TEMA 14

Mtodos inmunolgicos para la

identificacin microbiana

Tema 14. Mtodos inmunolgicos para la identificacin microbiana

1. Introduccin
2. Deteccin de antgenos
2.1. Obtencin de anticuerpos
2.2. Marcado de las inmunoglobulinas
2.3. Tcnicas de deteccin
2.3.1. Aglutinacin indirecta
2.3.2. Inmunofluorescencia
2.3.3. Enzimoinmunoanlisis (ELISA)
3. Deteccin de anticuerpos
3.1. Clases de antgenos
3.2. Muestras de suero
3.3. Pruebas serolgicas
3.3.1. Aglutinacin directa
3.3.2. Inmunofluorescencia
3.3.3. Enzimoinmunoanlisis (ELISA)

1. Introduccin
Antgenos y anticuerpos son complementarios
antgeno

posible detectar anticuerpo especfico (suero)

anticuerpo

posible detectar antgeno especfico (muestra)

Pruebas para deteccin de anticuerpos: pruebas serolgicas (suero)

Reacciones inmunolgicas
portaobjetos
tubos convencionales (plstico
o vidrio) 12 x 100 mm
placas de microtitulacin
(micropocillos 8 mm y 12
mm alto)

2. Deteccin de antgenos
Algunas de estas tcnicas son muy tiles para el diagnstico
rpidas (confirmadas por otras)
tcnicas de referencia (elevada eficacia)
Muy tiles para identificacin de virus y clamidias (ms rpidas, sencillas,
econmicas y sensibles que el cultivo) (algunas automatizadas)
Se investiga un nico microorganismo en cada prueba (caro y laborioso)
establecer cuidadosa evaluacin clnica del paciente
solicitar la prueba para detectar microorganismo responsable (mayor
probabilidad)

2.1. Obtencin de anticuerpos

Anticuerpos
policlonales (animales inmunizados)
monoclonales (producidos in vitro)
Todos los anticuerpos pueden fijarse a travs de su fragmento Fc a:
base de un pocillo de plstico

Anticuerpo
Sitio de
unin

superficie de una membrana

Antgeno

partculas inertes (ltex, gelatina, oro coloidal)

Fragmento o
regin Fc

2.2. Marcado de las inmunoglobulinas

Inmunoglobulinas marcadas sirven para detectar antgenos y otros anticuerpos
Marcado del fragmento Fc con:
Enzimas (-galactosidasa, fosfatasa
alcalina, peroxidasa de rbano)
- actan sobre sustrato
- transformacin en producto coloreado (o diferente color)
Sustancias fluorescentes (isotiocianato de fluorescena, rodamina,
umbeliferona, lantnidos)
- producen luz cuando son excitadas por radiacin incidente
Sustancias lumnicas (luminol, isoluminol, steres de acridina, adamantil
dioxietano)
- producen luz (reaccin qumica, oxidacin, quimioluminiscencia)

2.3. Tcnicas de deteccin

Si el microorganismo buscado no est en la muestra
los anticuerpos no se unen a l
no se produce seal
Si el microorganismo est presente en la muestra
los anticuerpos se unen a l
se producir el efecto o la seal correspondiente
- aglutinacin
- cambio de color del sustrato
- fluorescencia
- luz

2.3.1. Aglutinacin indirecta

Anticuerpos adheridos por
regin Fc a:
partculas grandes de ltex
(poliestireno, 1-5 m)
otras partculas inertes
Facilita la observacin de la
aglutinacin:
formacin de grumos (de
gran tamao)
Permite deteccin de antgenos
solubles (polisacrido)
Realizable sobre portaobjetos

2.3.1. Aglutinacin indirecta

Rpida (minutos)
Generalmente menos sensible que enzimoinmunoanlisis
Salvo excepciones no muy adecuada para detectar antgenos vricos (menor
cantidad que bacterianos)

2.3.2. Inmunofluorescencia
Directa (IFD)
Anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes
se fijan a los microorganismos
Microscopio de fluorescencia
microorganismo brillante
sobre fondo oscuro
Virus
no pueden ser observados
(pequeo tamao)
se pueden detectar protenas vricas (producidas durante multiplicacin)
- anticuerpos especficos para esas protenas

2.3.2. Inmunofluorescencia
Indirecta (IFI)
Utiliza dos anticuerpos:
- Primero
no marcado
se une al antgeno
- Segundo
dirigido contra el primero
(anti-anticuerpo)
est marcado
permite revelar diferentes
anticuerpos especficos no marcados

2.3.2. Inmunofluorescencia

2.3.3. Enzimoinmunoanlisis (ELISA)

ELISA: enzyme linked immunosorbent assay
Mtodo directo
Anticuerpos fijados en base de pocillo de placa de microtitulacin o membrana de
nitrocelulosa (especficos del antgeno buscado).
Se aade muestra al pocillo: antgeno presente
Se aade segundo anticuerpo
dirigido contra el antgeno
marcado con enzima

reaccin Ag - Ac

2.3.3. Enzimoinmunoanlisis (ELISA)

Tcnica en pocillos

Tcnica sobre nitrocelulosa

2.3.3. Enzimoinmunoanlisis (ELISA)

Mtodo indirecto (sandwich)
Anticuerpos (generalmente monoclonales) fijados en base de pocillo de placa de
microtitulacin o membrana de nitrocelulosa (especficos del antgeno buscado).
Anticuerpo anti-Ig
unido a enzima

Se aade muestra al pocillo

antgeno presente

Sustrato
incoloro

reaccin Ag - Ac

Se aade un segundo anticuerpo

Anticuerpo
de deteccin

Producto
coloreado

generalmente policlonal
dirigido contra el antgeno

Antgeno diana

Se aade un tercer anticuerpo

dirigido contra el segundo anticuerpo
marcado con enzima

Anticuerpo de fijacin
(o de captura)

2.3.3. Enzimoinmunoanlisis (ELISA)

Se aade sustrato (incoloro)

Enzima

Sustrato
sin color

Acta enzima sobre sustrato

Aparece color

Segundo
anticuerpo
(o tercero)

se puede medir intensidad

(colormetro)
Si no existe antgeno buscado
no es retenido en el pocillo
es eliminado mediante lavado
al aadir sustrato no se
produce color

Producto
coloreado

3. Deteccin de anticuerpos
Mtodo de diagnstico indirecto
Detectan anticuerpos formados frente al microorganismo (en suero del paciente)
Tcnicas semejantes a las descritas para la deteccin de antgenos
La mayora permiten cuantificar los anticuerpos del suero
3.1. Clases de antgenos
Naturales
microorganismos ntegros
extractos antignicos (ms o menos purificados) obtenidos de ellos
Recombinantes
se obtienen por ingeniera gentica

3.2. Muestras de suero

Extraer sangre (5-10 mL)
Dejarla coagular (temperatura ambiente, 20 minutos)
Centrifugar 1.000-1.200 g, 10 minutos (separar el suero)
Guardar suero 4-6C (una semana; -20C (aos, si se evita descongelar y congelar
repetidamente)
3.3. Pruebas serolgicas
Todos los resultados se refieren a anticuerpos totales
Aglutinacin directa, inmunofluorescencia y enzimoinmunoanlisis (ms
utilizadas)
3.3.1. Aglutinacin directa
Portaobjetos, tubos de ensayo o placas de microtitulacin
Antgeno (suspensin del microorganismo); si hay anticuerpos en
el suero, se produce aglutinacin

3.3.1. Aglutinacin directa

Patrn caracterstico
Tubo
- sobrenadante transparente
- formacin de muchos
grumos (al resuspender
el sedimento)
Pocillos
- sedimento amplio y granulado
(reaccin positiva)
- botn puntiforme central (reaccin
negativa)
Permite la cuantificacin de anticuerpos
mediante el clculo del ttulo de anticuerpos

3.3.2. Inmunofluorescencia

3.3.3. Enzimoinmunoanlisis (ELISA)

Antgeno

Anticuerpo secundario
anti-anticuerpo del paciente
Enzima
Sustrato sin color

Anticuerpo primario del paciente producido

contra el antgeno (microorganismo)
Pocillo o membrana

Producto coloreado