prusiato de sodio.
Reactivo 2.- Solucin de hipoclorito de sodio en NaOH 0.625N
Enzima.- Solucin de ureasa.
PROCEDIMIENTO:
Se diluye la orina a 1:50 con agua destilada.

Blanco (ml)
----2 gotas
Standard
Orina diluida
Enzima
Standard (ml)
0.01
--2 gotas
Muestra (ml)
--0.01
2 gotas
Mezclar e incubar los tubos en un Bao Mara a 37C por 5 minutos.

Asegurarse que los reactivos no se hayan quedado en las paredes de los tubos.
Luego agregar en cada tubo, 1 ml del Reactivo 1, y posteriormente 1 ml del
Reactivo 2.
Mezclar el contenido de los tubos e incubarlos en un bao de agua a 37C por 5
minutos.
Transcurrido este tiempo agregar 4 ml de agua destilada en cada tubo.
Mezclar los tubos por inversin y proceder a leer la absorbancia en un
espectrofotmetro a 540 nm vs el blanco.
CALCULOS:
Abs muestra
Urea (mg/dl) = --------------------- x 60 x Factor de dilucin
Abs standard
Dato:
Urea x 0.466 = Nitrgeno ureico.
VALORES NORMALES:
Nitrgeno ureico.- 7 a 14 gr/24 hrs.
Urea.- 15 a 30 gr/24 hrs.
BN = Ingesta nitrogenada (N ureico + N creatinnico + 2)
BN = ...................... gr/24 hrs.
CUESTIONARIO:
1.- Con los datos obtenidos en la prctica, calcular el balance nitrogenado del
paciente sabiendo que ingiri 8 gr de protenas en 24 horas .
2.- De donde proviene la Creatinina?
3.- A que se denomina uremia y que consecuencias trae?
4.- A que se llama BUN y que representa?
5.- Para que sirve la depuracin de Creatinina en orina de 24 horas?

G.p.bioquimica y Nutricion

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UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

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