REPBLICA DE CUBA

MINISTERIO DE SALUD PBLICA

CENTRO PARA EL CONTROL ESTATAL
DE LA CALIDAD DE LOS MEDICAMENTOS

REGULACIN No. 41-2007

VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS

Calle 200 No. 1706 e/ 17 y 19, Rpto. Siboney, Playa, Ciudad de La Habana. CUBA. C.P. 11600, A.P.
16065Telf.: (537) 2718645, 2718767, 2718622, 2718823 Fax: 2714023 e-mail: cecmed@cecmed.sld.cu

CONTENIDO
1

GENERALIDADES

DEFINICIONES

ORGANIZACIN DEL PROCESO DE VALIDACIN

3.1

Plan de validacin de mtodos analticos

3.2

Estudios de validacin

3.3

Protocolo de validacin

3.4

Categorizacin de los mtodos analticos para su seleccin

3.5

Extensin de la validacin segn la categora a que pertenece el

mtodo

3.6

Cumplimiento de BP para asegurar los resultados de la validacin

3.7

Clasificacin de mtodos segn su propsito. Definicin de parmetros

3.8

Desviaciones del Protocolo de validacin

10

DESARROLLO DEL PROCESO DE VALIDACIN. EVALUACIN DE

LOS PARAMETROS

11

4.1

Determinacin de Exactitud

11

4.2

Determinacin de Precisin

12

4.3

Determinacin de Especificidad

13

4.4

Determinacin de Linealidad

15

4.5

Determinacin del Intervalo

16

4.6

Determinacin del Paralelismo

16

4.7

Determinacin de la Robustez

17

4.8

Determinacin del lmite de deteccin y cuantificacin

17

4.9

Determinacin de la sensibilidad analtica

19

4.10

Pruebas de adecuacin del sistema

18

DOCUMENTACIN DE LOS RESULTADOS DE VALIDACIN

19

ASEGURAMIENTO DE LOS RESULTADOS Y MONITOREO DE LOS

ENSAYOS VALIDADOS

20

6.1

Aseguramiento de los resultados de los mtodos validados.

20

6.2

Utilizacin de los Grficos de Control

20

6.3

Revalidacin de los mtodos analticos

20

BIBLIOGRAFIA

22

Anexo 1

Validacin de mtodos microbiolgicos

24

Anexo 2

Validacin de mtodos alternativos

26

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1.Generalidades:
1.1 La validacin de los mtodos analticos utilizados en la actividades de control
desempea un papel determinante pues de ellos depende la comprobacin confiable y
reproducible de los ndices de calidad de las materias primas y productos, lo cual
contribuye notablemente al aseguramiento de la calidad, seguridad y eficiencia de los
mismos.
1.2 Esta Regulacin constituye una Gua que provee pautas generales sobre cmo
disear y acometer la validacin de un mtodo analtico. Establece requisitos mnimos,
definidos por el Centro para el Control Estatal de la Calidad de los Medicamentos
(CECMED), que deben ser adoptados por los laboratorios para el desarrollo de las
validaciones de sus mtodos analticos. Las desviaciones, adiciones o exclusiones de lo
establecido en este documento, que se realicen antes o durante el proceso de validacin
deben ser adecuadamente justificadas desde el punto de vista cientfico, regulador y/o de
factibilidad econmica.
1.3 El presente documento es aplicable fundamentalmente a los Laboratorios de Control
de Medicamentos (incluyendo los Laboratorios de Control de Proceso), pero en trminos
generales es extensible a laboratorios que participan en las fases de desarrollo de
productos farmacuticos. No ser aplicable este documento a la validacin de mtodos
automatizados. Constituye adems un complemento de las Directrices sobre Buenas
Prcticas de Fabricacin de Productos Farmacuticos y de las Buenas Prcticas para
Laboratorios de Control de Medicamentos, vigentes
2. Definiciones:
Las definiciones dadas a continuacin se aplican a los trminos empleados en esta
regulacin. Es posible que tengan significados diferentes en otros contextos:
Analito: Componente de una magnitud medible. Sustancia de la muestra ensayada que
va a ser determinada.
Blanco: Muestra que contiene alguno o todos los componentes de la muestra, con la
excepcin del analito de inters. Termino permisible: Placebo
Buenas Prcticas de Laboratorio para el Control de Medicamentos, BPLCM:
Conjunto de reglas, procedimientos operativos y prcticas adecuadas para garantizar que
los datos generados por los Laboratorios de Control de Medicamentos sean confiables.
Calibracin: Conjunto de operaciones que establecen, bajo condiciones especificadas, la
relacin entre los valores de magnitudes indicados por un instrumento o sistema de
medicin, o los valores representados por una medida materializad o un material de
referencia y los correspondiente valores reportados por patrones.
Control de cambio: Procedimiento escrito que describe la(s) accin(es) a tomar si se
propone un cambio de instalaciones, materiales, sistemas, equipos y/o procesos usados
en la fabricacin, envasado o ensayo de un producto farmacutico o que puede afectar la
operacin del sistema de gestin de la calidad o de apoyo. Su objetivo es determinar las
acciones necesarias para garantizar y documentar que el sistema se mantiene en un
estado validado
.

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Desviacin: Parmetro del proceso o procedimiento

especificaciones definidas para el ensayo de una muestra.

que

se

aparta

de

las

Nota: A los efectos de la validacin se considera desviacin a cualquier modificacin

realizada en el protocolo original aprobado cuando se ejecuta el procedimiento
experimental.
Desviacin negativa: Ocurre cuando un mtodo alternativo da un resultado negativo sin
confirmacin y el mtodo de referencia da un resultado positivo. Esta desviacin se
convierte en un resultado falso negativo cuando puede demostrarse que el resultado
verdadero es positivo.
Nota: Este trmino es muy utilizado en ensayos microbiolgicos.
Desviacin positiva: Ocurre cuando un mtodo alternativo da un resultado positivo sin
confirmacin y el mtodo de referencia da un resultado negativo. Esta desviacin se
convierte en un resultado falso positivo cuando puede demostrarse que el resultado
verdadero es negativo.
Nota: Este trmino es muy utilizado en ensayos microbiolgicos.
Ensayo / prueba: Determinacin de una o ms caractersticas de una muestra, de
acuerdo con un procedimiento o mtodo establecido.
Nota: Dentro del control de calidad, los ensayos pueden clasificarse, segn sus principios
en fsico qumicos, microbiolgicos o biolgicos.
Especificidad o Selectividad: Capacidad del ensayo para identificar o medir el analito en
una muestra en presencia de otros componentes previsibles en el producto (impurezas,
productos de degradacin, otros componentes de la formulacin). Tambin se expresa
como el desvo o error porcentual entre el valor medido y conocido.
Evaluacin del desempeo del mtodo: Verificacin de la capacidad del mtodo para
cumplir de forma satisfactoria con todos los requisitos establecidos para el mismo.
Trminos permisibles: Estandarizacin, Funcionabilidad.
Exactitud: Es el grado de concordancia entre el valor real y el valor medido. Se expresa
como el desvo o el error porcentual entre el valor observado (experimental) y el valor
verdadero. Trmino permisible: Veracidad.
Grupo de Expertos: Grupo formado por cientficos relevantes en su campo para evaluar
una temtica determinada.
Institucin de Referencia: Se refiere a instituciones que cuente con expertos que
posean gran experiencia en la validacin de mtodos analticos (a citar, ECVAM, OMS,
Ibas, etc.)
Intervalo: Intervalo existente entre la concentracin superior e inferior de analito
susceptible de ser medido con exactitud, linealidad y precisin aceptables.
Laboratorio de Control de Medicamentos, LCM: Conjunto de instalaciones, equipos,
procedimientos y personal destinados a la comprobacin y evaluacin de la calidad de los
medicamentos.
Lmite de cuantificacin: Cantidad ms baja de analito que puede medirse
cuantitativamente en una muestra con exactitud y precisin aceptables.

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Lmite de deteccin: Cantidad ms baja de analito que puede detectarse, pero no

necesariamente cuantificarse, como una concentracin o cantidad exacta.
Linealidad: Capacidad de una prueba de generar resultados directamente proporcionales
a la caracterstica del analito.
Nota: Puede expresarse como la pendiente de la lnea de regresin y su varianza o como
el coeficiente de determinacin (R2) y el coeficiente de correlacin (R).
Material (patrn) de referencia : Material o sustancia del cual uno o ms de sus valores
propios son suficientemente homogneos y estn bien establecidos para ser usados para
la calibracin de un instrumento, la evaluacin de un mtodo de medicin, o para la
asignacin de valores a los materiales.
Mtodo analtico (o de ensayo): Descripcin de una o ms tcnicas analticas, en la cual
se identifican los recursos materiales y la secuencia de actividades para verificar la
calidad de una muestra.
Muestra: Parte o porcin finita representativa de materias primas, materiales de envase o
de lote que se somete a anlisis a los efectos de verificar las caractersticas de calidad o
su adecuacin para el uso.
Muestra ciega: Muestra control cuya caracterstica a ser evaluada es desconocida por el
analista en el momento del ensayo.
Paralelismo: Relacin paralela que se requiere entre las curvas dosis respuesta de las
muestras de ensayo y de referencia, para obtener estimados de potencia relativa o en
funcin de definir la validez de un ensayo biolgico.
Plan de Validacin: Documento que describe los ensayos que deben ser validados y/o
estandarizados en un periodo de tiempo determinado.
Precisin: Es el grado de concordancia de los valores de una serie repetida de ensayos
analticos, efectuados sobre una muestra homognea. Es la distribucin de los valores
analticos alrededor de su media, y se expresa como el coeficiente de variacin (CV). Esta
puede relacionarse a tres niveles, mediante la repetibilidad, la precisin intermedia y la
reproducibilidad.
Repetibilidad: Medida de la precisin de un mtodo llevada a cabo sobre la base de un
nmero suficiente de determinaciones de una mezcla homognea del producto, en las
mismas condiciones, sobre la misma muestra, por un mismo analista, en el mismo
laboratorio con los mismos equipos y reactivos; generalmente en un corto intervalo de
tiempo, por lo cual evala la variabilidad intrnseca del proceso. Tambin se nombra
precisin intraensayo
Precisin intermedia: Medida de la precisin dentro de un laboratorio cuando se emplea
una muestra homognea y se analiza en condiciones diferentes, es decir analista
diferente, das diferentes en equipos diferentes. Se recomienda el uso de un diseo
experimental. Refleja las condiciones reales dentro del laboratorio.
Reproducibilidad: Medida de la precisin de los resultados de un mtodo analtico que
se efecta sobre la misma muestra pero en condiciones diferentes: analistas, laboratorios,
equipos, das entre otras, es decir, evala la variabilidad debida a un factor intrnseco al
mtodo. Es la precisin interlaboratorio que se evala en el marco de estudios
colaborativos.

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Protocolo de validacin: Conjunto de instrucciones por escrito cuyo alcance es mayor

que el de un procedimiento normalizado de operacin, y que describe detalladamente
todos los pasos a seguir para validar un ensayo.
Registro: Documento que presenta resultados obtenidos o proporciona evidencias de
actividades desempeadas.
Revalidacin: Repeticin total o parcial de una validacin debido a cambios efectuados
que pueden afectar la bondad del mtodo.
Robustez: Capacidad del procedimiento de producir resultados analticos con exactitud y
precisin aceptables bajo variadas condiciones. Trmino permisible: Fortaleza.
Sensibilidad analtica: Capacidad del ensayo para registrar pequeas variaciones de la
concentracin.
Nota: Es la pendiente de la curva de calibracin.
Transferencia de un mtodo analtico: Proceso de traspaso de un mtodo analtico del
laboratorio que lo desarroll y valid a otro que desea adoptarlo.
Trazabilidad: Capacidad para seguir la historia, la aplicacin o la localizacin de todo
aquello que est bajo consideracin.
Validacin: Establecimiento de pruebas documentales que aportan un alto grado de
seguridad, de que un proceso planificado se efectuar uniformemente en conformidad con
los resultados previstos especificados.
Validacin prospectiva: Validacin planificada y ejecutada antes de la implementacin
oficial del mtodo analtico para verificar el cumplimiento de las especificaciones de calidad.
Validacin retrospectiva: Validacin basada en la revisin histrica de los datos de ensayo
acumulados durante un proceso.
3. Organizacin del proceso de validacin:
3.1 Plan de validacin de mtodos analticos.
3.1.1 Cada laboratorio contar con un Plan de validacin de mtodos analticos.
3.1.2 El Plan de validacin debe ser revisado anualmente y en el mismo se especificarn
los ensayos que requieren validacin y cuales sern sometidos a evaluacin de su
desempeo.
3.1.3 Se especificar en dicho Plan el perodo en que tendr lugar la validacin y las
responsabilidades en este proceso.
3.1.4 El plan de validacin incluir las revalidaciones. En caso de requerirse
revalidaciones por causas imprevistas, stas se considerarn fuera del plan pero
se incorporarn al mismo de forma anexa.

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3.2 Estudios de validacin.

3.2.1 Siempre que sea posible deber realizarse una validacin prospectiva, que permita
ajustar de forma planificada todos los elementos en funcin de obtener resultados
con el mximo de confiabilidad.
3.2.3 La validacin retrospectiva puede efectuarse para mtodos de ensayos
implementados por un largo periodo de tiempo, siempre que se demuestre que el
mtodo analtico en cuestin permaneci bajo control durante el perodo
seleccionado para el anlisis y que la documentacin de validacin y de
cumplimiento de BPLCM y/o de sistema de calidad a presentar es suficientemente
confiable y trazable.
3.3 Protocolo de validacin.
3.3.1

Cada mtodo analtico a validar contar con un Protocolo de validacin.

3.3.2

Los Protocolos de validacin contarn al menos con la siguiente informacin:

a) Identificacin del Laboratorio y/o institucin a la que pertenece el mismo.

b) Ttulo del estudio de validacin.
c) Niveles de aprobacin del Protocolo. Responsabilidades.
d) Objetivo y Alcance de la validacin. En caso de que se trate de una revalidacin,
deber indicarse la causa de la misma.
e) Categora a la que pertenece el mtodo y clasificacin segn sus caractersticas.
f)

Relacin de materiales, reactivos, patrones, equipos y documentos involucrados

en el estudio.

g) Muestras y procedimiento de muestreo a utilizar.

h) Fundamento terico del mtodo y la referencia del mismo.
i)

Relacin de los parmetros a evaluar durante la validacin.

j)

Diseo experimental y criterios de aceptacin por parmetro.

k) Anlisis estadstico a ser utilizado para el procesamiento de los resultados.

l)

Planillas, registros o certificados de validacin de los resultados obtenidos,

clculos y procesamiento estadstico, desviaciones, etctera.

3.3.3 Cualquier cambio que se requiera efectuar a un Protocolo ya aprobado, deber

estar bien justificado y ser incorporado al Protocolo sin desechar la informacin
anterior. El mismo debe estar sujeto al sistema de control de cambios establecido
en la institucin.

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3.4 Categorizacin de los mtodos analticos para su seleccin:

3.4.1

Para favorecer la seleccin adecuada de los mtodos analticos a ser validados,

los laboratorios debern guiarse por las siguientes categoras:
a) Mtodos normalizados: Se considerarn como tales aquellos mtodos
descritos en Farmacopeas (USP, BP, Farmacopea Europea), en Series de
Informes Tcnicos y Manuales de Mtodos de la OMS, adems de otras
normas y manuales de mtodos de aceptacin internacional.
b) Mtodos estandarizados: Se considerarn los derivados de estudios
colaborativos internacionales cuyos resultados han sido publicados y se
encuentran en fase de aceptacin por entidades reguladoras internacionales y
nacionales.
c) Mtodos modificados: Sern aquellos mtodos normalizados o
estandarizados con variaciones de mayor o menor relevancia (cambios en su
ejecucin, utilizacin fuera de su alcance, etc.)
d) Mtodos desarrollados en el laboratorio: Se considerarn como tales los
mtodos de ensayo generados por el propio laboratorio como alternativa a los
mtodos normalizados y estandarizados.
e) Mtodos alternativos: Categora especial que slo incluir a los mtodos de
ensayo diseados con el propsito de reemplazar, refinar o reducir la
utilizacin de animales de experimentacin en los ensayos.

3.4.2 No es obligatorio la utilizacin de mtodos de ensayo descritos en Farmacopea. El

empleo de mtodos estandarizados o desarrollados en el laboratorio es aceptable
siempre y cuando se demuestre su equivalencia y relevancia.
3.5 Extensin de la validacin segn la categora a la que pertenece el mtodo
3.5.1

Los mtodos normalizados y estandarizados no requieren validacin sino una

evaluacin de su desempeo. No obstante, para la introduccin de los mismos
cada laboratorio definir sus criterios de evaluacin caso a caso, tomando en
consideracin las caractersticas del mtodo y la experiencia que se tenga en la
caracterizacin del producto en cuestin.
La evaluacin del desempeo puede realizarse por:
evaluacin de varias replicas de un material de referencia bien caracterizado.
evaluacin limitada de algunos parmetros de validacin (o la combinacin de
ellos) como la exactitud, la precisin y / o la especificidad.

3.5.2 Los mtodos modificados requieren validacin y su extensin depender de la

naturaleza del cambio introducido.
Si las modificaciones realizadas poseen poco impacto sobre el desempeo
del mtodo analtico, slo se requiere una validacin del cambio. Siempre

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que sea posible, deber compararse el mtodo modificado contra el mtodo

normalizado o estandarizado original para demostrar que no existen
diferencias significativas entre ellos.
Si las modificaciones son significativas, se proceder a una validacin
exhaustiva del mtodo.(reevaluacin de todos los parmetros de validacin
aplicables)
3.5.3 Los mtodos desarrollados en el laboratorio requieren validacin exhaustiva.
En caso de que los mismos pretendan sustituir algn mtodo establecido, se
determinar el grado de correlacin entre ambos mtodos.
Para realizar la transferencia de un mtodo desarrollado en otro laboratorio,
se definirn criterios para la introduccin del mismo. Si el mtodo ha sido
validado, se realizar una evaluacin del desempeo o ensayo de
funcionalidad, y posteriormente se realizar un estudio entre ambos
laboratorios con anlisis de las mismas muestras para demostrar
equivalencia. En caso de que el ensayo no haya sido validado o se transfiera
con modificaciones al original, se acometer una validacin exhaustiva.
3.5.4 Los mtodos alternativos requieren validacin exhaustiva. Esto incluir la
validacin del mtodo como tal y la validacin de la correlacin con el mtodo
original o con los resultados de los ensayos de evaluacin del producto en ensayos
clnicos (ver Anexo 2).
Para la presentacin al CECMED de mtodos alternativos novedosos
(basados en nuevas tecnologas o diseos) se requerir el aval de
instituciones de referencia o paneles de expertos (ver Anexo 2).
Nota: En el caso de mtodos utilizados durante el proceso como ensayos
complementarios, es decir que no son usados para verificar cumplimiento de
especificaciones de calidad, se realizara una validacin limitada solo para demostrar que
los componentes de la muestra no invalidan los resultados.
3.6 Cumplimiento de Buenas Prcticas para asegurar los resultados de la validacin.
3.6.1 Los laboratorios que desarrollen estudios de validacin cumplirn con los
requerimientos de Buenas Prcticas de Laboratorio aplicables en funcin de
asegurar los resultados obtenidos.
3.6.2 En particular se pondr nfasis en los siguientes aspectos:
Se garantizar:
a)

La calidad de los reactivos utilizados en los estudios.

b) El control sobre la preparacin de las soluciones de ensayo (incluyendo el agua

utilizada), la identificacin inequvoca de las mismas y su conservacin

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c) El empleo de materiales de referencia adecuadamente caracterizados, bien sean

primarios o secundarios calibrados contra los primarios. Se dispondr de la
documentacin de tales patrones.
d) La calibracin y/o verificacin de aquellos equipos que lo requieran antes de
comenzar el estudio de validacin. El laboratorio debe disponer de toda la
documentacin que avale el estado de la calibracin y/o verificacin
e) El control sobre la manipulacin y conservacin de las muestras para el estudio.
Adems, se garantizar la homogeneidad de dichas muestras de ensayo
f)

La conservacin de la documentacin en funcin de la trazabilidad.

g) La calificacin y entrenamiento requeridos del personal que ejecuta la validacin e

interpreta los resultados obtenidos.
3.7

Clasificacin de los mtodos de ensayo segn su propsito. Definicin de

parmetros.

3.7.1 Segn su propsito los mtodos de ensayo se clasificarn en 3 grupos: ensayos

de identidad, determinacin de impurezas, contenido y actividad biolgica o
potencia:
Los ensayos de identidad agrupan aquellos diseados para identificar un
analito en una muestra por comparacin de una propiedad fsico qumica
(comportamiento cromatogrfico, espectro, reactividad qumica) o
inmunoqumica (interaccin antgeno anticuerpo) con la de una sustancia de
referencia.
Los ensayos de determinacin de impurezas agrupan aquellos utilizados para
determinar impurezas cualitativamente o cuantitativamente.
Los ensayos de contenido y actividad biolgica agrupan los empleados para la
evaluacin de la actividad biolgica o potencia, as como para la cuantificacin
del ingrediente farmacutico activo u otro componente del producto. De igual
forma pueden incluirse otros tipos de mtodos analticos como los ensayos de
disolucin.
3.7.2

La seleccin de los parmetros se realizar de acuerdo a la siguiente Tabla:

Parmetro

Identidad

Exactitud
Precisin
Robustez
Linealidad e intervalo
Paralelismo
Especificidad
Lmite de deteccin
Lmite de cuantificacin

+
+

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Impurezas
Contenido o Potencia
Cuantificacin Lmites
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

+
+
-

Leyenda: +

el parmetro debe ser evaluado obligatoriamente

el parmetro no tiene que ser evaluado
el parmetro no tiene que ser necesariamente evaluado, pero puede requerirse su
determinacin bajo determinadas circunstancias.

La falta de especificidad de un mtodo no implicar su invalidacin para el uso

propuesto, pero s requerir la utilizacin de un procedimiento complementario
que garantice la especificidad del mtodo analtico.
La evaluacin de la reproducibilidad se considerar relevante cuando el
mtodo va a ser aplicado en ms de un laboratorio (en la misma institucin o
en otra institucin).
En ensayos biolgicos para los cuales no existen patrones puros de analito y
que poseen una variabilidad notable (ms del 25 %), como es el caso de los
ensayos en animales, entre otros, la determinacin de la exactitud no resultar
relevante.
La evaluacin del paralelismo constituye un parmetro relevante en el caso de
los ensayos biolgicos para la determinacin de potencia, aunque puede
resultar aplicable en otros ensayos inmunoenzimticos.
La evaluacin de la robustez podr realizarse durante la fase de desarrollo del
mtodo y no necesariamente durante la validacin. En tal caso, dicho estudio
se documentar rigurosamente incluyendo y ajustando los factores
considerados crticos en el procedimiento del mtodo analtico a validar.
3.7.3 Los mtodos analticos que no estn incluidos en la clasificacin descrita en 3.7.1,
la definicin de los parmetros se realizar caso a caso, segn el propsito y las
caractersticas del mtodo.
3.8 Desviaciones del Protocolo de Validacin.
3.8.1 Las actividades de validacin se ejecutarn segn lo establecido en los Protocolos
de Validacin.
3.8.2

Cualquier desviacin de lo descrito en el protocolo debe ser adecuadamente

justificada y documentada, ya sea como informacin anexa o como parte del
propio protocolo. Adems, debe evaluarse y documentarse la repercusin de la
desviacin en el proceso de validacin.

3.8.3 Las desviaciones del protocolo sern analizadas y autorizadas por la direccin del
laboratorio y Aseguramiento de la Calidad.

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4. Desarrollo del proceso de validacin. Evaluacin de los parmetros.

4.1

Determinacin de la Exactitud.

4.1.1 La determinacin de la exactitud deber realizarse por estudios de adicin y

recuperacin de cantidades conocidas de muestras de referencia o patrones a
excipientes a fin de comparar el valor medido experimentalmente (observado) con
el valor real (esperado).
4.1.2 En ensayos fsico qumicos la determinacin de este parmetro podr realizarse
por algunos de los siguientes mtodos:
a) Anlisis repetido de una muestra de concentracin conocida: Se realizar por
adicin de una concentracin conocida de un analito o patrn a un placebo.
Debern implementarse entre 6 y 10 ensayos y se calcular el porciento de
recuperacin. Se implementarn pruebas de significacin apropiadas.
b) Anlisis repetidos de muestras de concentraciones conocidas diferentes: Se
seguir un diseo similar al anterior. Se utilizarn 3 concentraciones como mnimo
(intervalo alto, medio y bajo) y se realizarn los anlisis por triplicado. En este tipo
de estudio, se evaluar la influencia del factor concentracin.
c) Mtodo de adicin de patrn: Se tomarn alcuotas de una muestra a las que se
aaden cantidades conocidas de un patrn, dejando una alcuota como control de
muestra. Dichas muestras se analizarn en paralelo por triplicado y se evaluarn
contra una curva de calibracin preparada con soluciones patrones. Se calcular
la recuperacin como medida de exactitud y su significacin por pruebas
estadsticas apropiadas.
d) Comparacin con otro mtodo validado: Podr implementarse a concentracin
nica o en un intervalo de 2 a 4 concentraciones diferentes. En cualquier caso se
analizarn las muestras 6 veces como mnimo. Se implementarn pruebas de
significacin apropiadas.
4.1.3 Para que la evaluacin de la exactitud se considere satisfactoria, no existirn
diferencias significativas entre los valores obtenidos experimentalmente y los
valores verdaderos.
4.1.4 En ensayos biolgicos los mtodos antes descritos pueden no ser aplicables. En su
lugar (o de forma concomitante) la determinacin de la exactitud podr realizarse
por algunas de las siguientes variantes:
a) Valor terico en el intervalo de confianza del valor experimental: Se utilizarn
diluciones diferentes (al menos 3) de un material de referencia, las cuales sern
analizadas por duplicado en 3 ensayos como mnimo. En todos los casos, el valor
terico (esperado) deber estar comprendido en el intervalo de confianza del valor
experimental (hallado).
b) Comparacin con un material de referencia: Se compararn muestras de
produccin con un material de referencia homogneo y bien caracterizado en al
menos 3 ensayos ejecutados en paralelo. No existirn diferencias significativas

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entre las muestras y el material de referencia para el grado de probabilidad

determinado.
Nota: Podr ser utilizado cualquier otro mtodo siempre que se demuestre
estadsticamente la exactitud.
4.2

Determinacin de la precisin.

4.2.1 La determinacin de la precisin se realizar a 3 niveles, siempre que proceda:

intraensayo (repetibilidad), interensayo (precisin intermedia) e interlaboratorios
(reproducibilidad). Las muestras a incluir en este estudio sern lotes de produccin
(muestras reales).
4.2.2

En ensayos fsico qumicos la evaluacin de la precisin podr seguir los

siguientes diseos experimentales:

a) Evaluacin de la repetibilidad: (1) se utilizarn 2 o ms concentraciones de una

muestra homognea, las cuales sern analizadas 6 veces como mnimo en una
misma corrida, (2) se prepararan muestras de 3 concentraciones diferentes, una
inferior, media y superior del intervalo especificado y realizar 3 replicas de cada
una o (3) realizar un mnimo de 6 determinaciones a la concentracin del 100 %.
b) Evaluacin de la precisin intermedia: Se implementar un diseo donde se
evaluarn 3 concentraciones de una muestra (como mnimo) en duplicado, por al
menos 2 analistas en 3 das diferentes. Se recomienda, siempre que sea posible,
que cada analista emplee instrumentos y materiales diferentes.
c) Evaluacin de la reproducibilidad: Se implementar en forma de estudio
interlaboratorio. Se evaluarn de 3 a 5 muestras (en un esquema de 2 a 4
concentraciones por muestra) por duplicado, involucrando diferentes analistas,
reactivos e instrumentos en cada laboratorio. Las muestras se analizarn en 6
ensayos independientes como mnimo.
Nota: Podr ser utilizado cualquier otro mtodo siempre que se demuestre
estadsticamente la precisin.
4.2.3 En cada caso se evaluar la media, desviacin estndar tpica y el coeficiente de
variacin (CV). Se implementarn pruebas de significacin adecuadas para medias
y varianzas, siempre que proceda.
4.2.4 Los resultados de los estudios de precisin se expresarn en trminos de CV, el
cual no exceder el 5% de variabilidad total en ensayos fsico qumicos.
Generalmente se aceptarn variabilidades menores para algunos mtodos como
los cromatogrficos ( 2%) y los espectrofotomtricos ( 3%). La variabilidad
aceptada en estudios de repetibilidad ser menor para anlisis de IFA que para
determinacin de impurezas o de producto terminado, por la influencia de la
concentracin de analito.
4.2.5 En ensayos biolgicos la evaluacin de este parmetro podr seguir los siguientes
diseos experimentales:

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a) Evaluacin de la repetibilidad: Se prepararn 10 rplicas de cada dilucin de

muestra utilizada en el ensayo y se evaluarn en una misma corrida (3 veces
como mnimo por el mismo analista). Se calcular el CV por dilucin, el cual no
ser superior al 10% para inmunoensayos y otros ensayos in vitro ni superior al
20% para el caso de los ensayos en cultivos celulares. Para los ensayos in vivo,
se seleccionarn 3 concentraciones (rango alto, medio y bajo del ensayo) y se
prepararn 3 rplicas de cada una, las cuales se analizarn en un mismo ensayo o
en ensayos diferentes por un mismo analista. El CV no ser superior al 50%.
b) Evaluacin de la precisin intermedia: Se evaluarn entre 3 y 5 lotes de
fabricacin en todo el rango de trabajo, en al menos 6 determinaciones
independientes, involucrando diferentes analistas, instrumentos y materiales de
laboratorio. Se evaluar la variabilidad entre analistas, das y entre lotes. Para
inmunoensayos y otros ensayos in vitro el CV no ser superior al 20%. Para
ensayos en animales y en cultivos celulares estar en el rango del 50 al 150 %.
c) Evaluacin de la reproducibilidad: Se implementar en forma de estudio
interlaboratorio. Se evaluarn entre 3 y 5 lotes de fabricacin, de ser posible de
diferentes actividades biolgicas, en todo el rango de trabajo en al menos 10
ensayos independientes, involucrando diferentes analistas, reactivos e
instrumentos en cada laboratorio. Para inmunoensayos y otros ensayos in vitro el
CV no ser superior al 20%. Para ensayos en animales y en cultivos celulares
estar en el rango del 50 al 150 %.
4.3

Determinacin de la especificidad.

4.3.1 El diseo de los estudios de especificidad depender de las caractersticas del

mtodo, del uso propuesto y del tipo de muestra que se vaya a analizar.
4.3.2 La evaluacin de la especificidad, en funcin de las caractersticas de los mtodos
de ensayo, deber estar dirigido a los siguientes aspectos:
a) Identidad: Se demostrar que el mtodo es capaz de identificar el principio activo
en presencia de otras sustancias.
b) Pureza: Se demostrar que el mtodo permite una evaluacin cualitativa o
cuantitativa de las impurezas especficas.
c) Determinacin cuantitativa de un componente (o para ensayos de actividad): Se
asegurar que la seal medida por el mtodo analtico corresponde
exclusivamente al analito sin interferencias de excipientes, productos de
degradacin y/o impurezas.
4.3.3

En ensayos fsico qumicos la evaluacin de este parmetro podr seguir los

siguientes diseos experimentales:
Determinacin en IFA:

a) Evaluacin de impurezas: Se comparar un patrn contra la misma muestra

cargada con contaminantes potenciales a concentraciones no inferiores a los
lmites establecidos, o en una proporcin no superior al 1% de cada contaminante.

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Las muestras se analizarn en paralelo como mnimo en 3 ensayos diferentes. Se

determinar el porciento de recuperacin y su significacin estadstica.
b) Evaluacin de productos de degradacin: Se proceder de forma similar a la
anterior. En caso de que no se disponga de productos de degradacin, se
comparar el patrn contra un lote de IFA envejecido y/o sometido a condiciones
de estrs previamente evaluadas.
c) En caso de que se desconozca la estructura de un contaminante o no exista
disponibilidad del mismo, se analizarn el patrn y el lote de IFA envejecido y/o
sometido a condiciones de estrs por el mtodo en cuestin y por un mtodo
complementario de mayor especificidad. La especificidad estar determinada por
el grado de coincidencia entre ellos.
Determinacin en producto terminado:
Nota: En este caso se seguirn los siguientes diseos por separado o en
combinacin, en dependencia de las caractersticas del mtodo y de las muestras
a evaluar.
a) Se prepararn placebos, los cuales se analizarn recin preparados y sometidos a
degradacin. Ninguno de los componentes deber dar una seal cuantificable.
b) Se adicionar patrn de analito al placebo y se comparar la respuesta con
respecto al patrn puro de analito. Los resultados debern ser concordantes.
c) Se adicionar patrn de analito cargado con impurezas y productos de
degradacin al placebo y se comparar contra el patrn puro de analito por el
mtodo en cuestin y por uno complementario de igual o mayor especificidad. En
su lugar, podr degradarse una muestra de producto terminado en su envase
definitivo y se comparar con el patrn de analito puro.
d) Para los ensayos de identificacin se puede tratar la solucin del placebo con el
reactivo que se utiliza para provocar la reaccin qumica y demostrar que no existe
interferencia o reaccin del placebo con el reactivo qumico.
4.3.4 En el caso que los productos de descomposicin sean desconocidos o no puedan
aislarse se recomienda realizar los siguientes pasos:
-

Evaluar la estructura qumica de la droga y postular las posibles rutas de

degradacin y mtodos de ataque.

Proceder a la degradacin artificial de las siguientes formas:

Termlisis: Colocar el analito o principio activo, placebos y muestras en un horno a

temperaturas entre 70-120 C o a 20 C por debajo del punto de fusin del
principio activo.

Hidrlisis: Por calentamiento a reflujo con agua.

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Hidrlisis alcalina: Por calentamiento a reflujo con hidrxido de sodio 1 N durante

una hora.

Hidrlisis cida: Por calentamiento a reflujo con cido clorhdrico 1 N durante una
hora.

Fotolisis: Someter el analito a degradacin en una solucin de la misma a la luz

UV de onda corta y a la luz solar directa o indirectamente.

Oxidacin: Por calentamiento en bao de Maria de una solucin del analito con
gotas de peroxido de hidrgeno.
Nota: Se recomienda que la degradacin del analito no sea mayor del 20 % de la
concentracin inicial.

4.3.5 Para ensayos biolgicos los diseos descritos anteriormente resultan aplicables.
Puede resultar relevante en estos estudios de especificidad evaluar no slo
materiales de referencia bien caracterizados, sino tambin de 1 a 3 lotes de
fabricacin, fundamentalmente para ensayos que son producto especficos.
Para algunos productos biolgicos (inmunosueros y otros obtenidos por
tcnicas de ADN recombinante) puede ser conveniente la evaluacin de la
especificidad de los ensayos de determinacin de su actividad biolgica por
utilizacin de anticuerpos neutralizadores.
4.4

Determinacin de la Linealidad:

4.4.1 Este estudio se efectuar tanto sobre soluciones patrn de analito como sobre
muestras problema que contengan concentraciones crecientes de analito.
4.4.2 En ensayos fsico qumicos los estudios de linealidad respondern a diseos
similares a los que se describen a continuacin:
a) El ensayo se puede efectuar tanto con material de referencia del analito, como
con muestras problemas que contengan concentraciones crecientes de analito
que cubran el intervalo del mtodo. Cuando se trata de la valoracin de una
materia prima se analizaran de 3 a 5 soluciones patrn en un intervalo de
concentraciones entre 80 y 120 % de la concentracin terica. Cuando se trata
de la valoracin del principio activo en un producto terminado se analizaran
entre 5 y7 soluciones patrn en un intervalo de concentraciones entre 50 y
150% de la concentracin terica del principio activo en la muestra. En los dos
casos el anlisis se realizar como mnimo por triplicado.
b) Se evaluarn los datos estadsticamente a fin de verificar la linealidad y
proporcionalidad segn se describe a continuacin:

Significacin de la regresin: Se determinar el coeficiente de correlacin

(debe ser 0.990) y el de determinacin (valores superiores a 0.98).

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Verificacin de linealidad: Se efectuar por determinacin del CV de los

factores de respuesta (cociente respuesta / concentracin), el cual no ser
superior al 5%. Tambin se evaluar la varianza de la pendiente de la lnea de
regresin.

Verificacin de proporcionalidad: Los resultados de este ensayo debern incluir

el 0 para el grado de probabilidad definido.

Prueba de falta de ajuste: Se implementar para demostrar que los valores se

ajustan a una lnea recta.

Nota: Podr ser utilizado cualquier otro mtodo siempre que se demuestre
estadsticamente la linealidad.
4.4.3 En ensayos biolgicos la determinacin de la linealidad involucrar la preparacin
de 4 a 8 diluciones de la muestra en el intervalo definido y su anlisis por triplicado
en 3 corridas independientes. En este caso, se calcular la exactitud y precisin
para cada dilucin, los cuales debern ser aceptables para que se considere lineal
el mtodo.
NOTA: En algunos ensayos biolgicos para determinacin de potencia, los
programas estadsticos para conocer la actividad biolgica del producto evalan el
cumplimiento de la linealidad como parte de los criterios de validez del ensayo, de
modo que resulta adecuado utilizar tales confirmaciones para estimar la linealidad
del sistema.
4.5

Determinacin del intervalo.

4.5.1 En ensayos fsico qumicos la determinacin del intervalo podr efectuarse bajo el
mismo diseo del estudio de exactitud. Para ello se prepararn muestras por
adicin de sustancia a blancos en los extremos y dentro del intervalo que se desea
establecer, analizando los mismos de manera repetida. En cada uno de los niveles
seleccionados deber cumplirse los criterios de exactitud, precisin y linealidad.
NOTA: Por regla general debern ser evaluados los siguientes intervalos por tipo
de ensayo: 80-120 % de la concentracin de ensayo para determinacin de
sustancia activa o producto terminado, 70-130 % para uniformidad de contenido,
20 % del rango especificado para ensayos de disolucin, y para determinacin de
impurezas del nivel reportado al 120 % de la especificacin.
4.5.2 En ensayos biolgicos el rango estar constituido por el lmite superior e inferior de
la linealidad (con precisin y exactitud aceptables) o ser determinado a partir de
la curva de calibracin.
4.6

Determinacin de paralelismo:

4.6.1 Slo resultar aplicable a ensayos biolgicos en los cuales la curva dosis
respuesta sea lineal, de forma natural o transformada. Este estudio resultar un
test de identidad entre 2 preparaciones, el material de referencia y el analito

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diluidos en un mismo tampn de ensayo o fluido, y deber realizarse de forma

concomitante al estudio de Linealidad.
4.7

Determinacin de la Robustez:

4.7.1 En este estudio se evaluarn variaciones razonables deliberadamente efectuadas

con el propsito de identificar factores que originen fluctuaciones menores y
variaciones significativas en el mtodo de ensayo. Podr realizarse durante o
previo a la validacin.
4.7.2 En ensayos donde la preparacin de las muestras resulte prolongada, se analizar
la estabilidad del analito en funcin de determinar si pequeas variaciones del
mismo en el tiempo pueden incidir en el desempeo del mtodo.
NOTA: Para ensayos fsico qumicos, esto puede ser recomendable en el caso
de mtodos colorimtricos, conductimtricos, y ensayos de disolucin, entre otros,
mientras que ser aplicable en ensayos biolgicos donde la preparacin de la
muestra resulte larga y engorrosa o se analice un nmero de muestras excesivo.
4.7.3 Dentro de las variables a considerar en un estudio de robustez, se evaluarn
cambios en la temperatura y/o humedad del cuarto o equipo de incubacin as
como en el tiempo de incubacin, en el pH de un reactivo o solucin o en la
composicin de sta, velocidad de flujo en la cromatografa, entre otros.
NOTA: Cuando se pretendan evaluar varios factores de variabilidad en un mtodo,
debern introducirse varios cambios a la vez, y no evaluar las variables una a una,
garantizando as la estimacin del efecto global de cada factor.
4.7.4 En ensayos biolgicos en particular, deber evaluarse adicionalmente, si procede, la
influencia de factores como los ciclos de congelacin / descongelacin de
muestras, nmero de pases de lneas celulares insertadas en el ensayo, orden de
adicin de las muestras, etctera.
4.7.5 Para conocer la influencia de los factores seleccionados sobre el sistema de ensayo,
se determinarn la exactitud y la precisin (u otro parmetro equivalente y
aplicable) de cada condicin con el objetivo de estimar el grado de tolerancia de
ellos en las condiciones normales de ensayo.
4.8

Determinacin del Lmite de deteccin y cuantificacin:

4.8.1 La evaluacin de ambos parmetros puede efectuarse bajo el mismo diseo.

4.8.2 La determinacin de estos lmites en ensayos fsico qumicos deber responder a
los siguientes diseos:
a) Relacin seal ruido: Se compararn la respuesta del blanco (matriz sin analito)
con las muestras que contienen pequeas cantidades de analito adicionadas al
blanco. Deber obtenerse el nivel medio de ruido del blanco y se multiplicar por 2
o 3 para el lmite de deteccin o por 6 o 10 para el de cuantificacin.
Posteriormente se compararn estos valores con las respuestas de las series

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blanco + analito y se hallar la concentracin de analito que corresponda al valor

de la seal.
b) Estudio de la menor cantidad detectable: Muy recomendado para cromatografa de
capa delgada en la deteccin de impurezas y/o productos de degradacin en IFA.
Se determinar la carga mxima de IFA que se separa correctamente en las
condiciones cromatogrficas establecidas, y posteriormente se prepararn
diluciones constantes de esta IFA (a una concentracin ya evaluada) ms
cantidades decrecientes del analito a estudiar. El lmite de deteccin se calcular a
partir de la dilucin en que no sea posible distinguir entre la respuesta del analito y
la del blanco. El resultado se expresar en valor absoluto o en porciento (con
respecto a la carga mxima).
c) Por estimacin: El lmite de deteccin y el de cuantificacin podrn extrapolarse
del valor de la ordenada en el origen (en unidades de concentracin), de la recta
del ensayo de linealidad o por anlisis repetido del blanco de la muestra. En todos
los casos se aplicarn clculos matemticos para estimar ambos lmites y estos
sern verificados mediante el anlisis de muestras que contengan el analito en
concentraciones iguales o aproximadas a los lmites estimados.
4.8.3 En ensayos biolgicos el estudio para la determinacin del lmite de deteccin
tendr como objetivo evaluar la concentracin mnima de sustancia que genere
una respuesta uniforme mayor que el valor de base de la prueba. Por regla
general, se evaluar la respuesta promedio del blanco y el lmite de deteccin ser
el doble o el triple de dicho valor.
4.8.4 Tanto el lmite de deteccin como el de cuantificacin son valores numricos. No se
aceptarn como especificaciones ndices cualitativos como no presencia o
ausencia del analito o la expresin no contiene.
4.9

Determinacin de la sensibilidad analtica:

4.9.1 Este parmetro se evaluar como parte de otros estudios. En un mtodo analtico
sensible, ligeros incrementos de concentracin, coincidirn con aumentos notables
en la seal o respuesta.
4.10

Pruebas de Adecuacin del sistema

NOTA: Las pruebas de adecuacin del sistema son parte esencial de muchos mtodos
analticos y dan la seguridad de que el sistema analtico se ejecuta correctamente.
Se basa en el concepto de que el equipamiento, las operaciones analticas y las
muestras utilizadas en el ensayo son evaluadas de forma integral para demostrar
la estabilidad del sistema durante la medicin o cuantificacin del analito. Las
farmacopeas establecen las pruebas de adecuacin del sistema que deben
realizarse antes acometer el ensayo para cada mtodo analtico.
4.10.1 La prueba de adecuacin del sistema debe establecerse para cada mtodo
analtico en particular dependiendo del tipo de mtodo que se va validar.

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4.10.2 En los mtodos cromatogrficos (lquido y gaseoso) se establecer el nmero de

replicas de inyecciones de la solucin estndar, la resolucin entre dos picos
consecutivos, el numero de platos tericos de la columna, etc.
4.10.3 En los mtodos volumtricos se establecern las condiciones de estandarizacin
de las soluciones volumtricas utilizadas en los ensayos.
4.10.4 En el caso de los mtodos espectrofotomtricos se establecer, al menos, el
nmero de rplicas necesario de los espectros de absorcin de las soluciones
estndar.
4.10.5 En los estudios de disolucin la adecuacin del sistema puede efectuarse a travs
de la calibracin qumica del disolutor utilizando tabletas calibradoras antes de
ejecutar la validacin del mtodo analtico.
4.10.6 La respuesta generada por la solucin estndar debe exhibir desviaciones
estndar relativas o coeficientes de variacin dentro de los lmites permitidos
segn el mtodo analtico utilizado.
5.

Documentacin de los resultados de la validacin.

5.1

Todos los datos primarios sern perfectamente auditables y trazables en la

documentacin del laboratorio.

5.2

En caso de que los resultados obtenidos no coincidan con los esperados, esto
ser adecuadamente documentado junto con un anlisis de las causas que
originaron tal resultado.
NOTA: El no cumplimiento de las especificaciones definidas para un parmetro no
necesariamente invalidar el uso del mtodo de ensayo en cuestin. En tal caso,
este mtodo slo podr ser utilizado para ciertos tipos de muestras o ser
acompaado de algn otro mtodo complementario.

5.3

Una vez concluidos los estudios de validacin y analizados los resultados, se

elaborarn los Informes tcnicos o de validacin correspondientes, los cuales
debern incluir:
a) Identificacin del Laboratorio y/o institucin a la que pertenece.
b) Identificacin del Informe Tcnico.
c) Ttulo del estudio de validacin.
d) Referencias de la calibracin, verificacin y/o calificacin de instrumentos de
medicin y equipos utilizados.
e) Resultados de las determinaciones de cada parmetro contra las
especificaciones, incluyendo datos primarios (esquemas, curvas de calibracin,
espectros y cromatogramas originales, lecturas de absorbancia, fotos, figuras,
etc.).

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f)

Discusin de los resultados y conclusiones.

g) Nivel de aprobacin de los resultados.

h) Fechas de inicio y conclusin del estudio.
5.2

Toda la documentacin (protocolo, informes, datos primarios, registros de ensayo)

se archivar adecuadamente mientras que se encuentre en uso el mtodo
validado.

6.

Aseguramiento de los resultados y monitoreo de los ensayos

validados

6.1

Aseguramiento de los resultados de los mtodos validados.

6.1.1

Durante el uso rutinario de los ensayos validados o estandarizados se insertarn,

con la frecuencia establecida por cada laboratorio y en dependencia de las
caractersticas de cada tcnica analtica, muestras controles positivos y negativos.
NOTA: En el caso de ensayos biolgicos, la inclusin de controles positivos y
negativos se realizar en todos los ensayos con carcter obligatorio.

6.1.2

Los ensayos incluirn adems la insercin de muestras ciegas con la frecuencia

que defina cada laboratorio.

6.1.3

Cada laboratorio poseer un programa de evaluacin del desempeo del mtodo

validado / estandarizado a travs de ensayos de aptitud y/o estudios colaborativos.

6.1.4

El personal responsable de estos ensayos ser sometido peridicamente a

evaluaciones de la competencia analtica. Estas evaluaciones debern ser cada 2
aos, como mnimo.
NOTA: Siempre que sea posible, las evaluaciones de la competencia analtica
sern conducidas por los especialistas de mayor experiencia en los laboratorios.

6.2

Utilizacin de grficos de control.

6.2.1 Los ensayos validados debern ser monitoreados a intervalos regulares a travs
de grficos de control (donde proceda) u otras herramientas estadsticas que
posibiliten mantener el control sobre el desempeo rutinario de los ensayos.
6.2.2 Los parmetros a ser controlados por grficos de control podrn responder al
comportamiento de materiales de referencia (primarios o de trabajo) y de muestras
controles positivos.
6.3

Revalidacin de mtodos analticos.

6.3.1

Los mtodos se revalidarn si existen cambios reales o posibles en su ejecucin,

de acuerdo a las siguientes recomendaciones:

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a) Cambios menores en el mtodo: Si el o los cambios son menores slo se requerir

una validacin parcial (validacin del cambio), dirigida a demostrar que el cambio
no posee impacto en el desempeo del mtodo. Cambios esperados como la
sustitucin de un lote de material de referencia de trabajo por otro, cambio en el
lote de conjugado o recubrimiento (por slo citar algunos ejemplos), no implicarn
la necesidad de revalidar, sino que se demostrar que sistema analtico
permanece bajo control tras los cambios a travs de grficos de control o
herramientas equivalentes.
b) Cambios mayores en el mtodo: Se requerir revalidacin exhaustiva (revalidacin
de todos los parmetros aplicables), la cual se ejecutar de acuerdo a lo
establecido en esta regulacin (Apartado 4.2).
c) Utilizacin de un mtodo por largo tiempo: Se debe demostrar que el sistema de
ensayo permaneci bajo control durante el perodo en cuestin.
d) Utilizacin de un mtodo despus de un tiempo sin uso: Si un mtodo deja de
utilizarse durante un perodo determinado se requerir una demostracin del
desempeo del mtodo antes de utilizarlo nuevamente con fines rutinarios. En
dependencia de los resultados obtenidos, proceder o no la realizacin de un
proceso de revalidacin exhaustivo.
6.3.2

Igualmente, los mtodos analticos sern revalidados si existen cambios mayores

en los procesos de fabricacin que puedan incidir sobre el desempeo de los
mismos, particularmente si existen cambios en las matrices o rangos de las
muestras ensayadas.

6.3.3

La documentacin relativa a los resultados de la revalidacin se elaborar segn

se establece en el Apartado 4.3 de esta regulacin.

Pgina 21 de 26

Bibliografa
1. PNO 07.001 Metodologa para la elaboracin, aprobacin y revisin de las
regulaciones. CECMED. 1995.
2. NC-ISO/IEC 17025. Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de
ensayo y calibracin. ISO. 2000.
3. Regulacin 37-2004 Buenas Prcticas para Laboratorios de Control de
Medicamentos.
4. Regulacin 33-2003 Control de cambios.
5. Castro Cels M et al. Validacin de mtodos analticos. Monografa AEFI. 1989.
6. Agalloco J. "Point to Consider" in the Validation of Equipment Cleaning
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Technology, Sept/Oct 1992: 163-168.
7. Pedersen HL. Validation of Manufacturing Processes for Drug Substances: An FDA
Perspective. Journal of Validation Technology 1995, Volume 1; 1: 7-11.
8. De Sain C. Master Method Validation Protocols, Documentation Basics. BioPharm
1992.
9. Levchuk JW. Good Validation Practices: FDA Issues. PDA Journal of Pharmaceutical
Science and Technology 1994, Volume 48; 5: 221-223.
10. USP. Validation of Compendial Methods (1225), general Information. The United
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11. International Organization for Standardization. Accuracy (trueness and precision) of
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12. US-FDA. Validation of Analytical Procedimientos: Methodology. Extension of: Text on
Validation of Analytical Procedimientos, Department of Health and Human Services,
FDA, Volume 61, No 46, Docket No 96D-0030, 1996.
13. US-FDA. International Conference on Harmonisation; Guideline on validation of
Analytical Procedimientos: Definitions and Terminology; Availability. DHHS, Federal
Register Vol. 60, 1995: 11260.
14. USP. Guidance for Industry. Bioanalytical methods validation for human studies.
CDER. 1998.
15. Guidance for Industry (Draft). Analytical procedures and methods validation. CBER
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16. Comit de Expertos de la OMS en Especificaciones para las Preparaciones
Farmacuticas. Validacin de los procedimientos analticos empleados en el examen
de los materiales farmacuticos. Serie de Informes Tcnicos No 823 Anexo 5, OMS
Ginebra, 1992.
17. Comit de Expertos de la OMS en Especificaciones para las Preparaciones
Farmacuticas. Prcticas adecuadas para la fabricacin de productos farmacuticos.
Serie de Informes Tcnicos No 823 Anexo 1, OMS Ginebra, 1992.
18. Commission of the European Comunities. Analytical Validation (July 1989). Guidelines
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Governing Medicinal Products in the European Community, Volume III (addendum July
1990)

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19. Canada, Drugs Directorate Guidelines. Acceptable Methods. Health Protection Branch,
Health Canada, 1994.
20. Hendriksen CFM et al. Alternatives to animal testing in the quality control of
immunobiologicals: current status and future prospects. The report and
recommendations of ECVAM workshop 4. ATLA 1994; 22: 420-434.
21. Sesardic D. Requirements for valid alternative assays for testing of biological
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22. Hendriksen CFM et al. Validation of Alternative Methods for the Potency Testing of
Vaccines. The report and recommendations of ECVAM workshop 31. ATLA 2001; 26:
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23. Balls M et al. Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. The report
and recommendations of ECVAM workshop 5. ATLA 1995; 23: 129-147.
24. Balls M y Karcher W. The validation of alternative test methods. ATLA 1995; 23: 884886.
25. Fentem J y Balls M. The ECVAM approach to validation. In Animal Alternatives,
Welfare and Ethics (ed. LFM van Zutphen and M Balls): 1083-1089. Amsterdam, The
Netherlands: Elsevier.
26. Curren RD et al. The role of prevalidation in the development, validation and
acceptance of alternative methods. ATLA 1995; 23: 211-217.
27. Balls M et al. Report and recommendations of the CAAT/ERGATT workshop on the
validation of toxicity test procedures. ATLA 1990; 18: 313-337.
28. Fentem JH et al. Validation: lesson learned from practical experience. Toxicology in
Vitro 1995; 9: 857-862.
29. Council of Europe. Analytical Validation. In PharmeuropaTechnical Guide 1996: 28-40.
Strasbourg France: Council of Europe.
30. ICH. Validation of Analytical Methods: Definitions and Technology 1995. ICH Topic Q
2A (CPMP/ICH/381/95). London, UK: ICH.
31. Griffiths E. Assuring the quality of vaccines: regulatory requirements for licensing and
batch release. In Methods in Molecular Medicine: Vaccine Protocols (ed. A Robinson,
G Farrar and C Wiblin). Totowa, NJ, USA: Humana Press 1996: 269-288.
32. Finney DJ. Control Charts. In Statistical Method in Biological Assay 1964. London, UK:
Charles Griffin and Company Limited: 161-162.
33. Anon. Minitab Statistical Software Release 8. QC Supplement: Quality Control and
Improvement 1991. Rosemont, PA, USA: Quickset: 21.15-21.20.
34. Ferguson M et al. Conferencias Magistrales del II Curso de la Red Global de
Entrenamiento de OMS Implementacin de un Sistema de Calidad en Laboratorios
Nacionales de Control 1998.
35. WHO. Supplementary Guidelines on GMP: Validation. 2003.
36. G-ENAC-04. Gua para la acreditacin Laboratorios que realizan anlisis
microbiolgicos. Marzo 1997.
37. NC 376:2004 Terminologa sobre Laboratorios Clnicos y Diagnosticadores.

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ANEXO 1
Validacin de mtodos microbiolgicos
1. Los principios generales de esta regulacin relativos a la organizacin del proceso de
validacin / estandarizacin, la caracterizacin de los mtodos, su seleccin, la
extensin de la validacin y el cumplimiento de BP, resultan perfectamente aplicables
a los ensayos microbiolgicos.
1.1

Los aspectos contemplados en el Apartado 4 (Diseo del estudio de validacin)

pueden tener una aplicabilidad ms limitada, aunque se recomienda su consulta
rigurosa durante la planificacin de la estandarizacin/validacin de los mtodos
analticos microbiolgicos.

2. En la validacin de los mtodos microbiolgicos cualitativos se evaluar, cuando sea

apropiado, la especificidad, el lmite de deteccin, el efecto matricial y las desviaciones
positiva y negativa.
3. La evaluacin de los ensayos cuantitativos incluir adems la determinacin de la
sensibilidad, el lmite de cuantificacin y la precisin.
3.1

En el caso de la precisin, podr analizarse una misma muestra en ensayos

sucesivos (de 6 a 10 ensayos) cambiando los materiales, reactivos y los analistas.

3.2

La evaluacin de la exactitud resulta en ocasiones difcil tomando en consideracin

la dificultad de preparar suspensiones microbianas estables en el tiempo para
estudios de recobrado. No obstante, si las condiciones analticas lo permiten,
podrn introducirse muestras calibradas (por epifluorescencia u otro mtodo
adecuado) en la serie analtica.

4. Para ensayos microbiolgicos establecidos (normalizados y estandarizados) no se

requerir validacin sino evaluacin del desempeo, tomando en cuenta los siguientes
aspectos:
a) La utilizacin de cepas de referencia ser adecuada en funcin de garantizar la
trazabilidad.
b) Se requerir la evaluacin en el tiempo de parmetros de desempeo de los
medios de cultivo utilizados como el pH, la promocin de crecimiento y la
esterilidad.
c) Se garantizar la calificacin sistemtica de hornos y autoclaves, as como de las
incubadoras. Adems, se utilizarn indicadores qumicos y/o biolgicos que
aseguren la eficacia del funcionamiento de tales equipos.

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d) Se garantizar la calificacin sistemtica de gabinetes de seguridad biolgica as

como de reas limpias ( en los casos que proceda).
e) Se mantendrn rigurosos programas de limpieza e higienizacin de equipos y del
laboratorio en general.
f)

La cristalera ser sometida a una limpieza escrupulosa y se utilizarn indicadores

qumicos para asegurar la eficacia de este proceso.

5. Todos los datos de estandarizacin/ validacin sern adecuadamente registrados y

archivados.
6. Se realizar un monitoreo de los mtodos microbiolgicos a travs de procedimientos
de aseguramiento de la calidad de los resultados que incluyan la participacin en
estudios colaborativos y ensayos de aptitud, comparacin con mtodos alternativos o
ya establecidos y/o la insercin de muestras inoculadas.

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ANEXO 2
Validacin de mtodos alternativos
1. Los elementos descritos en esta regulacin son perfectamente aplicables a los
mtodos alternativos. El establecimiento de un mtodo alternativo contemplar su
validacin exhaustiva (segn se define en el Apartado 4 de la regulacin) y la
validacin de su correlacin con el ensayo normalizado o estandarizado de referencia
o con los resultados de la eficacia del producto (ensayos clnicos).
2. La validacin de un mtodo alternativo deber dividirse en 5 fases, como se describir
a continuacin:
a) Fase de desarrollo: Se definir el propsito, las necesidades, la aplicabilidad, la
necesidad de definir un procedimiento y un modelo predictivo para la interpretacin
de los resultados.
b) Fase de pre validacin: Se asegurar que cualquier mtodo incluido en un
estudio de validacin formal cumple con los criterios definidos para su inclusin en
l.
c) Validacin: Se implementar por la ejecucin de un estudio colaborativo a doble
ciego como base para evaluar si el ensayo es relevante y confiable para su
propsito especfico de acuerdo a los criterios de desempeo definidos.
d) Evaluacin independiente: Los resultados sern evaluados por paneles de
expertos que realizarn un anlisis exhaustivo de la relevancia del ensayo como
mtodo alternativo.
e) Progresin hacia la aceptacin reguladora: Contemplar la evaluacin por rganos
reguladores que decidirn su aceptacin o no como mtodo alternativo y
promovern su utilizacin a gran escala.
3. Los estudios de correlacin con respecto a ensayos normalizados o estandarizados de
referencia debern realizarse con no menos de 10 muestras (preferiblemente de
actividades o concentraciones diferentes) y por triplicado. Los coeficientes de
correlacin sern calculados y se implementarn pruebas de significacin apropiadas
para estimar el grado de correlacin entre los mtodos.
4. Una vez aceptado el mtodo alternativo, ste ser utilizado de forma paralela al
ensayo de referencia durante un tiempo (no menos de 10 ensayos), a menos que se
justifique su aplicacin oficial y sta sea aprobada por la Autoridad Reguladora de
Medicamentos.

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5. Todos los datos de estandarizacin/validacin sern adecuadamente registrados y

archivados.
6. Los mtodos alternativos sern igualmente monitoreados para asegurar su
desempeo, y sern revalidados segn se establece en 5.3, incluyendo nuevamente,
si procede, la correlacin con el ensayo de referencia.

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