Avances en el screening de Dioxinas y

PCBs en productos de la pesca

Dr. Gerardo Fernndez Martnez

U id d d
Unidad
de T
Tcnicas
i
C
Cromatogrficas
fi
- SAI

ESQUEMA
Qu queremos medir? Dioxinas, furanos y PCBs
A que nivel tenemos que medir? Aspectos legislativos
Metodologas generales. Son todas iguales?
Requisitos de un laboratorio de analisis de PCDD/F y
PCB
PCBs
Esquema de una metodologa de confirmacin
Nuevas metodologas: Dnde podemos actuar?
Nuevos mtodos de preparacin de muestras
Nuevos mtodos de determinacin
Conclusiones

Qu queremos medir? Dioxinas, furanos y PCBs

10

Cl

Cl

Cl

Cl

2,3,7,8 Tetraclorodibenzo-p-diossina

Cl

Cl

3
4

Cl

Cl

2,3,7,8 Tetraclorodibenzofurano

Qu queremos medir? Dioxinas

Dioxinas, furanos y PCBs
2,3,7,8--TCDF
2,3,7,8
1,2,3,7,8--PeCDF
1,2,3,7,8
2,3,4,7,8--PeCDF
2,3,4,7,8
1,2,3,4,7,8--HxCDF
1,2,3,4,7,8
1
1,2,3,6,7,8
1,2,3,6,7,82 3 6 7 8-HxCDF
H CDF

CB--77
CB
CB--81
CB
CB--126
CB
CB--169
CB
CB--123
CB

2,3,4,6,7,8--HxCDF
2,3,4,6,7,8
CB--118
CB
1,2,3,7,8,9--HxCDF
1,2,3,7,8,9
CB--114
CB
1,2,3,4,6,7,8, ,3, ,6, ,8-HpCDF
pC
1,2,3,4,6,7,8
1,2,3,4,7,8,9--HpCDF
1,2,3,4,7,8,9
OCDF
2,3,7,8--TCDD
2,3,7,8
1,2,3,7,8--PeCDD
1,2,3,7,8
1,2,3,4,7,8--HxCDD
1,2,3,4,7,8
1,2,3,6,7,8--HxCDD
1,2,3,6,7,8
1,2,3,7,8,9--HxCDD
1,2,3,7,8,9
1,2,3,4,6,7,8--HpCDD
1,2,3,4,6,7,8
OCDD

CB--105
CB
CB--167
CB
CB--156
CB
CB--157
CB
CB--189
CB

TEF
2,3,7,8--TCDF
2,3,7,8

0,1

1,2,3,7,8--PeCDF
1,2,3,7,8

0,05

2,3,4,7,82 3 4 7 82,3,4,7,8
8-PeCDF

05
0,5

1,2,3,4,7,8--HxCDF
1,2,3,4,7,8

0,1

1,2,3,6,7,8--HxCDF
1,2,3,6,7,8

0,1

2,3,4,6,7,8--HxCDF
2,3,4,6,7,8

0,1

1,2,3,7,8,9--HxCDF
1,2,3,7,8,9

0,1

TEQ
Q=

1,2,3,4,6,7,8--HpCDF
1,2,3,4,6,7,8

0,01

1,2,3,4,7,8,9--HpCDF
1,2,3,4,7,8,9

0,01

OCDF

0,0001

2,3,7,8--TCDD
2,3,7,8

1,2,3,7,8--PeCDD
1,2,3,7,8

1
1,2,3,4,7,8
1,2,3,4,7,82 3 4 7 8-HxCDD
H CDD

01
0,1

1,2,3,6,7,8--HxCDD
1,2,3,6,7,8

0,1

1,2,3,7,8,9--HxCDD
1,2,3,7,8,9

0,1

1,2,3,4,6,7,8--HpCDD
1,2,3,4,6,7,8

0,01

OCDD

TEF

0,0001

CB--77
CB

0,0001

CB--81
CB

0,0001

CB--126
CB

0,1

CB--169
CB

0,01

CB--123
CB

0,0001

CB--118
CB

0,0001

CB--114
CB

0,0005

CB--105
CB

0,0001

CB--167
CB

0 00001
0,00001

CB--156
CB

0,0005

CB--157
CB

0,0005

CB--189
CB

0 0001
0,0001

Ci x TEFi

A que nivel tenemos que medir? Aspectos legislativos

Sustancias txicas a niveles muy bajos (pg/g)
Necesidad de mtodos altamente selectivos y sensibles
En alimentacin el nivel a medir viene dado por la
normativa.
Alimentacin animal: Orden PRE/1809/2006
g
((CE)) N 1881/2006
/
Alimentacin humana: Reglamento

Metodologas
Mtodos US EPA 1613 y
1668
European Standard Method
EN 1948
1948--1/2/3

Mtodo de referencia GCGC-HRMS

EI--SIM modo
EI
Resolucin 10.000 (10%valle)

Tcnicas alternativas y complementarias

Mtodos qumicos
qumicos::

GCGC-Ion trap MS/MS

GC--TQ MS/MS
GC
GCxGC--ECD
GCxGC
GCxGC--TOF
GCxGC

bioensayo:
y :
Mtodos de bioensayo

DRDR-Calux assayy

Reglamento (CE) N 1883/2006

Requisitos que deben cumplir los laboratorios
Requisitos de aceptacin de los procedimientos
anliticos

Reglamento (CE) N 1883/2006

Requisitos que deben cumplir los laboratorios
- Los laboratorios deben demostrar la eficacia del mtodo
/ del nivel considerado
- Lmite de cuantificacin 1/5
- Medidas internas de control de calidad
p
den ejercicios
j
interlaboratorios
- Participacin
- Sistemas de gestin de calidad. Acreditacin

Reglamento (CE) N 1883/2006

Requisitos de aceptacin de los procedimientos
anliticos
liti
- Sensibilidad adecuada y lmites de deteccin bajos.
j
Orden de
pg
- Selectividad elevada (especificidad). Distincin de los
i
ismeros
t i
txicos
d los
de
l no txicos
t i
- Elevada exactitud y precisin
- Clasificacin
Cl ifi i de
d los
l mtodos
t d en confirmacin
fi
i y cribado
ib d

Metodologas
Mtodos US EPA 1613 y
1668
European Standard Method
EN 1948
1948--1/2/3

Mtodo
odo de referencia
e e e c a GC
GC--HRMS
S
EI--SIM modo
EI
Resolucin 10.000 (10%valle)

Tcnicas alternativas y complementarias

Mtodos qumicos:

GC
GC--Ion trap MS/MS
GC--TQ MS/MS
GC
GCxGC--ECD
GCxGC
GCxGC--TOF
GCxGC

y
Mtodos de bioensayo:

DRDR-Calux assayy

Mtodos de confirmacin
Ventajas
- Elevada sensibilidad compatible con la normativa
- Elevada selectividad y especificidad
- Minimizacin de falsos positivos y negativos
- Una vez implantada la metodologa. Elevada robusted

Inconvenientes
- Elevada inversin
- Alta cualificacin del personal
- Alto mantenimiento
- mayor tiempo de anlisis?

Mtodos de cribado
Ventajas
- Menor coste
- Menor cualificacin del personal
- Herramienta til para el cribado de negativos

Inconvenientes
Limitada sensibilidad no siempre compatible con la normativa
- baja selectividad y especificidad
- Elevado nmero de falsos positivos
- Buenos resultados dependientes del estado de instrumental
- No necesariamente mayor rapidez

Reglamento (CE) N 1883/2006

Requisitos de los mtodos de confirmacin
- Utilizacin de patrones marcados isotpicamente
- Realizacin de controles de recuperacin
- Verificacin de la correcta separacin cromatogrfica de
congneres e interferencias
- Realizacin de la determinacin conforme a mtodo EPA 1613
o similar

PCDDs/Fs
/ y PCBs
Productos de la pesca
Muestra
PCDDF y PCB LCS

Extraccin soxhlet
Ataque cido
Clean-up
Clean
up automtico
Concentracin
PCDDF y PCB ISS

HRGC-HRMS

PCDDs/Fs
/ y PCBs
Preparacin de muestras y Extraccin
soxhlet

HOMOGEINIZACIN Y
PREPARACIN DE
MUESTRA

Patrones 13C12

Reposo 3 horas

EXTRACCIN TOLUENO
8 HORAS
BCHI 811

PCDDs/Fs
/ y PCBs
Muestras grasas: Ataque cido
Cambio de disolvente
tolueno-hexano
tolueno
hexano

Disolucin en hexano

Ataque con cido sulfrico

2 X 100 mL
Concentracin
Clean-up

PCDDs/Fs
/ y PCBs
CLEAN UP
Eluato en hexano
12 mL

FMS
POWER-PREP

Slice multicapa
p
Almina bsica
Carbn px-21
Hexano
DCM/Hexano 2%
DCM/Hexano 50%
A OEt/T l
AcOEt/Tolueno
50%
Tolueno
Frac. Tolueno
l
Non-ortho PCBs
PCDD/Fs

Frac. DCM/Hexano
Mono-ortho PCBs

PCDDs/Fs y PCBs
ANLISIS INSTRUMENTAL
Extracto a sequedad
F
Frac.
tolueno
l

THERMO FINNIGAN
MAT 95 XP

Extracto a sequedad
F
Frac.
tolueno
l
y
DCM/Hex

EPA1613 ISS
EPA1613-ISS
+
nonano

EPA1668 ISS
EPA1668-ISS
+
nonano

HRGC:DB5 MS
HRGC:DB5-MS
60 m x 0,25 mm
x 0,1 um

HRGC:RTX 2330
60 m x 0,25 mm x
0,1 um

HRGC: MID
R= 10000

HRGC: MID
R= 10000

SCREENING:?Donde podemos actuar?

TIEMPO

COSTE

METODOS DE SCREENING
Mtodos qumicos: GC
GC--Ion trap MS/MS
GC--TQ MS/MS
GC
GC GC-ECD
GCxGCGCxGC
ECD
Preparacin de
muestra
GCxGC--TOF
GCxGC
Mtodos de bioensayo:

DR
DR--Calux assay
Mtodos ELISA

METODOS DE SCREENING
Requisitos de los mtodos de screening
- Debe ser lo suficientemente selectivos y sensibles en los niveles y
matrices legislados.
- Es necesario disponer y proporcionar informacin de los falsos
positivos y negativos en una amplia serie de datos.
- El porcentaje de falsos negativos debe ser inferior al 1%
- El porcentaje de falsos positivos debe ser lo suficientemente bajo
para resultar til
- Debern confirmarse mediante HRGC/HRMS todos los positivos y al
menos entre un 2-10% de las muestras negativas
- Segn la estrategia de anlisis del Reglamento (CE) 1883/2006
deberan confirmarse muestras cuyo EQT > 25% del limite

METODOS DE SCREENING: Bioensayo

Mtodo Calux: Chemical Activated LUciferase ggene eXpression.
PCDD, PCDF y PCB se unen a un receptor intracelular, conocido como
receptos aril hidrocarburos (Ah). La unin al receptor Ah es seguido por el
transporte del complejo PHAH-Ah complejo al ncleo de la clula y la
posterior unin a secuencias especficas en el ADN.
Estas
E
t secuencias
i especficas
fi
de
d ADN se denominan
d
i
elementos
l
t de
d respuesta
t
(ER). La unin del complejo qumico a los receptores de la RE activa la
expresin de genes asociados a RE. El impacto toxicolgico de las
sustancias qumicas se inicia con el cambio observado en la expresin
gnica.
En trminos finales se mide la actividad luminiscente de la enzima luciferasa
formando complejo con la luciferina por descarboxilacion oxidativa.

METODOS DE SCREENING: Bioensayo

Mtodo DR-Calux:

1. Toma de muestra
2. Extraccin de la muestra
3. Clean-up: Silica, Almina, Florisil
4. Cultivo celular
5. Crecimiento celular
6. Exposicin de las clulas a extractos
de muestra.
7. Adicin de luciferina y cuantificacin de la
actividad luminiscente de la luciferasa
8. Comparacion de curva de calibrado y
expresin de resultados : CALUX-EQT

METODOS DE SCREENING: Bioensayo

Mtodo DR-Calux: ejemplo
Aceite vegetal fabricacin de
piensos.30 muestras.
p
Buena correlacion con HRGC-HRMS

METODOS DE SCREENING: Bioensayo

Mtodo DR-Calux: ejemplo Aceite de pescado
2011/23856
J037

07/27/2011 04:04:52 PM

2011/23856

RT: 2 2.00 - 2 4.0 0 SM : 9 G

100

NL: 3 .13 E3
m/ z=
32 1.793 6 32 1.9 93 6 F: + c
EI SIM ms [
30 3.4 0-36 4 .4 8]
M S 2 011072 7C07

2 3.2 3

2 2 .11

Relative Abundance

80
2 2.2 2 22 .24

60

22 .3 5

40

EQT CALUX=
CALUX 3.25
3 25 pg/g
/
EQT HRGC-HRMS= 0.64 pg/g

22 .9 7
22 .74
2 2 .4 7

20

2 3.3 0

2 3.4 0

23 .65

23 .06
0
22 .0

22 .1

22 .2

22 .3

2 2 .4

2 2 .5

2 2.6

2 2.7

2 2.8

2 2.9

2 3.0
Time (min)

2 3.1

2 3.2

RT: 2 2.00 - 2 4.0 0 SM : 9 B

22 .10
100

Relative Ab
bundance

80

2 3.3

2 3.4

2 3.5

23 .6

23 .7

23 .8

23 .9

NL: 2 .29 E3

2 3.2 2

m/ z=
319.796 5319.9 96 5 F: + c EI
SIM ms [
30 3.4 0-36 4 .4 8]
M S 2 011072 7C07

2 2.2 3

60
2 2.36
2 36
40
22 .47

22 .96

2 2.73

20

22 .84

2 2.6 3
0
22 .0

22 .1

22 .2

22 .3

2 2 .4

2 2 .5

2 2.6

2 2.7

2 2.8

2 3.0
Time (min)

2 3.65

2 3.4 2

2 3.0 5
2 2.9

2 3.4 9 2 3.51
2 3.1

2 3.2

2 3.3

2 3.4

2 3.5

23 .70 2 3.75 2 3.84

23 .6

23 .7

23 .8

2 3.9 4
23 .9

RT: 2 2.00 - 2 4.0 0 SM : 9 B

NL: 5.71E5

22 .96

100

m/ z=
33 1.8 30 033 2.0 30 0 F: + c
EI SIM ms [
30 3.4 0-36 4 .4 8]
M S 2 011072 7C07

Relative Abun
ndance

80

60
2 3.4 0

40

20

0
22 .0

22 .07
22 .1

22 .21 2 2.2 8 22 .32

22 .2

22 .3

22 .44
2 2 .4

22 .59
2 2 .5

22 .72 2 2.76

2 2.6

2 2.7

2 3.2 5

2 2.8

2 2.9

2 3.0
Time (min)

2 3.1

2 3.2

23 .56
2 3.3

2 3.4

2 3.5

2 3.65

23 .6

23 .73
23 .7

23 .80

23 .88 2 3.9 1

23 .8

23 .9

RT: 2 2.00 - 2 4.0 0 SM : 9 B

NL:
7.06 E5

22 .96

100

m/ z=
3 3 3.83 3 93 3 4.03 3 9
MS
2 0 110 72 7C
07

Relative Abunda
ance

80

60
23 .40

40

20

0
22 .0

2 2.11 2 2.13
22 .1

2 2.2 8 22 .34 2 2.3 7 22 .42

2 2.2

2 2.3

2 2.4

2 2.54
22 .5

22 .63
22 .6

2 2.73
22 .7

22 .82
2 2 .8

23 .13
2 2.9

2 3.0
Time (min)

2 3.1

2 3.2 2
23 .2

23 .82 2 3.8 8

2 3.58 23 .61
23 .3

23 .4

2 3.5

2 3.6

2 3.7

23 .8

23 .9

2 3.9 6

METODOS DE SCREENING: Bioensayo

Mtodo ELISA: Enzime-Linked Inmunosorbent Assay
- Las dioxinas presentes en la muestra compiten
por el antgeno de recubrimiento (hapteno 2,
2 3,
3
7 Tricloro 8 carboxi dibenzo dioxina) por
los sitios activos en anticuerpos inmovilizados
- Despus de un lavado los compuestos no
unidos son eliminados
-La
L concentracin
i de
d dioxinas
di i
es inversamente
i
proporcional al color producido
- La obtencin del EQT se realiza por
comparacin con una curva de calibracin en
EQT

METODOS DE SCREENING: Bioensayo

E t
Extraccin
i

)
Clean-up

Obtencin de EQT

ELISA

METODOS DE SCREENING: Bioensayo

Caractersticas

- Elevada rapidez
rapidez. Placas de 96 platos simultaneos
- Menor necesidad de purificacin. Aunque los resultados pueden ser
fuertemente dependientes del mismo
- Elevada sensibilidad. Uso de reducido tamao de muestra
- Estudio directo de la toxicidad de la muestra
- Coste reducido. Sobre un 50-60% del mtodo de confirmacin
- Selectividad comprometida. Depende del perfil de contaminacin.
Posibilidad de falsos positivos
- No siempre se utilizan con rigor
- No proporcionan perfil de congneres. Difcil saber el origen de al
contaminacin

METODOS DE SCREENING

Mtodos qumicos: GC
GC--Ion trap MS/MS
GC--TQ MS/MS
GC
GCxGC--ECD
GCxGC
Preparacin de
muestra
GCxGC--TOF
GCxGC

Extraccin
Purificacin
Automatizacin

METODOS DE SCREENING: Qumicos

Extraccin: PLE (pressurized liquid extraction)
1. Extraccin
disolventes

con
a

elevadas

temperaturas y presiones
2. Uso de disolventes de
muy diferente polaridad y
en poco volumen
Extraccin soxhlet
4 muestras 8-12 h

Extraccin PLE
12 muestras 2 h

3. Permite incluir una etapa

de purificacin dentro de
la extraccin

METODOS DE SCREENING: Qumicos

Extraccin: PLE (pressurized liquid extraction)

Solucin total: extraccin purificacin - concentracin

5 muestras: 4 h a falta del anlisis
5 muestras: 2 dias. Resultados finales
Problema: Coste elevado

METODOS DE SCREENING: Qumicos

Q
Extraccin: MSPD

S INSTRUMENTAL
SIN
S U
FACIL PARA CUALUIER
LABORATORIO

(Matrix Solid Phase Disperssion)

1. Matriz disgregada con un

agente dispersante
2. Extraccin esttica y
dinmica
con
el
disolvente adecuado
3. Permite incluir una etapa
de purificacin y elucin
d interferencias.
de
i t f
i
4. Uso
combinado
de
diferentes adsorbentes:
biobeads silica,
biobeads,
silica almina,
almina
carbon .
5. Dificultad para un cleanup fino de las sustancias
planas: necesidad de otra
etapa

METODOS DE SCREENING: Qumicos

Q
Extraccin: MSPD

(Matrix Solid Phase Disperssion)

Una posible aplicacin: Diseo de un kit basado en QuEChErs
Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe
Extraccin y purificacin
gruesa: grasas
Aislamiento de PCBs y DIOX
Clean-up final
S INSTRUMENTAL
SIN
S U
FACIL PARA CUALUIER
LABORATORIO

MIPs
MEPS

METODOS DE SCREENING: Qumicos

Q
PURIFICACION:

Polmeros de Impresin Molecular

- Preparacin
p
de un p
polmero altamente entrecruzado
en presencia del analito (plantilla) para el cual se desea
el reconocimiento selectivo.
- Se pone inicialmente en contacto el analito con un
monmero adecuado con el fin de formar un complejo
p j
de pre-polimerizacin.
- Posteriormente se le aade el entrecruzante, el
iniciador y el disolvente en el que se lleva a cabo la
polimerizacin (p
p
(porogen).
g )
- Una vez obtenido el polmero, se extrae el analito
plantilla, liberando los sitios de reconocimiento
especfico.
- La p
plantilla p
puede ser el p
propio
p analito (p
(posibles
problemas de fondo) o molculas de estructura similar.
- Se pueden preparar estructuras solo para TCDD
(como representante de EQT) o todos los congneres.
- Necesario calibrar p
para cada matriz.

METODOS DE SCREENING: Qumicos

Q
PURIFICACION:

MicroExtraction by Packed Sorbent

METODOS DE SCREENING: Qumicos

Q
ANALISIS
GC--Ion trap MS/MS:
GC

GC--Triple cuadrupolo
GC
MS/MS:

C t moderado
d d
- Coste
- Sensibilidad aceptable
- Selectividad moderada
- Resolucin baja
- Robustez baja
j
- Coste medio
- Sensibilidad buena
- Selectividad moderada
- Resolucin 0.7 amu
- Robustez alta
- rapidez elevada

CONCLUSIONES
1 Los mtodos de screening resultan un herramienta til para la
1.
obtencin de manera rpida y asequible de un gran numero de
datos sobre los niveles de dioxinas y PCBs. Son muy tiles en las
crisis.
crisis
2. De manera rutinaria deben de ser usados con responsabilidad. Lo
mejor son programas combinados con HRGCHRGC-HRMS.
3. Deben investigarse a fondo y validarse par cada matriz. Conocer el
perfil de congneres y evitar falsos negativos y positivos.
4 Muchos
4.
M h d
de llos elementos
l
t d
de llos mtodos
t d d
de screening
i sirven
i
para
hacer tambin mas rpidos los mtodos de confirmacin.
5. Adems de las metodologas,
g , es necesaria la inversin en p
personal
cualificado

AGRADECIMIENTOS

MUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIN
PERSONAL DE LA UTC

CONSUELO LPEZ BOLAO

PAULA MARTNEZ TOJEIRO
CRISTINA MONTOIORO PEREIRO
VERONICA FERNANDEZ-VILLARRENAGA