LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN SPORA

Senin, 9 Maret 2015

Kelompok IV
Senin, Pukul 13.00 16.00 WIB

Nama

NPM

Wilda Sholihaturrabiah

260110130159

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2015
Nilai

TTD

(Dhiya) (Emanuella) (Puspagita)

PEWARNAAN SPORA
1. Tujuan
Mengamati

endospora

bakteri

dengan

menggunakan

prosedur

pewarnaan spora (pewarnaan Klein). Memahami setiap langkah dan reaksireaksi kimia yang terjadi daam prosedur tersebut.
2. Prinsip

a. Pewarnaan Spora
Beberapa sel bakteri memiliki struktur yang aktif berupa sel vegetatif
dan struktur yang pasif yaitu spora. Spora selain merupakan struktur
yang inaktif juga dapat tahan terhadap kondisi yang kurang
menguntungkan bagi tumbuhan. Spora sepertinya halnya sel vegetatif
dapat diwarnai sehingga dapat diamati lebih seksama. Teknik
pewarnaannya adalah pewarnaan differensial, yaitu menggunakan lebih
dari pewarna, yang hasilnya dapat membedakan spora dari sel vegetatif.
b. Penetrasi zat warna
Penembusan zat warna ke dalam sel bakteri
c. Impermeabilitas Spora
Dinding spora bersifat impermeabel, tetapi zat-zat warna dapat diserap
kedalamnya dengan jalan memanaskan preparat. Sifat impermeabel ini
mencegah dekolorisasi spora oleh alkohol bila diperlakukan dalam
waktu yang sama seperti pada dekolorisasi sel-sel vegetatif
d. Teknik aseptis
Proses tanpa kontaminasi untuk menjamin preparasi bebas dari
mikroba kontaminan. Teknik aseptic digunakan sepanjang percobaan
berlangsung baik alat, bahan, lingkungan sekitar maupun praktikan.
Untuk alat dan bahan dapat diterapkan metode sterilisasi

3. Teori Dasar
Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa
karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun
biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam
keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud
dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat
pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998).
Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran,
bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat
pewarna khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul atau pun flagella, dan
hal-hal terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri
atas ion positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan
Whleer, 1998).
Langkah-langkah utama dalam persiapan spesimen mikroba untuk
pemeriksaan mikroskopik adalah (Pelczar, 1986) :
- Penempatan olesan atau lapisan spesimen pada kaca objek.
- Fiksasi olesan pada kaca objek.
- Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian
larutan pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial.
Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik
secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung
(melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan
untuk (Suriawiria, 1985) :
- Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi
fungi.

ataupun

- Memperjelas ukuran dan bentuk jasad

- Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam
jasad.
- Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat
fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui.
Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya,
tetapi sekali diwarnai, zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi
dasar dari metode pengecatan spora secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton
yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora, endospora diwarnai pertama
dengan malachite green dengan proses pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna
yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan
malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin.
Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda
pada sel vegetatifnya (Fardiaz, 1992).
Kondisi yang terus memburuk membuat endospora dibebaskan dari
degenerasi sel vegetatif dan menjadi sel independen yang disebut spora yang
diakibatkan komposisi lapisan kimia spora bersifat tahan terhadap efek-efek
merusak, misalnya pemanasan berkelebihan, pembekuan, radiasi, pengeringan, dan
agent kimia lainnya sehingga diperlukan pewarnaan khusus secara mikrobiologi
dan ketika kondisi lingkungan kembali normal, spora bebas kembali untuk aktif
secara metabolik dan sel vegetatif berkurang resisten melalui germinasi.
Sporogenesis dan germinasi tidak dimaksudkan untuk reproduksi tetapi hanya
mekanisme yang menjamin ketahanan sel dibawah kondisi lingkungan (Suriawiria,
2005).
Bakteri penghasil spora tahan terhadap pewarnaan. Oleh karena itu, setelah
diwarnai oleh suatu warna, misalnya malachite green, akan mengikat kuat senyawa
pewarna. Untuk pewarnaan selanjutnya, cat tersebut (misalnya safranin) sel spora
tidak dapat menerimanya karena sudah terikat dengan cat pertama. Akhirnya warna

bakteri spora adalah hijau. Bakteri yang tidak berspora cenderung tidak tahan
pengecatan karena hanya memiliki sel vegetatif. Saat diwarnai oleh malachite, sel
vegetatif dapat mengikat warna tetapi dapat luntur setelah dilunturkan karena
ikatannya tidak kuat. Setelah pewarnaan selanjutnya dengan safranin, sel vegetatif
mudah mengikat warna kembali. Oleh karena itu, hasil pewarnaan akhir adalah
merah muda dari safranin (Assani, 1994).
4. Alat dan Bahan
a. Alat
i. Bak pewarna

v. Kertas Saring

ii. Botol semprot

vi. Mikroskop

iii. Kaca obyek

vii. Ose

iv. Kapas

viii. Pembakar Spirtus

b. Bahan
i. Sampel Bacillus
subtilis

iv. H2SO4 1%

ii. Zat warna karbol

fukhsin
metilen blue

iii. NaCl fisiologis

dan

v. Alkohol 70%
vi. Air suling
vii. Minyak celup

c. Gambar Alat
Bak Pewarna

Botol Semprot

Kaca Obyek

Kapas

Kertas Saring

Mikroskop

Ose

Spirtus

5. Prosedur
Prosedur pertama yang dilakukan adalah pembuatan suspensi bakteri.
Suspensi bakteri dibuat terdiri dari biakan bakteri dan NaCl fisiologis yang
ditambah dengan pewarna karbol fukhsin dengan perbandingan 1:1 dalam
tabung reaksi. Campuran tersebut dipanaskan dalam pemanas air bersuhu 800C
selama 10 menit dan dijaga jangan sampai mendidih atau kering. Kemudian
kaca obyek yang bersih disediakan dan ditandai menggunakan spidol untuk
memperjelas daerah olesan. Suspensi bakteri diambil menggunakan ose dan
dioleskan pada kaca objek pada daerah yang telah ditandai. Penyiapan olesan
dilakukan secara aseptis. Olesan digenangi olesan H2S04 1% selama 2 detik,
lalu cuci dengan air suling. Kemudian olesan digenangi dengan pewarna
tandingan biru metilen selama 5 menit, zat warna yang berlebih dibuang dan
preparat dibilas dengan air suling, lalu dikeringkan dengan kertas saring. Pada
preparat diteteskan sedikit minyak imersi, lalu diamati di bawah mikroskop.
Pengamatan dimulai dengan obyektif berkekuatan terendah 10X, lalu ganti
dengan lensa obyektif berkekuatan 100X. Hasil pengamatan digambar dan
diberi keterangan.

6. Hasil Pengamatan

Bakteri Bacillus subtilis

7. Pembahasan
Praktikum kali ini bertujuan untuk mengamati endospora bakteri
dengan menggunakan prosedur pewarnaan spora (pewarnaan Klein).
Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi daam prosedur
tersebut. Dimana zat pewarna yang digunakan yaitu karbol fukhsin dan
pewarna tandingannya yaitu metilen blue.
Penyiapan suspensi bakteri dibuat dengan mencampurkan campuran
biakan bakteri Bacillus subtilis dan NaCl fisiologis dengan pewarna karbol
fukhsin dalam tabung reaksi dengan perbandingan 1:1. Perbandingan ini agar
seluruh bakteri dapat menyerap zat warna dengan baik. Setelah itu campuran

tersebut dipanaskan dengan suhu 80oC. Bakteri Bacillus subtilis merupakan

bakteri gram positif sehingga untuk mengidentifikasinya diperlukan pewarnaan
diferensial. Tetapi pewarnaan biasa saja tidak cukup untuk mengidentifikasi
B.subtilis yang memiliki endospora sehingga diperlukan pemanasan.
Pemanasan ini ditujukan untuk meningkatkan daya penetrasi bakteri terhadap
zat warna dengan cara membuka pori-pori bakteri karena bakteri berspora
mempunyai dinding yang tebal dan relatif sukar ditembus sehingga tidak
mudah diwarnai dengan teknik pewarnaan pada umumnya. Teknik pewarnaan
spora ini disebut juga sebagai pewarnaan khusus.
Selanjutnya dibuat olesan bakteri. Untuk membuat olesan bakteri,
disiapkan kaca obyek yang sebelumnya telah direndam dengan larutan etanol
agar bebas dari lemak. Kaca obyek kemudian dikeringkan dan bagian
bawahnya ditandai dengan spidol untuk membuat daerah pengolesan.
Selanjutnya, digunakan ose untuk memindahkan bakteri dari tabung reaksi ke
atas kaca obyek. Sebelum ose dicelupkan pada suspense bakteri, terlebih dahulu
ose disterilkan dengan cara memanaskan kawat ose dengan nyala api.
Tujuannya adalah agar tidak ada bakteri kontaminan yang berasal dari alat-alat
yang digunakan. Metode sterilisasi ini merupakan bagian dari teknik aseptis,
yaitu proses tanpa kontaminasi untuk menjamin preparasi bebas dari mikroba
kontaminan. Teknik ini diterapkan untuk seluruh alat dan bahan yang
digunakan dalam pembuatan preparasi. Setelah ose disterilkan, ose dibiarkan
mendingin dengan bantuan udara. Tujuan pendinginan ini adalah agar bakteri
yang nanti diambil dengan ose tidak mati karena suhu kawat yang terlalu panas.
Setelah ose dan kaca obyek siap digunakan, dibuat olesan suspensi
bakteri dengan mencelupkan ose pada sampel suspensi bakteri dan
mengoleskannya pada kaca obyek yang sebelumnya telah ditandai. Proses
pembuatan olesan selalu dilakukan di dekat api. Hal ini bertujuan untuk
mencegah adanya bakteri kontaminan selama proses tersebut. Olesan dibuat

tidak terlalu tebal agar bakteri tidak menumpuk dan agar lebih mudah
mengeringkannya.

Setelah

itu,

kaca

obyek

difiksasi

dengan

cara

melewatkannya di atas nyala api sekitar tiga kali. Kaca obyek hanya dilewatkan
agar bakteri pada olesan yang telah dibuat tidak mati karena suhu yang terlalu
panas. Tujuan dari fiksasi ini adalah pelekatan bakteri supaya pada saat
pembilasan, bakteri tersebut tidak ikut hilang terbawa air. Selain itu fiksasi juga
berfungsi untuk menonaktifkan enzim lytic sehingga bakteri tidak mengalami
lisis dan berubah bentuk pada saat diamati. Fiksasi dilakukan setelah olesan
pada kaca preparat sudah kering. Jika olesan belum kering akan menyebabkan
sel-sel mikroorganisme yang bersangkutan menjadi tidak beraturan bentuknya.
Setelah preparat difiksasi, preparat tersebut digenangi larutan H2SO4 1
% selama 2 detik. H2SO4 berperan untuk mengecilkan kembali pori-pori bakteri
agar saat pencucian pewarna fukhsin tetap terjerap dan tidak luntur. Dalam
penambahan H2SO4 ini tidak boleh terlalu lama atau terlalu banyak karena akan
mempengaruhi hasil pengamatan pada mikroskop. Selanjutnya preparat
digenangi pewarna metilen blue selama 5 menit. Metilen blue berperan sebagai
pewarna tandingan yang akan mewarnai badan vegetatif dari bakteri. Badan
vegetatif ini tidak dapat menahan pewarna utama karena ikatannya tidak kuat
sehingga ketika diwarnai dengan pewarna yang berbeda badan vegetatif
tersebut akan menyerap pewarna tandingan. Setelah 5 menit, pewarna yang
berlebih dibuang dan dibilas dengan air suling secara perlahan kemudian
dikeringkang menggunakan kertas saring.
Preparat yang sudah siap kemudian diamati dibawah mikroskop dan
dicari fokusnya secara perlahan. Pengamatan dilakukan dengan perbesaran
paling kecil yaitu 10X dan dicoba hingga perbesaran 100x.
Dalam percobaan ini, spora dari bakteri Bacillus subtilis tidak dapat
diamati. Hal ini dapat disebabkan oleh beberapa hal, pertama karena pewarna

fukhsin belum terpenetrasi dengan sempurna, kedua kurangnya pengocokkan

suspensi bakteri sehingga bisa saja bakteri yang terambil adalah bakteri yang
tidak menyerap pewarna fukhsin dengan sempurna. Penyebab lainnya yaitu
pemberian H2SO4 yang tidak tepat sehingga mempengaruhi pengamatan.
8. Kesimpulan
Endospora pada bakteri dapat diamati melalui pewarnaan spora
(pewarnaan Klein) tetapi hasil pengamatan dapat dipengaruhi oleh reaksi-reaksi
kimia yang dilibatkan seperti daya penetrasi zat warna.
9. Daftar Pustaka
Assani, S. 1994. Mikrobiologi Kedokteran. Fakultas Kedokteran Universitas
Indonesia,

Jakarta.

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Gramedia. Jakarta

Michael J. Pelczar & E.C.S. Chan, 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi Edisi 1
Jakarta :.Penerbit Universitas Indonesia (UI-Press)
Suriawiria, U. 1985. Pengantar Mikrobiologi Umum. Bandung : Penerbit
Angkasa.
Volk and Whleer, 1998. Mikrobiologi Dasar. Jakarta : Erlangga.

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN TAHAN ASAM

Senin, 9 Maret 2015

Kelompok IV
Senin, Pukul 13.00 16.00 WIB

Nama

NPM

Wilda Sholihaturrabiah

260110130159

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2015
Nilai

TTD

(Dhiya) (Emanuella) (Puspagita)

PEWARNAAN TAHAN ASAM

1. Tujuan
Mengamati dua kelompok bakteri, yaitu bakteri tahan asam, dengan
menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam (pewarnaan Zielh-Neelsen).
Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur
tersebut.
2. Prinsip

a. Pewarnaan Tahan Asam

Pewarnaan tahan asam adalah tipe pewarnaan diferensial lebih dari satu
warna untuk membedakan suatu mikroorganisme dengan kandungan
dinding sel peptidoglikan serta disusun lebih dari 60% lipid
kompleksyang tahan terhadap dekolorisasi dengan alkohol asam
b. Penetrasi Zat Warna
Penembusan zat warna ke dalam sel bakteri
c. Impermeabilitas Dinding Sel Bakteri Tahan Asam
Dinding sel hidrofobik dan impermeabel terhadap pewarnaan dan
bahankimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika proses
pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam
sehingga bakteritersebut sidebut bakteri tahan asam
d. Pemanasan
Pemansan pada bakteri tahan asam diperlukan untuk memuaikan
dinding sel bakteri agar zat warna dapat masuk ke dalam sel bakteri

3. Teori Dasar
Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya
sangat tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi

harus dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri
tahan asam (BTA) karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu
dicuci dengan larutan pemucat. Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen
pada

manusia

contohnya

adalahMycobacterium

tuberculosis.

Bakteri Mycobacterium tuberculosis dapat diisolasi dari sputum penderita

TBC. Reaksi hasil pewarnaannya jika positif terdapat bakteri TBC berwarna
merah. Selain menyerang manusia juga menyerang hewan seperti marmut, dan
kera. Penularannya dapat melalui udara yang masuk ke saluran pernafasan
(Pelczar dan Chan, 1988).
Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri
yaitu berantai karbon (C) yang panjangnya 8 - 95 dan memiliki dinding sel yang
tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa
mencapai 60% dari berat dinding sel. Bakteri yang termasuk BTA antara lain
Mycobacterium tuberculose, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae,
Nocandia

meningitidis,

dan

Nocandia

gonorrhoeae.

Mycobacterium

tuberculose adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan penyakit

tuberculose, dan bersifat tahan asam sehingga digolongkan sebagai bakteri
tahan asam (BTA). Penularan Mycobacterium tuberculose terjadi melalui jalan
pernafasan (Syahrurachman, 1994).
Bakteri tahan asam adalah bakteri yang mempertahankan zat warna
karbol-fuchsin (fuchsin basayang dilarutkan dalam suatu campuran phenolalkohol-air) meskipun dicuci dengan asam klorida dalam alkohol. Bakteri tahan
asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri yaitu berantai karbon
(C) yang panjangnya 8 - 95 dan memiliki dinding sel yang tebal yang terdiri
dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa mencapai 60%
dari berat dinding sel. Bakteri yang termasuk BTA antara lain Mycobacterium
tuberculose, Mycobacterium

bovis, Mycobacterium

leprae, Nocandia

meningitidis, dan Nocandia gonorrhoeae. Mycobacterium tuberculose adalah

bakteri patogen yang dapat menyebabkan penyakit tuberculose, dan bersifat

tahan asam sehingga digolongkan sebagai bakteri tahan asam (BTA). Penularan
Mycobacterium tuberculose terjadi melalui jalan pernafasan (Syahrurachman,
1994).
Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan
kelompok Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok
bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna
pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan pemucat (alkohol
asam). Larutan asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang
tidak tahan asam karena larutan pemucat (alkohol asam) akan melakukan reaksi
dengan carbol fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna (Lay,
1994).

4. Alat dan Bahan

a. Alat
i. Bak pewarna

v. Kertas Saring

ii. Botol semprot

vi. Mikroskop

iii. Kaca obyek

vii. Ose

iv. Kapas

viii. Pembakar Spirtus

b. Bahan
i. Suspensi bakteri
saprofit

metilen blue

alkohol

(3%HCl dalam

ii. Zat warna karbol

fukhsin

iii. Asam

dan

alkohol 95%)
iv. Alkohol 70%
v. Air suling
vi. Minyak celup

c. Gambar Alat
Bak Pewarna

Botol Semprot

Kaca Obyek

Kapas

Kertas Saring

Mikroskop

Ose

Spirtus

5. Prosedur
Suspensi bakteri Mycobacterium tuberculosis dibuat. Kaca obyek
disiapkan, lalu ditetesi alkohol 70% dan digosok dengan kapas hingga bebas
lemak. Buat daerah pengolesan pada kaca obyek dengan menggunakan spidol.
Olesan dibuat diatas kaca obyek dengan ose yang sudah disterilkan dengan api.
Kemudian preparat digenangi dengan pewarna karbol fuksin selama 5 menit,
sambil dipanaskan di atas penangas air. Preparat dijaga jangan sampai terlalu
panas, mendidih atau kering. Lalu, buang zat warna yang berlebih, dan preparat
dibilas dengan air suling. Preparat dibilas dengan zat pemucat alkohol asam
selama 15 detik atau sampai belakang olesan bewarna merah muda pucat.
Selanjutnya, preparat digenangi dengan pewarna tandingan biru metilen selama
2 menit, zat warna dibuang yang berlebih, lalu dibilas dengan air suling dan
dikeringkan dengan kertas saring. Minyak imersi diteteskan sebanyak 1 tetes
pada preparat, lalu pengamatan dilakukan dibawah mikroskop cahaya. Dimulai
dengan dengan perbesaran 10X, kemudian diganti dengan perbesaran 100X.
Hasilnya diamati dan digambar.

6. Hasil Pengamatan

Bakteri Mycobacterioum tuberculosis

7. Pembahasan
Praktikum kali ini bertujuan untuk mengamati dua kelompok bakteri,
yaitu bakteri tahan asam, dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan
asam (pewarnaan Zielh-Neelsen) dan memahami setiap langkah dan reaksireaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut. Dimana zat pewarna yang
digunakan yaitu karbol fukhsin dan pewarna tandingannya yaitu metilen blue.
Selanjutnya dibuat olesan bakteri. Untuk membuat olesan bakteri,
disiapkan kaca obyek yang sebelumnya telah direndam dengan larutan etanol
agar bebas dari lemak. Kaca obyek kemudian dikeringkan dan bagian
bawahnya ditandai dengan spidol untuk membuat daerah pengolesan.

Selanjutnya, digunakan ose untuk memindahkan bakteri dari tabung reaksi ke

atas kaca obyek. Sebelum ose dicelupkan pada suspense bakteri, terlebih dahulu
ose disterilkan dengan cara memanaskan kawat ose dengan nyala api.
Tujuannya adalah agar tidak ada bakteri kontaminan yang berasal dari alat-alat
yang digunakan. Metode sterilisasi ini merupakan bagian dari teknik aseptis,
yaitu proses tanpa kontaminasi untuk menjamin preparasi bebas dari mikroba
kontaminan. Teknik ini diterapkan untuk seluruh alat dan bahan yang
digunakan dalam pembuatan preparasi. Setelah ose disterilkan, ose dibiarkan
mendingin dengan bantuan udara. Tujuan pendinginan ini adalah agar bakteri
yang nanti diambil dengan ose tidak mati karena suhu kawat yang terlalu panas.
Setelah ose dan kaca obyek siap digunakan, dibuat olesan suspensi
bakteri dengan mencelupkan ose pada sampel suspensi bakteri dan
mengoleskannya pada kaca obyek yang sebelumnya telah ditandai. Proses
pembuatan olesan selalu dilakukan di dekat api. Hal ini bertujuan untuk
mencegah adanya bakteri kontaminan selama proses tersebut. Olesan dibuat
tidak terlalu tebal agar bakteri tidak menumpuk dan agar lebih mudah
mengeringkannya.

Setelah

itu,

kaca

obyek

difiksasi

dengan

cara

melewatkannya di atas nyala api sekitar tiga kali. Kaca obyek hanya dilewatkan
agar bakteri pada olesan yang telah dibuat tidak mati karena suhu yang terlalu
panas. Tujuan dari fiksasi ini adalah pelekatan bakteri supaya pada saat
pembilasan, bakteri tersebut tidak ikut hilang terbawa air. Selain itu fiksasi juga
berfungsi untuk menonaktifkan enzim lytic sehingga bakteri tidak mengalami
lisis dan berubah bentuk pada saat diamati. Fiksasi dilakukan setelah olesan
pada kaca preparat sudah kering. Jika olesan belum kering akan menyebabkan
sel-sel mikroorganisme yang bersangkutan menjadi tidak beraturan bentuknya.
Setelah preparat difiksasi, dilakukan proses pewarnaan. Untuk
menetukan sifat bakteri yang termasuk bakteri tahan asam dan bakteri tidak
tahan asam harus diwarnai dengan pewarnaan khusus. Preparat kemudian

digenangi dengan pewarna karbol fukhsin selama 5 menit sambil dipanaskan

diatas penangas air. Preparat dijaga agar tidak terlalu panas, mendidih atau
mengering. Pada umumnya, bakteri tahan asam merupakan bakteri yang lapisan
paling luar selnya terdiri dari lapisan lilin, sehingga menyebabkan zat warna
sukar masuk ke dalam sel bakteri sehingga untuk mewarnainya maka lapisan
lilin pada sel itu harus dihilangkan, yaitu dengan cara pemanasan yang
dimaksudkan supaya lilinnya meleleh, sehingga sel tersebut bisa dengan mudah
menerima zat warna. Karbol fukhsin, basa yang dilarutkan dalam suatu
campuran phenol-alkohol-air berperan sebagai pewarna utama (primary dye).
Pewarna berlebih dibuang kemudian dibilas dengan air suling secara peralahan.
Selanjutnya preparat dibilas dengan zat pemucat atau agen dekolorisasi asam
alkohol yang terdiri dari 3% asam klorida dan dan alkohol 95% selama 15 detik
sampai latar belakang olesan berwarna merah muda pucat. Selain sukar
menerima zat warna, bakteri tahan asam juga sukar menyerap bahan penghilang
zat warna (pencuci), sehingga walaupun dicuci dengan larutan asam alkohol
encer, sel bakteri ini akan tetap mengikat zat warna yang telah masuk dan tidak
terdekolorisasi.
Selanjutnya preparat digenangi pewarna metilen blue selama 2 menit.
Metilen blue berperan sebagai pewarna tandingan. Pewarna yang berlebih
dibilas dengan air suling secara perlahan dan kemudian dikeringkan dengan
kertas saring. Bakteri tahan asam akan mempertahankan warna merah dari
pewarna primer dan sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam karena
larutan pemucat (alkohol asam) akan melakukan reaksi dengan carbol fuchsin
dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna dan bakteri akan menyerap
pewarna tandingan yaitu pewarna metilen blue.
Preparat yang sudah siap kemudian diamati dibawah mikroskop dan
dicari fokusnya secara perlahan. Pengamatan dilakukan dengan perbesaran
paling kecil yaitu 10X dan dicoba hingga perbesaran 100x.

Dalam percobaan ini, perlakuan prosedural seperti yang tertera diatas

tidak dilakukan oleh praktikan karena bakteri yag digunakan terlalu beresiko.
8. Kesimpulan
Bakteri tahan asam dapat diidentifikasi melalui pewarnaan tahan asam
(pewarnaan Zielh-Neelsen) dan dapat dipahami melalui reaksi-reaksi kimia
yang terjadi, yaitu bakteri tahan asam dapat mempertahankan pewarna primer
walaupun telah dicuci dengan agen dekolorosisasi dalam hal ini adalah asam
alkohol. Sedangkan bakteri tidak tahan asam tidak dapat mempertahankan
warna primer dan akan terdekolorisasi oleh senyawa kimia asam alkohol dan
mudah menyerap pewarna tandingan.
9. Daftar Pustaka
Lay, B. W. (1994). Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga
Grafindo Persada.
Michael J. Pelczar & E.C.S. Chan, 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi Edisi 1
Jakarta :Penerbit Universitas Indonesia (UI-Press)
Syahrurachman, A,1994. Mikrobiologi Kedokteran, Edisi Revisi.Jakarta: Bina
Rupa Aksara