Instituto Tecnolgico Superior de Abasolo

Fecha :
17/marzo/2015
Formato de prcticas de laboratorio
Nombre de la
practica
Tincin de Gram

Materia
Biotecnologa Ambiental
I

Carrera
Ing. Ambiental

Nmero de
Alumnos
6

1.- Introduccin:
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el
microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que
la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste entre la clula y el medio que la rodea
es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse tambin para localizar estructuras
especficas en la clula o para distinguir entre tipos diferentes de clulas.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso
llamado fijacin. Para las bacterias la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin
puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehdo, cidos y alcoholes. Despus de la
fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido secadas sobre un portaobjetos,
tratando despus ste con el agente fijador y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin.
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica
por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas
cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes
celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos.
La tincin de Gram, denominada as por el bacterilogo dans Hans Christian Gram, quien la
desarrollo en 1884, es una tincin diferencial, puesto que no tie igualmente todas las clulas.
Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos
grupos, Gram + y Gram -.
Gram +: se tien de color violeta, esto se debe a que la pared esta formada por una gruesa
capa de peptidoglicano (un polmero complejo de amino-azcares, tambin llamado murena).
Gram -: se tien de color rosado, la pared de estas bacterias consiste en una capa delgada de
peptidoglicano y una capa exterior, la membrana externa con lipoprotenas y lipo-polisacridos.
Debido a esta estructura el primer colorante es extrado luego del lavado con etanol, fijndose
posteriormente el segundo colorante.

NOTAS:
La solucin de Violeta cristal y Fucsina (o Safranina) son irritantes en contacto con la piel,
ojos y mucosas.
La solucin de alcohol-acetona y la solucin de Fucsina (safranina) son inflamables por lo
tanto se deben de tomar los cuidados requeridos para el manejo de productos inflamables.
El mal uso de la solucin Alcohol-acetona puede llegar a decolorar los grmenes Gram +.
Cultivos y muestras viejas pueden dar resultados atpicos. Por ello se recomienda usar
muestras de 18 a 24 hrs como mximo o recientes.
Es importante controlar la fijacin por calor (dos o tres pasadas de un segundo por llama
suave), un exceso del mismo puede dar coloraciones errneas.
Agua altamente clorada puede debilitar la coloracin de contraste.
2.- Objetivo:
Relacionar la practica con el tema de Aislamiento y caracterizacin de moos de importancia
ambiental visto en clase
Aprender una de las tcnicas de tincin ms utilizadas en el laboratorio: la tincin de Gram
Adquirir destreza en la realizacin de observaciones microscpicas de moos.
Apreciar de forma visibles las diferentes formas microbianas
Distinguir bacterias Gram + y Gram
3.- Material:
Violeta Cristal (Violeta de
genciana)
Lugol
Alcohol Acetona (8020),se debe de preparar ya
que
no
hay
en
el
laboratorio, un solo equipo
puede hacerlo para todos
Fucsina bsica Safranina
Agua destilada
Acetona
Alcohol del 96

Microscopio
5Porta y cubreobjetos (por equipo)
4 Pizetas
4 Mechero Bunsen con manguera
Cronometro o timer
4 Goteros (por equipo)
2 Asas bacteriolgicas(o palillos de dientes)
1 Frasco de vidrio c/taparosca para 100 mL(solo el equipo que va
a preparar la solucin)
1 Frasco de vidrio c/taparosca para 25mL(por equipo)
1 Probeta de 100 mL
Etiquetas para marcar

Servilletas
Muestras a utilizar: yogurt,soful, yakult, saliva, alimento en
descomposicin
Encendedor o cerillos
4.- Desarrollo de la prctica:
1.- Realizar un frotis: colocar una gota de agua destilada sobre un portaobjetos limpio y
desengrasado, enseguida con el asa bacteriolgica previamente esterilizada tomar un alcuota
de la muestra y dispersarla sobre la gota de agua, dejar secar al aire por 1 minuto.
2.- Posteriormente fijar por calor, para esto se pasa 3 veces, lentamente el lado inferior del
portaobjetos (la parte del frotis queda arriba) por la parte superior de la flama del mechero.
2.- Dejar enfriar por 1 minuto
3.- Cubrir la preparacin fijada en el portaobjetos con una o dos gotas de Cristal violeta (Violeta
de Genciana) y dejar secar al aire por 1 minuto.
4.- Lavar con agua destilada (usa la pizeta), agrega el agua de forma paulatina (de gota en
gota), esto solo es para eliminar el exceso de Cristal violeta que no se fijo
5.- Dejar secar al aire, por 1 minuto
6.- Eliminar el exceso de agua, usando el extremo de una servilleta, solamente toca las gotas
de agua (procura no tocar con la servilleta el frotis)
7.- Cubrir con una o dos gotas de lugol, dejar secar al aire por 1 minuto
8.- Lavar con agua destilada (usa la pizeta), agrega el agua de forma paulatina (de gota en
gota), solo es para eliminar el exceso de lugol que no se fijo
9.- Dejar secar al aire, por 1 minuto
10.- Eliminar el exceso de agua, usando el extremo de una servilleta y solamente toca las gotas
de agua (procura no tocar con la servilleta el frotis)
11.- Decolorar la placa con Alcohol-acetona (80-20), durante 15 a 30 segundos hasta que la
placa decolore totalmente (usa otra pizeta para agregar la solucin, de la misma forma ve
agregando de gota en gota)
12.- Lavar con agua destilada (usa la pizeta), agrega el agua de forma paulatina (de gota en
gota), solo es para eliminar el exceso de Alcohol-acetona que no se fijo
13.- Dejar secar al aire, por 1 minuto
14.- Eliminar el exceso de agua, usando el extremo de una servilleta y solamente toca las gotas
de agua (procura no tocar con la servilleta el frotis)
15.- Cubrir la preparacin con Fucsina bsica (o Safranina), dejar secar al aire por 1 minuto.
16.- Lavar con agua destilada (usa la pizeta), agrega el agua de forma paulatina (de gota en
gota), solo es para eliminar el exceso de Fucsina bsica (o Safranina), que no se fijo
17.- Dejar secar al aire, por 1 minuto
18.- Eliminar el exceso de agua, usando el extremo de una servilleta y solamente toca las gotas
de agua (procura no tocar con la servilleta el frotis)
19.- Agregar una gota de aceite de inmersin al preparado
20.- Cubrir con un cubreobjetos
21.- Examinar al microscopio usando el objetivo de inmersin (100X)
22.- Reportar tus observaciones
4.- Preguntas
1.- Qu importancia posee la tincin Gram en el rea de Ingeniera Ambiental?
La tincin Gram es muy importante en el rea de ingeniera ambiental, ya que es muy
importante conocer los microorganismos que estn presentes en el medio, y como conviven en
los ecosistemas y en base a esto saber cmo podemos utilizar a favor del medio ambiente, o

cmo podemos mejorar la eficiencia en los procesos que estos realizan

Como es la investigacin la forma en que actan ciertos antibiticos, como la penicilina sobre la
pared celular bacteriana.
2.- Investigar la forma en que actan ciertos antibiticos, como la penicilina sobre la
pared celular bacteriana.
Algunos antibiticos actan sobre los componentes moleculares de la pared; por ejemplo, la
lisozima (presentes en las lgrimas, moco nasal y en la mayora de los tejidos y secreciones)
que actan rompiendo los enlaces glucosdicos de los pptidoglucanos, lo que provoca la lisis
por osmosis de la bacteria; otros como la penicilina, son antibiticos bacteriostticos porque
inhiben la sntesis de los pptidoglucanos y, por ello, interrumpen el crecimiento bacteriano.
3.- Qu otras tinciones existe y como se realizan?, Cul es la diferencia con la tincin
Gram?
La coloracin simple consiste en la incorporacin de azul de metileno, u otro colorante, a la
muestra aproximadamente durante un minuto; luego se descarta el colorante, se enjuaga y se
seca. La observacin al microscopio permite distinguir y diferenciar las diversas formas
microbianas.
La coloracin de ZiehlNeelsen es tambin una coloracin diferencial. Un grupo de bacterias son
difcilmente coloreables, pero una vez coloreadas retienen tan fuertemente el colorante que la
accin de los decolorantes es prcticamente nula. La tcnica consiste en someter la
preparacin a al tincin con fucsina fenicada con calentamientos y enfriamientos que garanticen
la entrada del colorante al interior de la clula. Luego se decolora con alcohol-acido; finalmente
se aade un colorante de contraste como el azul de metileno. Las bacterias alcohol-cido
resistentes quedan coloreadas de fucsina, mientras que las alcohol-cido sensibles toman la
coloracin azul. Son alcohol-acido resistentes las del genero Mycobacterium.
La tincin Gram es para identificar las bacterias Gram positivas (color violeta) y Gram negativas
(color rosado), esta tincin tiene gran importancia en taxonoma bacteriana ya que indica
diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias. En cuanto a la
coloracin simple es para distinguir y diferenciar las diferentes formas microbianas. Y la
coloracin de ZiehlNeelsen es para identificar a las bacterias alcohol-cido resistentes (color
fucsina) y a las bacteriasalcohol-cido sensibles (color azul). Estas tres tinciones su desarrollo
es diferente aunque su similitud es en el uso de los mismos colorantes.
4.- Para qu reas de la biotecnologa se puede aplicar la tincin Gram?
Biotecnologa roja: Se aplica a la utilizacin de biotecnologa en procesos mdicos.
Biotecnologa blanca: Conocida como biotecnologa industrial, es aquella aplicada a
procesos industriales.
Biotecnologa verde: Es la biotecnologa aplicada a procesos agrcolas.
Biotecnologa gris: Se encarga del estudio del medio ambiente.

5.- Resultados:

Tincin Gram en muestra de saliva.

Muestra de saliva, como se muestra en la imagen (figura 1) no se alcanza a apreciar nada esto
pudo haber sido porque al pasar el portaobjetos con la muestra sobre el mechero no se fijaron
bien las bacterias y por ende no tomaron ninguna coloracin.

Figura 1 Muestra de saliva

Tincin Gram de bacterias presentes en Yakult.

En la muestra del Yakult como se muestra en la imagen 2 se puede observar que hubo poca
aparicin de bacilos Gram negativos y con agrupaciones de streptobacilos y en cantidades
menores de bacilos individuales.

Figura 2 Bacterias presentes en muestra de Yakult

Tincin Gram de bacterias presentes en carne descompuesta.

La muestra de carne descompuesta se puede apreciar en la imagen siguiente y se identificaron
algunas bacterias como cocos, diplococos y estreptococos. Y al observar en elmicroscopio las
bacterias fueron teidas por la safranina que es un colorante de contraste por lo que de esta
forma se define el color rosceo, esto quiere decir que las bacterias de la muestra de carne
descompuesta han sido identificadas como Gram negativas y a continuacin se muestra en la

Figura 3.

Figura 3 Bacterias presentes en muestra de carne descompuesta

Tincin Gram en bacterias presentes en yogurt.

Al observar las bacterias existentes en la muestra de yogurt pudimos distinguir que son
bacterias gram negativas ya que el colorante con que se tiieron fue con la safranina y su
aspecto es rosa. La morfologa que podemos apreciar es en forma de bacilos, y los que
permanecen juntos se aprecian como estreptobacilos, diplobacilos y mayormente en forma de
v.

Figura 4 Bacterias presentes en muestra de yogurt

Tincin Gram en bacterias presentes en sofult.

Como se puede observar en la figura 5 tomada mediante microscopio elctrico, se
analizo una pequea muestra de sofult en la cual se puede observar que las bacterias
presentes en la muestra son Gram negativas, adems de que la forma las cuales
presentan son cadenas de estreptobacilos y en mayor cantidad diplobacilos.

Figura 5 Bacterias presentes en muestra de Soful

6.- Conclusiones:

La tincin Gram nos permite saber identificar a los dos grupos diferentes de las bacterias por
medio de su pared ya sea Gram positivas o Gram negativas, esto depende del color que se
tian, puede ser color azul o violeta para las Gram positivas o rosa/rojo para el caso de las
Gram negativas. Adems nos permite ver por medio del microscopio su tamao, morfologa
celular y su clasificacin taxonmica. Lo que no nos permite conocer es el gnero o la especie a
la que pertenece la bacteria.
La tcnica de tincin tiene como finalidad crear un contraste entre la clula y el medio que la
rodea, y es una de sus caractersticas ms importantes. Es por eso que esta tcnica se vuelve
fundamental en el estudio de la microbiologa. Acerca de la tincin de Gram nos permite tener
una introduccin para poder diferenciar frente al microscopio los diferentes tipos de
microorganismos.
Algunas dificultades que se pueden presentar durante el desarrollo de la tincin de Gram son:
realizar una errnea fijacin de la muestra en el mechero durante un tiempo escaso tiempo o
prolongado, al momento de realizar la decoloracin con alcohol-cetona no debe realizarse
durante un tiempo extenso ya que conllevan a una decoloracin de bacterias, as como al
momento de realizar la tincin puede ocasionar excesos de coloracin.
Las paredes celulares de bacterias de tipo Gram negativo poseen una capa lipdica externa la
cual se tie con cristla violeta al igual que la pared de las clulas de tipo Gram positivo pero con
la diferencia de que estas no tienen una capa lipdica, que al ser tratada con alcohol
desaparecen (debido a que el alcohol es un disolvente orgnico y disuelve la pared lipdica) y
por lo tanto la clula queda de nuevo sin teir y para poder observarla es necesario aadir
safranina.
Este tipo de tincin tiene una amplia aplicacin en trminos microbiolgicos, ya que permite la

identificacin y caracterizacin de bacterias que pueden ser utilizadas en procesos

biotecnolgicos.

INSTITUTO TECNOLGICO SUPERIOR DE ABASOLO

Ingeniera Ambiental
Asignatura: Biotecnologa Ambiental

Ttulo: Prctica de tincin Gram

Presenta:

Mayra Gonzlez Carren

Nancy Edith Navarro Magdaleno
Ana Gabriela Quezada Morales
Salvador Cisneros Guardado
Juan Antonio Cabrera Cuellar
Samuel Noriega Zavala

Nombre del profesor: Erick Rodolfo Lpez Almanza

17 de Marzo del 2015