Anda di halaman 1dari 22

Laporan Praktikum Biologi Oral Praktikum II

BIOFILM BAKTERI

Oleh:
Kelompok B3-B4
Annisa Galuh Prasetyo021111066
Aulia Ramadhani 021111067
Christiana Ayu Maharani021111068
Fyrial Putri Nabila021111069
Dhian Afriyani021111071
Dyah Sinta Fitriani021111072
Regina Purnama D.I021111073
Lia Ismatul M021111074
Fiesta Devy K021111076
Dina Puspitasari
021111077

Joseph Leonardo 021111078


Cornelia Melinda 021111079
Nayu Nur Annisa S 021111080
Nabilla Vidyazti 021111082
Muhammad Taufik Ari S 021111085
Anastasia Audrey 021111086
Hillary Desiree Raharyani 021111087
M Lutfi 021111088
Rizka Dwi Nur V
021111089

Departemen Biologi Oral


Fakultas Kedokteran Gigi UNAIR
Semester Ganjil 2013/2014
0

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Biofilm merupakan kumpulan beberapa jenis mikroba yang menghasilkan matriks
lipopolisakarida (LPS) dan memproduksi matriks polimer sehingga memiliki kemampuan
perlekatan. Hal ini digunakan bakteri untuk pemberi nutrisi, pelindung terhadap efek
antibiotik, antiseptik, desinfektan, sistem imun host, maupun persaingan dengan bakteri
lain.
Antibiotik

tidak

dapat

menghilangkan

biofilm

karena

adanya

matriks

polisakarida.Antibiotik hanya dapat membunuh bakteri planktonic, tetapi koloni bakteri


yang padat di dalam biofilm tidak terpengaruh oleh efek antibiotik dan tetap ada dan
dapat terus berkembang. Salah satu sifat biofilm adalah dapat melepaskan sel-sel
planktonic yang nantinya dapat menempel pada permukaan yang lain dan menjadi
biofilm baru. Apabila bakteri di dalam biofilm ini terus berkembang, maka kemungkinan
terjadinya biofilm yang baru akan menjadi lebih besar. Biofilm hanya dapat dihilangkan
dengan cara mekanik seperti sikat gigi.
Pada rongga mulut, tak semua bakteri dapat menghasilkan biofilm.Namun,
bakteri-bakteri seperti A. actinomycetemcomitans, S. mutans, dan P. gingivalis dapat
membentuk biofilm di dalam rongga mulut. Maka dari itu, penting diketahui bagaimana
proses pembentukan dan karakteristik biofilm. Hal ini dapat digunakan untuk melakukan
penelitian selanjutnya seperti menanggulangi resistensi biofilm, agar bakteri penyebab
penyakit gigi dan mulut dapat dihilangkan.

1.2 Tujuan Praktikum


Mengetahui kemampuan beberapa macam bakteri dalam pembentukan biofilm
secara in vitro, yaitu bakteri A.actinomycetemcomitans. P.gingivalis dan S.mutans.

1.2.1 Tujuan Khusus


1

1. Menumbuhkan biofilm A. actinomycetemcomitans sebagai bakteri penyebab utama


periodontitis agresif
2. Menumbuhkan biofilm P. gingivalis sebagai bakteri penyebab utama periodontitis
kronis
3. Menumbuhkan biofilm S. mutans sebagai bakteri penyebab utama karies gigi.
1.3 Alat dan Bahan
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.

Cawan petri
Mikro pipet
Eppendorf
Tabung falcon
Anaerobic jar
Inkubator
Oese
Tabung reaksi
Stok
bakteri

k. Stok bakteri S.mutans


l. Kaldu kedelai Trypticase
(BD Biosystems)
m. 8 g glukosa / ltr pada 37 C
dalam CO2 10%.
n. Phosphate Buffer
A.

actinomycetemcomitans
j. Stok bakteri P.gingivalis

Saline

(PBS), pH 7,2
o. Kristal Violet atau Safranin
atau Tryphan Blue

1.4 Cara Kerja


Pada praktikum ini, stok dan kultur bakteri telah dipersiapkan sebelumnya, sehingga tidak
dilakukan proses persiapan bakteri saat praktikum.
1. Memanen sel yang melekat pada tabung reaksi dengan menggunakan vortex dan dilakukan
sentifugasi.
2. Mensuspensikan endapan/ pelet yang didapatkan pada PBS (pH 7,2) sehingga didapatkan
kekeruhan yang diinginkan setara dengan standar 0,5 McFarland.
3. Melakukan pengecetan dengan menggunakan kristal violet atau tryphan blue atau safranin
setelah tabung kosong.
4. Menilai biofilm. Biofilm dinilai berdasarkan dari hasil pengamatan pada dinding tabung
reaksi dan pengamatan dilakukan oleh 3 (tiga) orang pengamat independen . Pemberian skor
pada biofilm : 0 : apabila tidak terbentuk biofilm, 1 : pembentukan biofilm lemah, 2 :
pembentukan biofilm sedang dan 3 : pembentukan biofim kuat. Kemudian dihitung
reratanya.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Biofilm
2.1.1 Definisi
Biofilm adalah kolonisasi dari mikroorganisme menempel permukaan substrat dan
dilapisi matriks ekstraseluler yang tipis. Biofilm bakteri melindungi bakteri dari pengaruh negatif
lingkungan.Bakteri menjadi lebih tahan terhadap antibiotik.
Bakteri memiliki kemampuan untuk menempel pada permukaan padat, pada saat kondisi
tersebut memungkinkan dijadikan sebagai media pertumbuhan dan perkembangan bakteri
tersebut maka lama kelamaan bakteri tersebut akan terakumulasi menjadi biofilm.

Biofilm adalah sekumpulan mikroorganisme yang menempel pada suatu permukaan


padat oleh perantara senyawa ekstraseluler yang di produksi oleh bakteri yang terlibat. Faktor
yang mempengaruhi pembentukan biofilm diantaranya adalah jenis permukaan, asal isolat,
kondisi media pertumbuhan, dan kondisi anaerobik (Characlis dan Marshal, 1990).
2.1.2 Proses pembentukan biofilm
a. Perlekatan awal bakteri
i. Pembentukkan biofilm diregulasi oleh faktor genetik dan lingkungan dari
bakteri. Studi genetik menunjukkan bahwa mobilitas bakteri, protein sel
membran, dan ekstraseluler polisakarida dan signal antar molekul
memerankan peran yang penting dalam pembentukkan biofilm. Bakteri
memiliki dua tipe protein yang berkembang ada permukaan bakteri, yaitu
flagel dan fimbri atau fili. Flagel memiliki bentuk yang panjang dan
berbentuk spiral sehingga memudahkan bakteri untuk berada pada media
yang cair, sedangkan fimbri memiliki bentuk yang pendek dan lurus yang
memudahkan bakteri untuk bergerak pada permukaan substrat. Mobilitas
bakteri oleh flagella dibutuhkan dalam koneksi antara bakteri dan
permukaan,

sedangkan

fimbri

diperlukan

dalam

pembentukkan

mikrokoloni bakteri. Koneksi antara bakteridan permukaan substrat dijaga


oleh protein sel membran yang spesifik yaitu adesin. Jika aktivitas adesin
dihambat, maka tidak akan terbentuk biofilm.
b. Perlekatan permanen bakteri
i. Eksopolisakarida (EPS) berperan penting dalam pembentukkan biofilms.
Aktivasi gen dibutuhkan untuk sintesis EPS. Sintesis EPS dapat terjadi
setelah interaksi bakteri dan permukaan substrat telah stabil. Bakteri akan
kehilangan kemampuan membuat biofilm apabila gen yang bertanggung
jawab dalam sintesis EPS mengalami inaktivasi. Selanjutnya bakteri akan
saling mengirim sinyal dan membentuk koloni, sehingga terbentuk biofilm
yang merupakan organisme multiseluler.
c. Maturasi dan perkembangan biofilm
i. Bakteri yang telahmembentuk koloni akan mengalami pematangan dan
selanjutnya koloni bakteri tersebut akan siap untuk menyebar dan
membentuk koloni ditempat lain. Pada tahap ini bakteri memiliki
4

resistensi terhadap faktor lingkungan yang dapat merusak bakteri tersebut


seperti antibiotik dan faktor lainnya. (Maric S, et al, 2007)
2.1.3 Fungsi biofilm bagi bakteri
Fungsi utama pembentukkan biofilm oleh bakteri adalah untuk bertahan hidup dan
melindungi diri dari lingkungan sehingga bakteri dapat tumbuh dengan baik.(Madigan MT, et al,
2006)
1. Pertahanan
Biofilm berfungsi sebagai mekanisme pertahanan bagi bakteri dengan cara
meningkatkan resistensi terhadap sel-sel yang dapat membunuh bakteri, fagositosis oleh
sel-sel sistem imun tubuh, dan penetrasi dari senyawa beracun seperti atibiotik. Bakteri di
dalam biofilm lebih resisten 10-1.000 kali dibandingkan bila tidak di dalam biofilm.
2. Pelekatan pada substrat
Dengan menggunakan biofilm, bakteri dapat melekat pada permukaan yang kaya
akan nutrisi seperti jaringan sel hewan, atau permukaan substrat pada sistem yang
mengalir.
3. Kolonisasi
Pembentukan biofilm membantu sel-sel bakteri untuk hidup berdekatan dan
membentuk koloni.memfasilitasi komunikasi antar sel dengan molekul sinyal, dan
meningkatkan peluang pertukaran materi genetik.
4. Cara hidup alami bakteri
Di alam, biofilm adalah cara hidup alami bagi beberapa bakteri tertentu dengan
alasan terbatasnya nutrisi, tidak seperti medium buatan yang kaya akan nutrisi bagi
bakteri. (Madigan MT, et al, 2006)

2.1.4 Keuntungan dan kerugian biofilm


Biofilm bisa berada di lingkungan alam, industri maupun di kesehatan. Keberadaan
biofilm bisa menguntungkan bisa merugikan, tergantung dimana dan kapan tumbuhnya. Pada
5

instalasi

pengolahan

air

limbah,

bioremediasi

dan

biofilter, biofilm

justru

dipacu

pembentukannnya karena membantu proses treatment.


Di bidang kesehatan biofilm dikenal sangat berbahaya karena menjadi penyebab dari
80% penyakit. Biofilm di kateter dan peralatan kesehatan lainnya bisa menyebabkan infeksi dan
bahkan juga penolakan implant. Beberapa penyakit yang disebabkan biofilm adalah dental
caries, periodonitis, endocarditis, infeksi paru, infeksi kandung kemih, infeksi yang terkait
dengan peralatan artifisial (implant). Di lain pihak di dalam sistem pencernaaan, terutama di usus
besar keberadaan biofilm sangat bermanfaat bagi kesehatan (http://www.chem-is-try.org).
2.1.5 Komposisi biofilm
Komposisi biofilm terdiri dari sel-sel mikroorganisme, produk ekstraseluler,detritus,
polisakarida sebagai bahan pelekat, dan air yang adalah bahan penyusun utama biofilm dengan
kandungan hingga 97%. Polisakarida (polimer dari monosakarida atau gula sederhana) yang
diproduksi oleh mikrob untuk membentuk biofilm termasuk eksopolisakarida (EPS) yaitu
polisakarida yang dikeluarkan dari dalam sel. EPS yang disintesis oleh sel mikrob berbeda beda
komposisi dan sifat kimiawi dan fisikanya. Beberapa adalah makromolekul yang bersifat netral,
namun mayoritas bermuatan karena keberadaan asam uronat (Asam D-glukuronat), Asam Dgalakturonat, dan Asam D-manuroniat. Ada biofilm yang bersifat kaku karena EPS-nya terdiri
dari ikatan -1,4 atau -1,3 glikosida (ikatan monosakarida monomer penyusun polisakarida)
seperti EPS xanthan gum yang dihasilkan oleh Xanthomonas campestristetapi ada juga yang
bersifat fleksibel karena memiliki ikatan -1,2 atau -1,6 glikosida yang banyak ditemukan pada
dekstran Beberapa contoh EPS selain xanthan gum adalah asam kolanat yang diproduksi oleh
Escherichia coli, alginat oleh P. aeruginosa, dan galaktoglukan oleh Vibrio cholerae. Bahanbahan

penyusun

biofilm

yang

lain

contohnya

adalah

protein,

lipid,

dan

lektin

(http://id.wikipedia.org/wiki/Biofilm).
Struktur dari suatu biofilm adalah unik tergantung dari lingkungan tempatnya berada,
contohnya adalah kandungan nutrisi dan keadaan fisik. Selain itu, di alam, sangat jarang terdapat
biofilm yang hanya terdiri dari satu spesies, biasanya biofilm tersusun dari beberapa spesies
dalam lapisan-lapisan yang berbeda. Biasanya mikroorganisme fotosintetik ada di permukaan
paling atas, mikroorganisme kemoorganotrof anaerob fakultatif di bagian tengah, sedangkan di
6

bagian dasar adalah mikroorganisme anaerob pereduksi sulfat. Pada bagian atas, cahaya matahari
lebih mudah didapat sehingga dapat digunakan untuk fotosintesis, sedangkan bagian tengah
dapat dihuni oleh mikrob kemoorganotrof fakultatif anaerob karena dapat mentolerir kandungan
udara yang sedikit serta banyak dapat mengakses bahan organik sebagai sumber energinya.Pada
bagian dasar, tidak terdapat kandungan udara sehingga mikrob anaerob pereduksi sulfat dapat
tumbuh dan energi dengan cara mereduksi sulfat (http://www.permi.or.id/index).
Pertumbuhan biofilm ini bergantung pada substansi matrix bahan yang digunakan. Matrix
bahan yang digunakan ini akan menyediakan aseptor elektron bagi mikroba untuk proses
oksidasi dalam rangka menghasilkan energi. Selain itu, pembentukan biofilm ini bergantung
pada keragaman/variasi jenis mikroba yang tumbuh. Biofilm dapat dibentuk dari satu jenis
mikroba saja, namun secara alami hampir semua jenis biofilm terdiri dari campuran berbagai
jenis mikroba. Sebagai contoh fungi, alga, yeast (ragi), amuba (bakteri) dan jenis mikroba
lainnya. Semakin beragam mikroba yang tumbuh, maka biofilm yang terbentuk akan semakin
cepat dan kompetitif.
Biofilm akan terbentuk pada permukaan yang lembab, hal ini disebabkan mikroba dapat
bertahan hidup jika ia mendapatkan kelembaban yang cukup. Pada prosesnya biofilm
mengeksresikan suatu bahan yang licin (berlendir) pada sebuah permukaan, kemudian akan
menempel dengan baik di permukaan tersebut jika keadaan minimum bakteri tersebut terpenuhi.
Beberapa lokasi yang dapat dijadikan tempat hidup biofilm meliputi material alami di atas dan di
bawah tanah, besi, plastik dan jaringan sel (Allison, 2000).
Biofilms menjaga kesatuan formasinya dengan saling berikatan satu sama lain pada
untaian molekul gula. Hal tersebut yang kemudian disebut sebagai EPS atau extracellular unsur
polymeric, yaitu terbentuknya polimer antar biofilm, sehingga kemungkinan untuk melepas
menjadi sulit. Karena dengan mengekskresikan EPS ini, masing-masing biofilm sangat mungkin
saling mensuport untuk berkembang dalam dimensi yang kompleks dan sangat erat (utuh).
Matriks yang terbentuk dengan EPS ini akan melindungi sel dan memudahkan komunikasi antar
sel melalui isyarat biokimia. Beberapa biofilms berada dalam fasa cair, dimana keadaan tersebut
membantu sel dalam mendistribusikan zat yang dibutuhkan dan memberi sinyal molekul pada sel
(Lappin and Hillary, 2003).

2.2 Streptococcus mutans


2.2.1 Defenisi dan Morfologi
Streptococcus mutans termasuk kelompok Streptococcus viridans yang merupakan
anggota floral normal rongga mulut.S. mutans memiliki sifat -hemolitik dan komensal
oportunistik.Bakteri inipaling berperan dalam proses terjadinya karies gigi. Streptococcus
mutans merupakan bakteri gram-positif (+) yang tercat biru gelap atau ungu dengan pewarnaan
gram. Hal ini dikarenakan sifat fisik dinding selnya yang tebal dan dapat mempertahankan warna
kristal violet. Dinding selnya terdiri dari peptidoglikan (murein) dan asam teikoat yang
mencegah protoplasma mengalami lisis osmotik dan memberi bentuk pada sel(Ryan, 2004).
Streptococcus mutans berbentuk kokus (bulat) dengan formasi rantai panjang apabila
ditanam pada medium yang diperkaya seperti pada Brain Heart InfusionBroth (BHIB),
sedangkan bila ditanam di media agar akan memperlihatkan rantai pendek dengan bentuk sel
tidak beraturan. Streptococcus mutans ini merupakan bakteri anaerob fakultatif yang bersifat non
motil (tidak bergerak), berdiameter 1-2 m, tidak membentuk spora.Bakteri ini tumbuh secara
optimal pada suhu sekitar 180C - 400C.Streptococcus mutansbersifat asidogenik (menghasilkan
asam) dan asidurik (mampu tinggal pada lingkungan asam), dan menghasilkan suatu polisakarida
lengket yang disebut dengan dextran(Ryan, 2004).
Gambar 1. Streptococcus mutans (Pandit et al, 2011)

2.2.2 Faktor Virulensi


Salah satu faktor virulensi Streptococcus mutans adalah kemampuannya untuk menempel
pada permukaan gigi dan membentuk biofilm. Streptococcus mutans menempel ke permukaan
8

gigi, menghasilkan lendir, membelah dan menghasilkan koloni dalam lapisan lendir serta
membentuk biofilm(Pandit et al, 2011). Streptococcus mutans menempel secara spesifik pada
pelikel gigi, tumbuh dan mensintesis kapsul dekstran yang menempelkan bekteri ini ke enamel.
Streptococcus mutans juga mampu memecah sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa. Glukosa
dipolimerisasi menjadi polimer dekstran ekstraseluler yang membentuk matriks plak. Glukosa
juga digunakan sebagai sumber karbonsehingga terjadi produksi asam laktat dalam biofilm
(plak) dan menyebabkan karies gigi. Selain itu, Streptococcus mutans juga memiliki toleransi
asam yang relatif tinggi (aciduricity) sehingga dapat bertahan di tempat dengan pH yang asam.
Streptococcus mutans juga bersifat acidogenic yang dapat memproduksi asam laktat dari gula
diet secara cepat (Lin Zhu et al, 2006).
2.2.3Patogenesa dalam Karies
Streptococcus mutans merupakan spesies patogen dan agen primer penyebab karies gigi,
terutama dalam tahap inisiasi dan perkembangan karies.Ketika Streptococcus mutans tumbuh
dalam biofilm, sel-sel menjaga keseimbangan metabolisme yang melibatkan produksi dan
detoksifikasi. Biofilm adalah agregat dari mikroorganisme di mana sel-sel menempel satu sama
lain(Ryan, 2004). Biofilm oral terus-menerus beradaptasi terhadap perubahan lingkungan.Dalam
menanggapi perubahan tersebut, koloni bakteri berkembang dan bertahan hidup di rongga mulut
dengan fungsi spesifiknya(Pandit et al, 2011).
Streptococcus mutans mempunyai strategi untuk berhasil berkoloni dan dominan dalam
rongga mulut.Pertumbuhan dan metabolisme Streptococcus mutans merubah kondisi lingkungan,
seperti pH, koagregasi, dan ketersediaan substrat, sehingga memungkinkan organisme sekunder
lain juga berkolonisasi dan membentuk plak gigi. Plak gigi merupakan prekursor kerusakan gigi
yang berisi lebih dari 600 mikroorganisme yang berbeda(Ryan, 2004).
Streptococcus mutans memainkan peran utama dalam kerusakan gigi dengan
memetabolisme sukrosa menjadi asam laktat menggunakan enzim glukansukrase. Proses
metabolisme sukrosa ini mengakibatkan perubahan lingkungan rongga mulut menjadi asam
sehingga menyebabkan enamel gigi terdemineralisasi dan rentan terhadap kerusakan.
Streptococcus mutans menggunakan sukrosa untuk menghasilkan polisakarida berbasis dekstran
yang lengket dan memungkinkan Streptococcus mutans beragregasi dan membentuk
plak.Streptococcus

mutans

menghasilkan

dekstran

melalui

enzim

dekstransukrase
9

(heksosyltransferase) menggunakan sukrosa sebagai substrat dengan reaksi sebagai berikut:


(Vinogradov et al, 2004)
n sukrosa (glukosa) n + n fruktosa
2.2.4 Biofilm dan S.Mutans
Karena sel biofilm berusia 3-hari S. mutans menunjukkan pola ekspresi pro-proteinnya
berbeda dibandingkan dengan sel planktonik, protein mantan pression dalam sel biofilm baru
terbentuk diselidiki untuk melihat apakah perubahan yang terjadi langsung setelah kontak
dengan permukaan.Dalam studi ini, gel kecil (7 cm strip kering immobiline) digunakan karena
beban protein terlalu kecil untuk penggunaan besar (14 cm) gel. Resolusi gel kecil lebih rendah
daripada gel besar dan karena protein yang lebih rendah beban hanya protein dengan kelimpahan
tinggi akan terungkap. Dari 124 protein dianalisis, 25 menunjukkan peningkatan RRS sementara
8 menunjukkan RRS berkurang.Satu protein hanya disajikan dalam sel biofilm sementara 5
protein diekspresikan dalam sel planktonik saja.Dua puluh tiga protein diidentifikasi dengan
ekstrapolasi iDEN-tifications dari gel besar dari percobaan sebelumnya.
Perubahan yang paling menonjol dalam sel-sel biofilm baru ditaati adalah ekspresi
disempurnakan enzim glikolitik. Tujuh enzim: enolase, kinase phosphoglycerate, gliseraldehida3-fosfat de-hydrogenase, 6-fosfofruktokinase, fruktosa bisphosphate aldo-lase, kinase piruvat
kinase dan phophoglycerate, semua milik jalur glikolisis, yang ditingkatkan. (Neilands, 2007)
2.3 Actynobaccilus actynomicetemcomitans
Actinobacillus actinomycetemcomitans merupakan gram negatif, coccobacillus, non motil
yang berkolonisasi pada rongga mulut. A. actinomycetemcomitans adalah salah satu bakteri
penyebab beberapa penyakit periodontal yang parah, termasuk localized juvenile periodontitis,
early-onset periodontitis, dan rapidly progressive periodontitis. A. actinomycetemcomitans dapat
masuk kedalam submukosa dan menyebabkan infeksi non-oral, termasuk bacteremia, infeksi
endokarditis dan abses lokal (Kaplan JB, et al., 2003).
2.3.1 Morfologi koloni Actinobacillus actinomycetemcomitans

10

Morfologi koloni biofilmA.Actinomycetemcomitansseperti tower- and mushroom-shaped


yangumumnya dapat diamati padabakterilain, sepertiPseudomonasaeruginosa,P.fluorescens,
Vibrioparahaemolyticus,P.putida, V.cholerae, dan Salmonellaspp. (28). Selain itu,koloni biofilm
A.actinomycetemcomitansmenunjukkanperbedaan, siklus hidupfenotipik yangditandai oleh
perlekatan

selplanktonke

permukaan,

pertumbuhanasimetris,

lekukanmikrokoloni

yang

menunjukkanciri morfologikompleks, danadanya pelepasanseldaribiofilmkoloni (Kaplan JB, et


al., 2003).
Kaplan

dan

Fine

menunjukkan

A.Actinomycetemcomitansmampumenghasilkan
selkedalammedia

cairdansel-sel

padapermukaankulturdan

yang

sel

bahwa

koloni

tunggalatau

dihasilkan

biofilm

sekelompokkecil

tersebutdapatmenempel

membentukkolonibiofilmbaru,

yang

memungkinkanbiofilmuntukmenyebar (Kaplan JB dan Fine DH, 2002).


2.3.2 Tahap Pembentukan Biofilm Bakteri
Pembentukan biofilm dibagi menjadi tiga tahap, yaitu: perlekatan sel ke permukaan,
pertumbuhan sel menjadi koloni biofilm dan detachment sel dari koloni ke lingkungan
sekitarnya(Rosan dan Lamont, 2000).
1) Tahap pertama
Pada tahap awal, interaksi reversibel antara sel bakteri dan permukaan dimediasi oleh
non-specific Lifshitz-van der Waals, asam-basa Lewis dan gaya elektrostatik. Perlekatan
sementara ini diperkuat oleh host dan adhesin jaringan spesifik yang terletak pada
permukaan sel bakteri atau pelengkap seluler seperti pili dan fimbriae (Rosan dan Lamont,
2000). Proses tersebut menghasilkan perlekatan ireversibel dari sel bakteri ke permukaan.
Dalam plak gigi, yang dapat terdiri dari ratusan spesies bakteri, kolonisasi pada permukaan
gigi mengikuti ordered progression, yaitu dengan adhesi awalspesies pioneer ke permukaan
enamel diikuti oleh perlekatan spesies koloni lanjutan dari koloni yang sudah melekat
sebelumnya (Marsh, 2004).
2) Tahap kedua
Pembentukan biofilm melibatkan multiplikasi bakteri pada permukaan dan seiring
dengan sintesis matriks polimer ekstraseluler. Matriks memegang sel-sel bakteri secara
bersamaan dalam massa dan perlekatan kuat massa bakteri ke permukaan dasarnya.
Beberapa contoh komponen polimer matriks biofilm yang diproduksi oleh bakteri rongga
11

mulut termasuk polisakarida glukan Streptococcus mutans (Banas dan Vickerman,2003),


protein fimbriae yang diproduksi oleh Aggregatibacter actinomycetemcomitans dan
Porphyromonas gingivalis (Lamont et al., 2002), dan extracellular polymeric substance
(EPS), untaian ganda DNA dalam biofilm yang dihasilkan oleh A. actinomycetemcomitans ,
S. mutans dan S. intermedius (Inoue,et al., 2003).
Biomassa biofilm 90% terdiri dari EPS yang menyediakan struktur'scaffold' untuk
koloni biofilm. Selain itu, EPS juga berfungsi melindungi microenvironment dari sekresi
enzim dan larutnya nutrisi, serta molekul biologi lain dan zat antibiotik yang berasal dari
luar biofilm. Matriks EPS juga dapat meningkatkan resistensi terhadap antibiotik dan
pertahanan host yang ditunjukkan oleh sel-sel biofilm baik sebagai diffusion barrier, atau
sebagai pengikat agen antimikroba secara langsung dan mencegah akses ke sel biofilm (Mah
dan O'Toole, 2001).
Kemudian pertumbuhan sel-sel bakteri pada permukaan mengarah ke kematangan
perkembangan koloni biofilm yang mengandung jutaan sel yang padat berkumpul menjadi
massa berbentuk pillar- and mushroom-shaped (Hall-Stoodley,et al., 2004). Struktur
tersebut diselingi dengan saluran berisi cairan yang bertindak sebagai sistem sirkulasi
primitif, yang memungkinkan pertukaran nutrisi dan produk hasil metabolisme sel bakteri
dengan fase bulk fluid. Selain itu, didalam biofilm terdapat ruang internal yang tidak
mengandung sel. Dengan demikian, struktur koloni biofilm dewasa yang komplekssangat
berbeda. Perbedaan microenvironmentseperti pH, konsentrasi oksigen, nutrisi dan densitas
sel dalam koloni biofilm akan menghasilkan heterogenitas aktivitas metabolisme dan
reproduksi sel-sel yang terletak pada bagian koloni yang berbeda. Sel yangtidak aktif secara
metabolik terletak pada bagian dalam koloni mungkin resisten terhadap tindakan agen
antimikroba yang menargetkan sel-sel yang tumbuh secara aktif(Fux CA,et al., 2004).
3) Tahapketiga
Tahap terakhir pembentukanbiofilmadalahdetachment seldari kolonibiofilm
danpenyebarannya

ke

lingkungan.Hal

inimerupakan

tahappenting

darisiklus

hidupbiofilmyang berkontribusi untukpenyebaranbiologi, kelangsungan hidup bakteri,


danpenularan penyakit.Sepertitahap pembentukan biofilm lain, penyebaranbisa menjadi
proses kompleks yang melibatkanbanyaksinyallingkungan, jalur transduksi sinyal, dan
efektor.Tidak

adamekanisme

tunggalpenyebaranbiofilm

yang

digunakanoleh

semuabakteri(Karatan danWatnick, 2009).

12

2.4 Porphyromonas gingivalis


Porphyromonas Gingivalis merupakan bakteri anaerob gram negative, berbentuk batang,
tidak berspora, tak punya alat gerak (non-motile). Kebanyakan sel di dalam media, berukuran
kecil dari 0,5-0,8 hingga 1,0-1,5 m, tetapi terkadang ada yang lebih panjang 4-6 m, hal ini
mungkin disebabkan oleh perubahan bentuk. Permukaan koloni pada media darah, berwarna
hitam, lembut, berkilauan, cembung, berbentuk sirkuler.Koloni dapat berubah-ubah.Koloni
kadang tidak berpigmen Warnanya mulai menggelap dari tepi kearah pusat setelah 4-8 hari.
(University of Alberta, 2003)
P.gingivalis dapat diidentifikasi melalui karakteristiknya yang berpigmen hitam, kadangkadang berkapsul, anaerob, golongan cocobacillus gram negative. (Brunner et al, 2010). Pigmen
hitam tersebut berasal dari akumulasi haem yang tumbuh pada media yang mengandung darah.
Komponen haem tersebut merupakan derivat proteolitik, produk degradasi hemoglobin, dan
protein yang membawa haem seperti haemapexin dan haemalbumin. (Smalley et al, 2011)
Pertumbuhan P. gingivalis dipengaruhi oleh adanya protein hydrolysates, seperti : trypticase,
proteose peptone dan ekstrak yeast. Pertumbuhannya dapat ditingkatkan dengan adanya 0,5
0,8% NaCl dalam darah. Produk fermentasi yaang utama adalah n-butirat dan asam asetat. Untuk
tingkat yang lebih rendah juga diproduksi asam propionat, iso-butirat, fenilasetat, dan isovaleric.
Cysteine proteinases dan collagenases juga diproduksi. Dinding sel peptidoglycan
mengandung lisin sebagai asam diamino. Kedua-duanya 3-hydroxylated fatty acid dan nonhydroxylated terdapat di dalamnya. Untuk nonhydroxylated terdiri atas sebagian besar isomethyl yang bercabang, dengan iso-C15:0.9 (citizendium, 2013)
Bakteri ini banyak ditemukan dalam rongga mulut, di mana P. gingivalis terlibat dalam
bentuk-bentuk tertentu dari penyakit periodontal, serta peyakit saluran pencernaan bagian atas,
saluran pernapasan, dan usus besar. Bakteri ini mengeluarkan enzim kolagenase sehingga
menyebabkan degradasi kolagen pada penyakit periodontal kronik. Hal ini telah ditunjukkan
dalam uji in vitro bahwa P. gingivalis dapat menyerang fibroblast gingiva dan dapat bertahan
hidup di dalamnya bahkan dengan adanya antibiotic. P. gingivalis juga menyerang sel-sel epitel
gingiva dalam jumlah tinggi, di mana kasus. kedua bakteri dan sel-sel epitel bertahan selama
13

waktu yang lama. Tingginya kadar antibodi spesifik dapat dideteksi pada pasien
menyembunyikan P. gingivalis.(M. Naito, et al,2008)
2.4.1 Kemampuan Membuat Biofilm
Pembentukan biofilm plak gigi tidak tergantung pada satu atau bahkan sejumlah spesies.
Namun ada interaksi yang kompleks antara spesies berbeda karena proses adherencepada
permukaan keras, dengan bakteri pioneer (terutama bakteri coccoidal), koloni kedua, dan
akhirnya koloni akhir. Bakteri P. gingivalismemiliki FimA atau fimbriae mayor yang berperan
dalam perlekatan juga mediator invasi dan kolonisasi pada sel host. Bakteri ini juga memiliki
Fimbriae minor (Mfa1) yang memiliki peran dalam perkembangan biofilm dan perlekatan
dengan bakteri lain. Selain itu, bakteri P. gingivalismemiliki gen penyandi RgpA, KGP dan
hemaglutinin A (Haga) yang diekspresikan setelah inkubasi dengan T. denticola.Protein
hemagglutinin berperan meningkatkan kapasitas melekat P.gingivalis dengan spesies bakteri
lainnya. Gen tersebut juga berperan dalam perkembangan dan maturasi biofilm.(Meuric V, et al,
2013
Komponen utama yang mengatur kolonisasi dan virulensi P.gingivalis adalah ekspresi dari
kedua fimbriae, baik fimbria panjang dan pendek. Fimbriae panjang terdiri dari subunit protein
FimA, sedangan fimbriae pendek terdiri dari subunit protein Mfa1. Fungsi dari fimbriae panjang
adalah untuk perlekatan dan invasi ke sel epitel gingival, resorpsi tulang, ko-agregasi dengan
isolate rongga mulut lainnya, serta pembentukan biofilm. Fimbriae pendek dibutuhkan dalam
proses autoagregasi. (Christopher et al, 2010; Hajishengallis et al, 2011; Tribble et al, 2013)
Kolonisasi dental plak biofilm oleh P.gingivalis juga dimediasi oleh perlekatan terhadap molekul
saliva dan juga terhadap koloni-koloni bakteri yang sudah terlebih dulu ada seperti streptococci.
P.gingivalis dapat melekatkan diri ke Streptococcus gordonii melalui fimbria (FimA)-dependent
manner dan membentuk mikrokoloni dari biofilm untuk mendukung lingkungan mikro yang
mendukung berkembangnya biofilm. (Xie et al, 2004)

14

BAB III
HASIL PRAKTIKUM
1. Kultur ketiga bakteri setelah di-centrifugeuntuk mendapatkan pellet dan supernatan

2. Pellet yang tersisa setelah supernatant diambil, lalu ditambahkan larutan PBS sebanyak 2 ml,
dilanjutkan dengan centrifuge

3. Proses pencucian seperti pada poin 2 dilakukan sebanyak tiga kali


15

4. Supernatan yang dihasilkan dari centrifuge pada proses pencucian yang terakhir dipindahkan
ketabung eppendorf untuk menyimpan kultur bakteri

5. Pellet yang tersisa lalu dilakukan pengecatan dengan menambahkan

larutan safranin

sebanyak 2 ml

Dari gambar hasil akhir di atas, didapatkan hasil lapisan biofilm dari kuman A.
actinomycetemcomitans (tabung paling kiri) yang paling nyata dan jelas terlihat, yang akan
dijelaskan pada bagian pembahasan.

16

BAB IV
PEMBAHASAN DAN KESIMPULAN

4.1 Pembahasan
Biofilmadalahkumpulanselmikroorganisme,

khususnyabakteri,

yang

melekat

di

suatupermukaandandiselimutiolehpelekatkarbohidratyang
dikeluarkanolehbakteri.Biofilmterbentukkarenamikroorganismecenderungmenciptakanlingkunga
nmikrodanrelung

(niche)

merekasendiri.Biofilm

memerangkapnutrisiuntukpertumbuhanpopulasimikroorganismedanmembantumencegahlepasnya
sel-seldaripermukaanpadasistem yang mengalir.
Praktikum ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan beberapa macam bakteri dalam
pembentukan biofilm secara in vitro, yaitu bakteri A.actinomycetemcomitans,P.gingivalis dan
S.mutans. dari hasil praktikum dapat dilihat jika lapisan biofilm dari bakteri A.
actinomycetemcomitans (tabung paling kiri) yang paling nyata dan jelas terlihat, sedangkan
bakteri S.mutans terlihat namun paling tidak jelas dibandingkan ketika bakteri tersebut.
A. actinomycetemcomitansadalah bakteri gram negatif dalam rongga mulut yang
merupakan salah satu penyebab penyakit periodontal.Ketika dikultur dalam Trypticase Soy Broth
(TSB), A. actinomycetemcomitansmembentuk lapisan biofilm pada permukaan kaca.plastik,
atausaliva-coated hydroxyapatite, hal

ini diperkirakan memiliki peran penting dalam

kemampuan bakteri menyebabkan penyakit di rongga mulut. Jika lapisan ini dilihat di mikroskop
maka akan terlihat morfologi koloni biofilm A. actinomycetemcomitans yang tumbuh pada kaca.
Dapat dilihat bahwa A. actinomycetemcomitans berkembang asimetris, koloni biofilm memiliki
bentuk yang kompleks, termasuk lapisan sel padat di luar koloni dan sel nonaggregated yng
besar, rongga transparan di bagian dalam koloni. Koloni biofilm yang mature merilis sel tunggal
atau kelompok kecil sel ke dalam media. Sel-sel ini dirilis melekat ke permukaan dan
membentuk koloni baru, yang memungkinkan biofilm untuk menyebar(Kaplan et al, 2003).
Berdasarkan hasil praktikum dapat dilihat jika bakteri A.actinomycetemcomitans mampu
membentuk biofilm paling cepat diantara ketiga bakteri tersebut.
Padapraktikuminidilakukanpenumbuhan biofilm pada 3 bakteridiantaranya biofilmA.
actinomycetemcomitanssebagaibakteripenyebabutama

periodontitis

agresif,

biofilm

P.
17

gingivalissebagaibakteripenyebabutama

periodontitis

kronis,

dan

biofilm

mutanssebagaibakteripenyebabutamakariesgigi.Setelahdilakukanpencuciansebanyak

S.

kali

denganmenggunakan PBS (pH:7,2), didapatkanendapan/pellet sehinggaterdapatkeruhan yang


diinginkansetaradenganstandar 0,5 McFarland yang dapatdigunakankembaliuntukpemeriksaan
biofilm berikutnyadaribakteritersebut.
Kemudiansetelahtabungkosongmakapadatabungreaksidilakukanpengecatandenganmengg
unakankristal

violet

atautryphan

blue

atausafranin.

Setelahitudariketigabakteritersebutdidapatkanhasilberdasarkandarihasilpengamatanpadadindingta
bungreaksi.Untuk A.Actinomycetemcomitansdiberiskor 3 karenaterlihatpembentukan biofilm
yang

kuatpadadindingtabung

karenaterlihatpembentukan

reaksi,

biofilm

kemudianP.

yang

gingivalisdiberi

sedangdanStreptococcus

skor

mutansdiberiskor

karenaterlihatpembentukan biofilm yanglemah.


4.2 Kesimpulan
Praktikum yang dilakukan untuk mengetahui kemampuan beberapa
dalam

pembentukan

biofilm

secara

in

actinomycetemcomitanssebagaibakteripenyebabutama
gingivalissebagaibakteripenyebabutama

macam bakteri

vitro,

yaitu

periodontitis

agresif,

periodontitis

kronis,

dan

biofilmA.
biofilm
biofilm

P.
S.

mutanssebagaibakteripenyebabutamakariesgigi menghasilkan kesimpulan bahwa kemampuan


setiap

bakteri

untuk

memproduksi

A.Actinomycetemcomitansdiberiskor

biofilm

berbeda

karenaterlihatpembentukan

beda.

Untuk

biofilm

yang

kuatpadadindingtabung reaksi, kemudianP. gingivalisdiberi skor 2 karenaterlihatpembentukan


biofilm yang sedangdanStreptococcus mutansdiberiskor 1 karenaterlihatpembentukan biofilm
yanglemah.

18

DAFTAR PUSTAKA

Allison, D. (2000). Community Structure and Co-Operation in Biofilms. Cambridge: Cambridge University Press.
Banas JA, Vickerman MM. 2003. Glucan-binding proteins of the oral streptococci. Crit Rev Oral Biol Med 14:8999.
Brunner J, Scheres N, Idrissi N B E, Deng D M, Laine M J, Van Winkelholf A J, Crielaard W. 2010. The Capsule of
Porphyromonas gingivalis Reduces The Immune Response of Human Gingival Fibroblast. BMC Microbiology
2010, Vol. 10, Issue 5. pp. 1-11.
Characlis, W.G. 1984. Biofilm Processes. In W.G. Characlis dan K.G Marshall (eds). Biofilm, p. 195-232. Jhon
Wiley. New York
Christopher A B, Arndt A, Cugini C, Davey M E. 2010. A Streptococcal Effector Protein that Inhibits
Porphyromonas gingivalis Biofilm Development. Microbiology 2010, Vol. 156. pp. 34693477.
Citizendium,

Porphyromonas

gingivalis

available

from

http://en.citizendium.org/wiki/Porphyromonas_gingivalis accessed on November 10, 2013


Fux CA, Wilson S, Stoodley P. 2004. Detachment characteristics and oxacillin resistance of Staphylococcus aureus
biofilm emboli in an in vitro catheter infection model. J Bacteriol 186:4486-4491.
Grenier D, Tanabe S. 2010. Porphyromonas gingivalis Gingipains Trigger a Proinflammatory Response in Human
Monocyte-derived Macrophages Through the p38 Mitogen-activated Protein Kinase Signal Transduction
Pathway. Toxins 2010, Vol. 2. pp. 341-352.
Hajishengallis G, Liang S, Payne M S, Hashim A, Jotwani R, Eskan M A, McIntosh M L, Alsam A, Kirkwood K L,
Lambris J D, Darveau R P, Curtis M A. 2011. Low Abundance Biofilm Species Orchestrates Inflammatory
Periodontal Disease through the Commensal Microbiota and Complement. Cell Host & Microbe (2011),
doi:10.1016/j.chom.2011.10.006. pp. 1-10.
Hall-Stoodley L, Costerton JW, Stoodley P. 2004. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious
diseases. Nature Rev Microbiol 2:95-108.
Inoue T, Shingaki R, Sogawa N, Sogawa CA, Asaumi J, Kokeguchi S, et al. 2003. Biofilm formation by a fimbriaedeficient mutant of Actinobacillus actinomycetemcomitans. Microbiol Immunol 47:877-881.
Jessica Neilands. 2007. Acid Tolerance of Streptococcus mutans. Malmo University Faculty of Odontology
Department of Oral Biology. pp 20-22, 46-48.

19

Kaplan JB and Fine DH. 2002. Biofilm dispersal of Neisseria subflava and other phylogenetically diverse oral
bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 68:4943-4950.
Kaplan JB, Meyenhofer MF and Fine DH. 2003. Biofilm Growth and Detachment of Actinobacillus
actinomycetemcomitans. Journal of Bacteriology. Vol. 185. No. 4. pp. 1399-1404.
Karatan E, Watnick P. 2009. Signals, regulatory networks, and materials that build and break bacterial biofilms.
Microbiol Molec Biol Rev 73:310-347.
Lamont RJ, El-Sabaeny A, Park Y, Cook GS, Costerton JW, Demuth DR. 2002. Role of the Streptococcus gordonii
SspB protein in the development of Porphyromonas gingivalis biofilms on streptococcal substrates.
Microbiology 148:1627-1636.
Lappin-Scott, Hilary (2003). Microbial Biofilms. Cambridge: Cambridge University Press.
Lin Zhu, Jens Kreth, Sarah E. Cross, James K. Gimzewski, Wenyuan Shi, and Fengxia Qi. 2006. "Functional
Characterization of Cell-wall-associated Protein WapA in Streptococcus mutans". A Journal of the Society for
General Microbiology
Madigan MT, Martinko JM, Brock TD. 2006. Brock Biology of Microorganisms. 11th Ed. New Jersey: Pearson
Prentice Hall. Hal: 617-619.
Mah TF, OToole GA. (2001). Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol 9:34-39.
Maric S, Vranes J. 2007. Characteristics and significance of microbial biofilm formation. Periodicum biologorum.
Vol 109:2. p. 2
Marsh PD. 2004. Dental plaque as a microbial biofilm. Caries Res 38:204-211.
Meuric V, Martin B, Guyodo H, Rouillon A, Tamanai-Shacoori Z, Barloy-Hubler F, Bonnaure-Mallet M. Treponema
denticola improves adhesive capacities of Porphyromonas gingivalis. Mol Oral Microbiol 2013;28(1):40-53
Naito M, Hirakawa H, Yamashita A, et al (August 2008)."Determination of the Genome Sequence of
Porphyromonas gingivalis Strain ATCC 33277 and Genomic Comparison with Strain W83 Revealed Extensive
Genome Rearrangements in P. gingivalis". DNA Res. 15 (4): 21525.doi:10.1093/dnares/dsn013. PMC
2575886.PMID 18524787
Pandit, Santosh; Kim, Hye-Jin; Kim, Jeong-Eun; Jeon, Jae-Gyu. 2011. "Separation of an Effective Fraction from
Turmeric against Streptococcus mutansBiofilms by the Comparison of Curcuminoid Content and Antiacidogenic Activity". Food Chemistry 126 (4): 156570.
Rosan B, Lamont RJ. (2000). Dental plaque formation. Microbes Infect 2:1599-1607.

20

Ryan KJ, Ray CG. 2004 . Sherris Medical Microbiology (4th ed.). McGraw Hill.
Smalley J W, Byrne D P, Birss A J, Wojtowicz A, Sroka A, Potempa J, Olczak T. 2011. HmuY Haemophore and
Gingipain Proteases Constitute a Unique Syntrophic System of Haem Acquisition by Porphyromonas gingivalis.
PLoS ONE February 2011, Vol. 6, Issue 2, e171782. pp. 1-10.
Tribble G D, Kerr E, Wang B Y. 2013. Genetic Diversity in The Oral Pathogen Porphyromonas gingivalis:
Molecular Mechanisms and Biological Consequences. Future Microbiol. 2013, Vol. 8, Issue 5. pp. 607620.
University

of

Alberta

Porphyromonas

gingivalis

available

from

http://wishart.biology.ualberta.ca/BacMap/cgi/getSpeciesCard.cgi?accession=NC_002950&ref=index_15.html
accessed on 10th of November 2013
Vinogradov AM, Winston M, Rupp CJ, Stoodley P. 2004. "Rheology of Biofilms Formed from the Dental Plaque
Pathogen Streptococcus mutans". Biofilms 1: 4956.
Xie H, Kozlova N, Lamont R J. 2004. Porphyromonas gingivalis Genes Involved in fimA Regulation. Infect
Immun. February 2004, Vol. 72, Issue 2. pp. 651658.
Yilmaz O. 2008. The Chronicles of Porphyromonas gingivalis: The Microbium, The Human Oral Epithelium and
Their Interplay. Microbiology 2008, Vol. 154. pp. 28972903.

21