UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

Bioadsorción de metales pesados mediante

biomasa de Saccharomyces sp. Extraída de
aguas residuales de una cervecería local.

INTEGRANTES:
Erika Chicaiza
Wilson Chicaiza
Roberto Mena

1
Tabla de contenido:

OBJETIVOS: .......................................................................................................................................... 3
GENERAL:......................................................................................................................................... 3
ESPECÍFICOS: ................................................................................................................................... 3
PROBLEMÁTICA: .................................................................................................................................. 3
ANTECEDENTES: .................................................................................................................................. 3
JUSFITIFACIÓN: .................................................................................................................................... 4
MARCO TEÓRICO:................................................................................................................................ 4
Los metales pesados: ...................................................................................................................... 5
Bioadsorción:................................................................................................................................... 6
MARCO METODOLÓGICO: ................................................................................................................ 10
METODOLOGÍA DE BIOADSORCIÓN .............................................................................................. 13
FACTIBILIDAD: ................................................................................................................................... 14
Bibliografía ........................................................................................................................................ 15

2
OBJETIVOS:

GENERAL:

Aislar una cepa capaz de adsorber metales procedentes de aguas residuales de una
industria cervecera mediante procesos de aislamiento.

ESPECÍFICOS:

Seleccionar cepas a una temperatura adecuada para inhibir el crecimiento de hongos y

bacterias.
Preservar una cepa de levadura capaz de adsorber metales pesados mediante crio
preservación.
Determinar las cantidades de biomasa necesarias para reducir los niveles de metales
pesados en función del tiempo mediante curvas de calibración.

PROBLEMÁTICA:

La contaminación por metales pesados se ha convertido en uno de los problemas ambientales más
graves hoy en día. La bioadsorción, con microorganismos, tales como bacterias, hongos, levaduras
y algas, es considerada como un costo-eficaz de la biotecnología en el tratamiento de aguas
residuales. Entre los bioadsorbentes prometedores para la eliminación de metales pesados,
investigados en las últimas décadas, Saccharomyces sp. ha recibido una creciente atención debido
a la naturaleza única, a pesar de su capacidad mediocre para la captación de metales en
comparación con otros hongos. S. cerevisiae es ampliamente utilizado en la producción
alimentaria y de bebidas, es fácil cultivar con baja economía. Es un producto que origina grandes
cantidades de desechos en la industria de la fermentación.

ANTECEDENTES:

Bibliográficamente (1) se ha determinado que los posibles microorganismos capaces de adsorber

metales son:

Biomasa Metales estudiados Estado Inmovilización

biológico
Bacterias
Bacillus sp. Cr, Cu, Fe, Pb Muerta Inmovilizada
Pseudomona Cu, Ni, U Ambos Libre
aeruginosa
Hongos filamentosos
Aspergillus niger Cd, Cu, Ni, Pb Ambos Libre

3
Aspergillus oryzae Cd, Cu, Pb, Zn Muerta Ambos
Levaduras
Saccharomyces sp. Ag, Au, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Hg, Ni, Pb, Muerta Ambos
Zn
Saccharomycetes Cd Muerta Inmovilizada
pombe

Por otro lado, las biomasas pueden ser utilizadas de formas diferentes: libres, en forma de
suspensiones dentro de soluciones metálicas y con agitación, o inmovilizadas, sobre algún tipo de
soporte. La utilización de un tipo u otro de biomasa depende principalmente del tipo de escala que
se esté utilizando.

Debido a la diversidad de adsorción de metales de la levadura Saccharomyces uvarun se ha elegido

a ésta para el estudio en cuestión.

JUSFITIFACIÓN:
Existen varios investigaciones (2) (3) (4) las cuales hablan sobre la bioadsorción de metales en
varios tipos de microorganismos; siendo la mayoría de ellos estudios con hongos y algas; y muy
pocos con bacterias o levaduras

Dentro del distrito metropolitano de Quito la ordenanza municipal de medio ambiente 003 expone
los siguientes límites como parámetros para el funcionamiento de cualquier empresa.

Límites máximos por cuerpo receptor (5)

Parámetros Expresado como Unidad Límite máximo permisible

Alcantarillado Cauce de agua
Aluminio Al mg/l 5,0 5,0
Arsénico total As mg/l 0,1 0,1
Cadmio Cd mg/l 0,02 0,02
Cobre Cu mg/l 1,0 1,0
+6
Cromo Hexavalente Cr mg/l 0,5 0,5
Manganeso Mn mg/l 10,0 2,0
Mercurio (total) Hg mg/l 0,01 0,005
Níquel Ni mg/l 2,0 2,0
Plomo Pb mg/l 0,5 0,2
Zinc Zn mg/l 2,0 2,0

Debido a lo expuesto, se aplicará este proyecto como medida de biorremediación especialmente

en aguas residuales que excedan los límites citados como florícolas, textileras, basándonos en los
metales que exigen la ordenanza.

MARCO TEÓRICO:
El problema de la contaminación de las aguas es, sin duda, uno de los aspectos más preocupantes
de la degradación de los medios naturales por parte de la civilización contemporánea. En este

4
sentido, es especialmente importante la contaminación producida por metales pesados, debido a
su elevada toxicidad y a su alta capacidad de permanencia en los medios y de acumulación en
organismos vivos. A causa al crecimiento exponencial de la población mundial, la necesidad de
controlar las emisiones de estos metales al medio ambiente es cada vez más importante.

Los metales pesados, no se eliminan de los ecosistemas acuáticos por procesos naturales debido a
que no son biodegradables por lo cual permanecen de manera indefinida por cientos de años. Son
muy tóxicos y contaminantes y sufren un ciclo eco-biológico, donde las aguas naturales son el
principal camino. Hoy en día los metales pesados tienen un gran significado como indicadores de
la calidad ecológica de todo flujo de agua debido a su toxicidad y muy especialmente al
comportamiento bio-acumulativo. (Moalla, 2006).

La búsqueda de métodos de eliminación de metales que sean económicos y efectivos, ha llevado

al desarrollo de nuevas tecnologías de separación basadas en la reutilización de compuestos
orgánicos: éste es el caso de la bioadsorción. Con esta motivación, se realiza el presente proyecto
cuyo fin es facilitar la monitorización y el estudio del proceso, y así ayudar en el avance de las
investigaciones en este campo.

Los metales pesados:

Los metales pesados son sustancias tóxicas capaces de causar graves daños en los organismos
vivos. Una de sus principales propiedades es que no son biodegradables y permanecen durante
mucho tiempo en el entorno, circulando y acumulándose en el medio y en los seres vivos, por lo
que es necesario evitar su incorporación al entorno a través de vertidos contaminados.

Además, los metales pesados se acumulan en los tejidos a través de la cadena alimenticia, la cual
tiene a los seres humanos como último destino. El peligro se multiplica y las personas tienden a
sufrir sus efectos pudiendo padecer problemas de salud (SCIELO, 2004).

De entre los distintos metales tóxicos, se pueden diferenciar siendo especialmente importantes:
As, Cd, Cu, Sb, Se, Zn, Cr, Hg, Ni y Pb, los cuales tienen gran significado como indicadores de la
calidad ecológica de cualquier flujo de agua. La Figura siguiente muestra la relación entre algunos
metales, entre ellos el cobre, y su origen antropogénico.

5
Existen principalmente tres vías de entrada de metales pesados:

 Vía atmosférica, debido a la sedimentación de partículas emitidas a la atmósfera por

procesos naturales o antropogénicos (principalmente combustión de fósiles y procesos de
fundición de metales)
 Vía terrestre, producto de filtraciones de vertidos, de la escorrentía superficial en terrenos
contaminados (minas, utilización de lodos como abono, lixiviación de residuos sólidos,
precipitación atmosférica, etc.) y otras causas naturales.
 Vía directa, como consecuencia de los vertidos directos de aguas residuales y urbanas a los
cauces fluviales.

La necesidad de métodos de eliminación de metales que sean económicos y efectivos, ha llevado

al desarrollo de nuevas tecnologías de separación. Los métodos tradicionales son utilizados de
forma habitual en el tratamiento de efluentes industriales, pero su aplicación suele estar
restringida por razones técnicas o económicas (Amaya, 08). Este estudio de nuevas tecnologías ha
dirigido su atención hacia la bioadsorción.

Bioadsorción:

El proceso de bioadsorción puede ser definido como la captación de contaminantes presentes en

una solución acuosa por un material biológico, a través de mecanismos fisicoquímicos o
metabólicos. Esto es debido a que, como los metales pesados pueden llegar a tener efectos letales
en la biomasa viva, ésta tiene la capacidad de poner en funcionamiento ciertos mecanismos para
contrarrestarlos. Los dos mecanismos diferenciados para la captación de los metales pesados por
parte de la biomasa son: (Moalla, 2006)

6
Ventajas y desventajas entre bioadsorción y bioaculación;

Debido a lo expuesto anteriormente en proyecto se enfocará a la Bioadsorción de metales

pesados mediante una cepa de Saccharomyces sp.

7
Los métodos que existen para la eliminación de metales es necesario realizar una comparación
entre ellos para conocer sus ventajas y desventajas:

8
Algunos de estos métodos, como la osmosis inversa o los tratamientos electroquímicos, pierden
efectividad cuando las concentraciones son bajas. En estos casos, se suele utilizar el intercambio
iónico o la adsorción; pero el mecanismo de bioadsorción presenta ciertas ventajas que se hacen
evidentes en comparación con los métodos tradicionales:

1. Permite el uso de materiales renovables que pueden ser producidos a bajo coste.
2. Tienen alta capacidad para acumular iones metálicos de manera eficaz y rápida.
3. Capacidad de tratar grandes volúmenes de agua contaminada debido a la rapidez del
proceso.
4. Alta selectividad en relación a metales específicos.
5. Capacidad de manipular varios metales pesados y mezclas de residuos.
6. Gran reducción en el volumen de los residuos peligrosos producidos.
7. Bajo capital invertido.
8. Actúa bajo un amplio rango de condiciones fisicoquímicas incluyendo temperatura, pH y
presencia de otros iones.

Biorremediación:

Es el empleo de microorganismos, enzimas o plantas para la depuración de poluciones en distintos

ambientes, y a la biodegradación como transformación parcial de poluciones por agentes
biológicos como microorganismos.

Se considera biorremediación de metales pesados a los procesos de eliminación de metales

tóxicos desde los efluentes, utilizando para lograr dicho objetivo, materiales de origen biológico

GRUPO TRÓFICO:

9
La levadura Saccharomyces uvarun pertenece al grupo trófico de quimioorganotrofo debido a que
degrada sustancias orgánicas.

MARCO METODOLÓGICO:

MEDIO DE CULTIVO:

De acuerdo a la investigación realizada se determinó que las variables de mayor importancia en el

proceso de bioadsorción son: el pH, las concentraciones iniciales de metales como variables
independientes y el estado de la biomasa como variable dependiente (1).

PREPARACIÓN DE MUESTRAS:

Las muestras serán tomadas de las aguas residuales en frascos esterilizados; se comenzará con los
análisis lo más pronto posible.

Las muestras serán tomas del punto de descarga de las aguas hacia el alcantarillado durante el
mayor caudal de descarga para tener una mayor probabilidad de la obtención de muestra
homogénea.

AISLAMIENTO DE LAVADURAS (medios pre fabricados):

De las muestras tomadas, una vez homogenizadas, se tomará una muestra de un mililitro
aproximadamente y se procederá a realizar siembras en 3 medios (MEA, YGC y ASG) los cuales
deberán ser incubados por 3 días a 25°C a 25±2°C. Finalizado este período se procederá a
examinar macro y microscópicamente las colonias desarrolladas. Seguidamente se procederá al
aislamiento de colonias representativas hasta poder obtener cepas puras.

10
 Muestra de Agua residual

El fundamento de este método consiste en la aplicación de factores ecológicos como lo son pH,
Temperatura, degradación favorable de un determinado sustrato, acción de antibióticos, etc., los
cuales ayudan a que los medios de cultivo se vuelvan específicos y nos permitan de esta forma
aislar, conservar y preservar una cepa de levadura la cual será de beneficio para el proyecto.

CARACTERIZACIÓN DE LEVADURAS:

Para la caracterización de las levaduras se procederá a distinguirla mediante los siguientes

métodos: ANEXO 1

1. Microscópicamente: determinación de la morfología de la levadura.

2. Macroscópicamente:
2.1. Poder fermentativo: Mediante el método de la campana de Durham.
2.2. Crecimiento en agar glucosa nitrato: después de 3 días a 25°C se podrá determinar la
habilidad de utilizar nitrato como única fuente de nitrógeno.

11
 2.3. Crecimiento en agar MEC: de 3 días a 25°C se observar la macro y micro morfología de las
levaduras.

CONSERVACIÓN DE CEPAS:

Una vez seleccionadas y aisladas las cepas elegidas se las debe sembrará en agar GYM (debido a
que la glucosa es una sola fuente de carbohidratos; con lo que se reduce el riesgo de posibles
mutaciones) de donde se tomarán pequeñas perlas de agar para poder colocarlas en crio viales
inmersas en aceite mineral estéril conservadas con una temperatura de 4°C; con lo que la cepa se
mantendrá por un período de 15 años. (6)

De la cepa aislada se procede a tomar La muestra de agar colocarla en un tubo

una muestra con aceite estéril par su crio preservación

PRODUCCIÓN DE BIOMASA: (Crecimiento en Cultivo Cerrado con Agitación Orbital)

En matraces de 250 ml de capacidad, se deberán llenar con 150 ml del medio de cultivo, el medio
debe ser esterilizado; las condiciones del Shaker deben ser 800 r.p.m a 30°C para tener un buen
desarrollo del microorganismo.

Para la determinación de biomasa se sembrarán diluciones desde 10-3 hasta 10-8 y se incubarán a
30ºC ± 2 durante 72 h. Y también se podrá determinar las concentraciones de biomasa mediante
peso seco (que es la técnica requerida para la obtención de biomasa que será tratada para la
aplicación del proyecto)

METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN DE BIOMASA:

Serán utilizados diferentes técnicas para determinar el crecimiento celular según los
requerimientos de cada ensayo.

TurbidimetrÍa: En algunas ocasiones el crecimiento de los cultivos de s. cerevisiae se ha

determinado mediante la evaluación de la turbidez de los mismos, realizándose una lectura de sus
absorbancias a 600 nm (A600nm) en un espectrofotómetro utilizando cubetas de 1 ml con un paso
óptico de 1 cm. convenientemente hasta que su absorbancia se encontrara en un intervalo de
0,05-0,5, valores a los que existe una linealidad entre la lectura de la absorbancia y el número de
células.

12
Recuento de células en cámara de Neubaner: Cuantificación de la concentración celular de S.
cerevisiae mediante la observación directa en un microscopio. Con objeto de que la muestra sea
estadísticamente significativa, el número de células por cuadrado.

Recuento de colonias: Se sembrarán en cajas Petri de 50 a 100 unidades formadoras de colonias

(ufc) del cultivo analizado, y se incubarán a una temperatura permisiva para las células. La
comparación entre el número de ufc sembradas y las colonias crecidas permitía calcular la
mortalidad del cultivo.

Debido a que se requiere reportar datos de células/g se tomará como método de cuantificación de
biomasa al recuento de células en la cámara de Neubauer.

METODOLOGÍA DE BIOADSORCIÓN (7):

Materiales:

Para este estudio se utilizará Saccharomyces uvarun, levadura residual de una empresa local,
subproducto del proceso de fermentación de cerveza.

Preparación de la Biomasa

Se prepararán suspensiones de biomasa. Estas suspensiones de biomasa se agregaran a las

diferentes soluciones con las que comprobará cuales son los metales en los que se tiene más
adsorción, y en las cantidades (g peso seco/L) requeridas. Una vez determinado las cantidades de
adsorción se realizará en aguas residuales las cuales se conozcan que excedan los niveles de
metales permitidos.

Preparación de las Soluciones de Metales

Las soluciones de metales se prepararon disolviendo las sales: CrCl3·6H2O, Pb (NO3)2, Cd (NO3)2,
cada una por separado en agua destilada des ionizada para generar soluciones stock, las cuales se
combinaron posteriormente en las proporciones adecuadas para obtener concentraciones de
50ppm y 80ppm respectivamente de cada metal en sistemas que contenían a los tres iones
metálicos. Se ajustó el pH de las soluciones a pH 3 y 5.

Diseño de Experimentos

De acuerdo a la literatura analizada (3) se determinó que las variables de mayor importancia en el
proceso de biosorción son: el pH, las concentraciones iniciales de metales y el tratamiento previo
de la biomasa.
Por lo que utilizará un pH de 3 y 5 debido a que en este rango se mantiene el punto isoeléctrico de
los metales; la concentración de las soluciones es de 50ppm y 80ppm para cada metal para los
niveles bajos y altos respectivamente; siendo la variable de respuesta el porcentaje de extracción.

Experimentos de Biosorción

Las pruebas de biosorción serán efectuadas colocando 150mL de la mezcla de soluciones (de
acuerdo al diseño de experimentos) en matraces Erlenmeyer de 250mL y agitando en una

13
incubadora con agitación a 150rpm a una temperatura constante de 30ºC por 24hr con lo que se
medirá el contenido de metales cada dos horas para poder comprobar que disminuye su
contenido.

Después de ese tiempo se tomaron muestras de 2mL de las suspensiones y se separará la biomasa
por centrifugación a filtración al vacío. Después de la filtración se toma 1mL del filtrado el cual se
diluye con agua des ionizada en una proporción de 1:25, la muestra es acidificada con ácido nítrico
concentrado para descartar el efecto de la precipitación y así asegurar que la lectura corresponda
a la bioadsorción por la levadura con lo que se determinará por Espectroscopia de absorción
atómica.

Una vez realizados los experimentos y determinadas las cantidades necesarias de biomasa
requeridas para la adsorción y los metales de mayor relevancia en la norma municipal (5) se
procederá a realizarlo en las aguas residuales de textileras donde su descargue por el uso al que
son sometidas contiene metales pesados.

FACTIBILIDAD:

Para la realización de este proyecto se contará con la disposición del equipo de absorción atómica
los días lunes, martes, jueves y viernes en lo que se podrá hacer las lecturas, por lo que se
programa su lectura con los cortes de luz; en el laboratorio de microbiología industrial se cuenta
con el material de vidrio adecuado, además de la infraestructura necesaria para ello, cabe recalcar
que los medios de cultivo y los reactivos necesario en la parte experimental del proyecto se
encuentran en existencia en el laboratorio.

14
Bibliografía
1. Rodriguez, M. Scielo. Efectos de las Condiciones de Operación Sobre la biosorción . [En línea] 08.
[Citado el: 11 de 11 de 09.] http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0718-
07642008000600006&lang=pt.
2. Amaya, M. Universidad de Sonora. [En línea] 05 de 08. [Citado el: 09 de 11 de 09.]
http://www.uaemex.mx/Red_Ambientales/docs/congresos/TLAXCALA%202009/REVISTA/contami
nacion/acervo/vol_24_3/2.pdf.
3. Lezcano, J. Universidad Complutense de Madrid. Efecto del pretramiento de la biomasa en la
bioadsorción de metales pesados. [En línea] 04 de 08. [Citado el: 06 de 11 de 09.]
http://eprints.ucm.es/8620/1/T30768.pdf.
4. SCIELO. Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología. [En línea] 01 de 2005. [Citado el:
09 de 10 de 2009.] http://www.scielo.org.ve/scielo.php?pid=S1315-
25562005000100007&script=sci_arttext.
5. Norma Técnica que regula los contaminates asociados a descargas líquidas industriales,
comerciales, y de servicios. Quito, Municipio Metropolitano. Quito : s.n., 2009. Resolución 003.
6. Villegas, J. PatentesOnline.com.mx. PROCESO DE PRODUCCION DE SACCHAROMYCES
CEREVISIAE BAJO CONDICIONES DE CULTIVO BIEN CARACTERIZADO. [En línea] 26 de 04 de 1995.
[Citado el: 21 de 11` de 2009.] http://www.patentesonline.com.mx/proceso-de-produccion-de-
candida-utilis-y-saccharomyces-cerevisiae-bajo-condiciones-12648.html.
7. Acosta, M. Scielo. [En línea] [Citado el: 09 de 11 de 09.]
http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=s0718-07642005000100003&script=sci_arttext.
8. Vullo, D. Universidad de Buenos Aires. Revista Qímica viva. [En línea] 12 de 11 de 03. [Citado el:
09 de 11 de 09.] http://redalyc.uaemex.mx/redalyc/pdf/863/86320303.pdf.
9. Sanchez, E. Universidad Autónoma de nuevo León. [En línea] 2008. [Citado el: 10 de 11 de 09.]
http://redalyc.uaemex.mx/redalyc/pdf/402/40211208.pdf.
10. Flores, V. Scielo Perú. [En línea] 2001. [Citado el: 10 de 11 de 2009.]
http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1561-08882001000100007.
11. Mossel, D A. Microbiología de los alimentos. segunda edición. Saragoza : Acribia S.A., 2003.
pág. 703.
12. REDALYC. REDALYC. Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y
Portugal. [En línea] 12 de 2006. [Citado el: 7 de 10 de 2009.]
http://redalyc.uaemex.mx/redalyc/src/inicio/ArtPdfRed.jsp?iCve=49911205#.
13. Merck. Registro de propiedad Industrial España. [En línea] [Citado el: 23 de 10 de 2009.]
http://www.espatentes.com/pdf/8300004_A1.pdf.
14. SCIELO. Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458. Biosorción de metales pesados en
aguas residuales mediante Pseudomonas sp. [En línea] 15 de 04 de 2004. [Citado el: 16 de 11 de
2009.] http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S0717-34582004000100006&script=sci_arttext.
15. Fernández, T. Dialnet. AISLAMIENTO Y EVALUACIÓN DE CEPAS TERMOTOLERANTES DE
Saccharomyces. [En línea] 28 de 10 de 2007. [Citado el: 20 de 11 de 2009.]
http://www.somenta.org/journal/index.php/Revista-cyta/article/view/36/39.

15
 ANEXO 1: Caracterización microbiológica de Levaduras
Crecimiento: C. C. C. C. C. K. T. C. R. S.
intermed famata lusitania pulcherrim guilliermon apiculata mucoide humicolu mucilaginos cerevisia
ia e a dii s a e
M.E.A. (UFC) Blancas, Blancas, Blancas. Blancas, Blancas, Pardas, Opacas, Blancas, Rojas, Blancas,
cremosas. brillantes. T, S (1) lobuladas. cremosas. opacas. rosa cremosas. brillantes. cremosas.
M.E.C. V, S (1) V (1) V, S (1) T (1) S (1) pálido. V (1) S (1) V, S (1)
V, s (1)
Morfología (células): Esféricas, Esféricas, Ovales Gemantes, 5 Apiculadas. Ovales, Esféricas, Elipsoidales, Esféricas
M.E.A. Esféricas. φ: 4 φ: 4 aisladas. μm Germinación gemantes 5 aisladas De a Gemantes
M.E.C. Gemantes μm (2). μm (2). Ovales en × 4 μm (2) Terminal Artrosporas. μm × 6 μm pares
Gemación Gemación racimos. Gemantes, (2)
irregular. multipolar turgentes Gemantes,
turgentes
Esporas: - - - - - - - - - +
A.A. - - - - - - - - -
A.G.
Pseudomicelio - - - + + (4) + (5) + (6) - + +
C.M.A.
Fermentación:
Glucosa + + + + d (7) + - - - +
Fructosa + + + + d (7) + - - - +
Sacarosa + + - - - - - - - +
Maltosa - - - - - - - - - +
Galactosa - - - - - - - - - +
Lactosa - - - - - - - - - -
Rafinosa
Asim.NO3 - d (7) - - - - - - - -
(1) V: velo; S: sedimento; T: turbidez; s: sedimento escaso. (2) Medidas obtenidas con micrómetro objetivo. (3) Asca con una ascospora. (4)
Pseudomicelio con blastosporos. (5)
Pseudomicelio. (6) Micelio verdadero. (7) Escasa fermentación.
M.E.A.: Agar extracto de malta. M.E.C.: Caldo extracto de malta. A.A.: Agar acetato de sodio. A.G.: Agar Gorodkowa. C.M.A.: Agar harina de maíz.

16
17