Anda di halaman 1dari 39

laporan praktikum HPLC

LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA INSTRUMEN


Penentuan Kadar Natrium Benzoat, Vitamin C, dan Kafein
Menggunakan Instrumen HPLC
Tanggal Praktikum : 28 September 2012

DOSEN PEMBIMBING :
Dra, SOJA SITI FATIMAH, Msi
DISUSUN OLEH :
KELOMPOK 11
HANIK MASFUFATUL 1001114
NOVI NURLAELI 1004563
VEGA ISMA ZAKIAH 1006336

JURUSAN PENDIDIKAN KIMIA


FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA
BANDUNG
2012

Tanggal Praktikum : 28 September 2012


Judul Praktikum :
Penentuan Kadar Natrium Benzoat, Vitamin C, dan Kafein Menggunakan Instrumen HPLC
Tujuan Praktikum :
1. Memahami cara kerja instrumen HPLC untuk analisis kuantitatif.
2. Dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat, serta dapat mengikuti manual
pengoperasian HPLC.
3. Dapat menentukan/menghitung kadar zat aditif dalam sampel minuman.

A. DASAR TEORI
Kromatografi adalah metode suatu proses fisik yang digunakan untuk memisahkan
komponen-komponen dari suatu campuran senyawa kimia. Dalam kromatografi, campuran
tersebut dibuat sebagi zona yang sempit (kecil) pada salah satu ujung media porus seperti
adsorben, yang disebut alas atau landasan kromatografi. Zona campuran kemudian digerakan
dengan larutan suatu cairan atau gas yang bergerak sebagai pembawa, melaui media porus
tersebut, yang berupa partikel-partikel yang diam (tidak bergerak, statisiones). Sehingga
akibatnya masing-masing komponen dari campuran tersebut akan terbagi (terdistribusi) secara
tidak merata antara alas yang diam dan cairan atau gas yang membawanya. Akibat selanjutnya,
masing-masing komponen akan bergerak (bermigrasi) pada kecepatan yang berbeda (differential
migration) dan dengan demikian, akan sampai pada ujung lain dari alas tersebut pada waktu yang
berlainan, dan dengan demikian terjadilah pemisahan diantara komponen-komponen yang ada.
(Bahti, Husein H. 2011: 4).
Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen campuran
yang berdasarkan distribusi diferensial dari komponen-komponen sampel diantara dua fasa, yaitu
fasa gerak dan fasa diam. Salah satu teknik kromatografi yang dimana fasa gerak dan fasa
diamnya menggunakan zat cair adalah HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau
didalam bahasa Indonesia disebut KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi).
Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan
baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kualitatif dengan teknik
HPLC didasarkan pada pengukuran luas area standar. Pada prakteknya, metode pembandingan
area standar dan sampel kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan suatu
konsentrasi standar. Oleh karena itu, dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi.
(Wiji, dkk. 2010 : 17).
HPLC yang modern telah mucul akibat pertemuan dari kebutuhan, keinginan manusia
untuk meminimalis pekerjaan, kemampuan teknologi, dan teori untuk memandu pengembangan
pada jalur yang rasional. Jelas sebelum era peralatan yang modern bahwa LC (Liquid
Chromatography) memiliki kekuatan pemisahan yang sangat ampuh, bahkan untuk komponenkomponen yang berhubungan sangat erat. LC harus ditingkatkan kecepatannya, diotomasasi, dan
harus disesuaikan dengan sampel-sampel yang lebih kecil, waktu elusi yang beberapa jam
(Underwood, Day. 2002 : 553).
HPLC berbeda dari kromatografi kolom cairan konvensional dalam hal digunakan bahan
pengisi kolom berupa partikel yang sangat kecil berukuran sampai 3-5 m (1m = 10 -6 m).
Sehingga mengharuskan digunakannya tekanan tinggi sampai 20.000 Kpa (
200 atmosfir)
untuk mengalirkan fasa gerak melalui kolom tersebut.
Ternyata, penggunaan bahan pengisi kolom yang lebih kecil ini bukan saja telah
memperbaiki kecepatan analisis, tapi (dari ini yang lebih penting) ialah telah menghasilkan suatu
teknik dengan daya pisah yang tinggi. HPLC mempunyai kelemahan- kelemahan yang
diantaranya, peralatannya lebih rumit, tidak murah, dan perlu pengalaman. Untuk beberapa jenis
zat, metode ini kurang sensitif. Selain itu sampel disyaratkan harus stabil dalam larutan.
Berdasarkan kepolaran fasa geraknya, HPLC dibagi menjadi 2 macam yaitu :
a) Fase Normal HPLC
HPLC jenis ini secara esensial sama dengan kromatografi kolom. Meskipun disebut
normal, ini bukan bentuk biasa dari HPLC. Kolom ini diisi dengan partikel silika yang sangat
kecil dan pelarut nonpolar seperti heksan sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4,6

mm (dan kemungkinan kurang dari nilai ini) dengan panjang 120 nm-250 nm. Senyawa-senyawa
polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding
dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan
lebih cepat melewati kolom. Apabila pasangan fasa diam lebih polar daripada fasa geraknya
maka sistem ini disebut HPLC fase normal.
b) Fase Balik HPLC
Pada HPLC jenis ini, ukuran kolomnya sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non
polar melalui pelekatan hidrokarbon dengna rantai panjang pada permukaannya secara sederhana
baik berupa atom karbon 8 atau 18. Dalam kasus ini, akan terdapat interaksi yang kuat antara
pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Interaksi yang terjadi tidak
sekuat interaksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fasa diam) dan
molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu molekul-molekul polar akan lebih cepat
bergerak melalui kolom. Sedangkan molekul-molekul non polar akan bergerak lambat karena
interaksi dengan gugus hidrokarbon.

Gambar fase normal dan fase balik


Terdapat beragai zat aditif yang digunakan oleh produsen makanan dan minuman
diantaranya : natrium benzoat, vitamin c, dan kafein untuk masing-masing tujuan tertentu. Ketiga
zat aditif tersebut merupakan senyawa yang memiliki sifat kepolaran yang berbeda, dan memiliki
gugus kromofor yang menyebabkan senyawa tersebut dapat menyerap sinar UV. Berdasarkan
karakteristik senyawa ini memungkinkan dilakukan analisis dengan teknik HPLC yang
menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar.
Vitamin C atau asam askorbat
Vitamin berupa kristal putih dengan rumus molekul C 6H8O6, larut dalam air dan alkohol,
dialam ditemukan dalam buah-buahan dan sayuran, dapat disintesis dari glukosa. Vitamin C
merupakan komponen esensial makanan manusia untuk perawatan kulit. Kekurangan vitamin ini
dapat menimbulkan sariawan, luka pada gusi, badan kurus, dan anemia. Setiap hari diperluka 70100 mg.
Vitamin C adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang
dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini
memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan
fasa geak polar seperti metanol atau air.
Natrium Benzoat atau natrium benzena karboksilat

Kristalin tanpa warna atau atau serbuk amorf putih, C6H6COONa. Larutan dalam iar dan
sedikit larut dalam etanol. Senyawa ini dibuat melalui reaksi natrium hidroksida dengan asam
benzoat dan digunakan dalam industri zat warnadan sebagai pengawet makanan. Zat ini dulu
digunakan sebagai antiseptik.
Kafein
Suatu alkohol dengan rumus molekul C5H10N4O2. Berupa padatan kristal berwarn
aputih dan berasa pahit, ditemukan dalam daun dan biji dari pohin kopi, dalam daun teh, dalam
biji kola.
Reservoir Pelarut
Jumlah reservoir pelarut : (1) bisa salah satu atau lebih; berisi pelarut organik seperti
heksana, atau air, atau campuran air dan pelarut organik seperti metanol,tergantung kepada
apakah kita bekerja menggunakan fasa normal atau fasa terbalik atau metode
kromatografilainnya.
Bila sistem KCKT dilengkapi dengan alat pencampuran (2) (atau mempunyai lebih dari
satu pompa) yang memungkinkan membuat campuran-campuran pelarut dengan komposisi yang
diatur dengan bantuan suatu programener, maka diperlukan lebih dari satu reservoir, sistem ini
diperlukan untuk melakukan elusi bergradien dimana komposisi pelarut diubah-ubah selama
pengelusian.
Pelarut fasa gerak dipompa dari reservoir oleh sistem pompa, demikian sehingga
campuran pelarut dengan komposisi tertentu dapat mengalir tanpa denyutan (pulseless).
Kecepatan aliran dapat diatur antara 0,1 10 mL/menit.
Gas yang terlarut dalam pelarut fasa gerak yang digunakan harus dibuang terlebih dahulu
(de-gassing), selain itu, pelarut harus di saring dahulu agar bebas dari partikel-partikel kecil yang
tidak larut.
Pada saluran-saluran pelarut biasanya dipasang saringan (berukuran 2-10 m) untuk
mencegah partikel-partikel kecil yang tidak larut tadi, masuk kedalam kolom. Saringan ini harus
diganti atau dibersihkan bila terjadi penyumbatan.
Diantara jenis-jenis pompa yang paling umum digunakan untuk sistem HPLC adalah
jenis pompa isap dan tekan (reciprocating).
Pompa isap dan tekan yang sederhana mempunyai kecepatan isap yang tetap. Artinya,
waktu yang diperlukan untuk langkah mengisis sama dengan waktu untuk langkah memompa.
Pompa seperti ini memerlukan perendam denyutan yang baik. Oleh karena itu, pompa jenis ini
umumnya menggunakan dua pengisap yang masing-masing bekerja kebalikan satu dari yang
lainnya. Setiap pengisap memppunyai dua katup pengendali.
Pelarut diisap ke dalam ruang pengisap melalui katup pemasukkan dan kemudian ditekan
ke luar melalui katup pengeluaran. Untuk melakukan elusi bergradien diperlukan dua sistem
pompa yang masing-masing mempunyai satu atau dua penghisap. Ada dua macam rancangan
utama pompa gradien yaitu pecampuran tekana tinggi yang mempunyai hantaran dua pompa dan
pencampuran tekana rendah dengan hantaran satu pompa.
Rancangan pompa gradien yang pertama, yakni sistem pencampuran tekanan tinggi,
mempunyai dua pompa dan satu pengendali, masing-masing pompa menghantarkan satu sistem
pelarut. Fungsi pengendali adalah mengatur kecepatan aliran masing-masing pelarut sesuai
dengan komposisi yang diinginkan dan juga berfungsi untuk menjamin terjadinya pengadukan
yang baik oleh suatu pengaduk dinamik. Setiap pompa mempunyai dua penghisap dan setiap

penghisap mempunyai dua katup. Jenis yang kedua, pompa pembagi bertekanan rendah hanya
mempunyai satu penghisap. Untuk melakukan elusi gradien hanya diperlukan satu pompa.
Pompa ini mempunyai katup pembagi, tidak mempunyai pengendali gradien.
Dengan katup-katup pembagi dimungkinkan untuk membuat suatu campuran terner (tiga
jenis pelarut) dengan perbandingan yang diinginkan. Jadi untuk melakukan gradien gradien tidak
diperlukan lebih dari satu pompa. Katup-katup pembagi ini dikendalikan oleh suatu
microprocessor dan terbuka selama langkah pemasukan pelarut. (Bahti, Husein. H . 2011 : 3440)
Prinsip kerja instumentasi HPLC
HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari sebuah campuran
komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiaap komponen dalam sampel
berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah
pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yang biasa
digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik adalah RMe 2SiCl, dimana R adalah rantai
alkana C-18 atau C8. Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien
elusi), misalnya : air:asetonitril (80:20), hal ini bergantung pada kepolaran analit yang akan
dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan waktu retensinya akan
berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang punsak-puncaknya terpisah.
Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan komponen-komponen terjadi karena perbedaan
kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Keunggulan menggunakan HPLC
dibandingkan kromatografi gas yaitu terletak pada kemampuannya untuk menganalisis cuplikan
yang tidak menguap dan labil pada suhu tinggi. HPLC tidak terbatas pada senyawa organik tapi
mampu menganalisis senyawa anorganik, mampu menganalisis cuplikan yang mempunyai
molekul tinggi (beratnya), mampu menganalisis cuplik yang mempunyai titik didih yang sangat
tinggi seperti polimer.
Cara kerja instumentasi HPLC
Prinsip kerja alat HPLC adalah pertama fasa gerak dialirkan melalui kolom kedetektor
dengan bantuan pompa. Kemudian cuplikan dimasukan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara
penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran karena
perbedan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat
interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu. Sebaliknya solut-solut
yang interaksinya kuat dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen
yang campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk
kromatogram.

Gambar skema instrumentasi HPLC


Komponen-komponen instrumentasi HPLC
1. Fasa Gerak

a)
b)
c)
d)
e)

Fasa gerak dari HPLC merupakan zat cair yang disebut eluen atau pelarut. Dalam HPLC fasa
gerak selain berfungsi untuk membawa komponen-komponen campuran menuju ke detektor,
selain itu juga dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC
merupakan salah satu faktor penetu keberhasilan proses pemisahan. Persyaratan zat cair yang
akan digunakan sebagai fasa gerak sebagai berikut:
Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis
Zat cair harus murni, untuk menghindari masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi
kromatogram
Zat cair harus jernih, untuk meghindari penyumbatan pada kolom
Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun
Zat cair tidak kental dan harus sesuai dengan detektor
Fasa gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikelpartikel kecil. Selain itu adanya gas dalam fasa gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas
akan berkumpul dengan komponen lain terutama do pompa dan detektor sehingga akan
mengacaukan analisis.
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fasa gerak tetap selama elusi) atau
dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan
pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien diguakan untuk meningkatkan
resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah
campuran larutan buffer dengan metanol atua campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan
dengan fase normal, fasa gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut
hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol.
Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding fase terbalik.

2. Kolom
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stailess steel, akan tetapi ada juga yang terbuat dari gelas
berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tepat terjadinya pemisahan campuran menjadi
komponen-komponen. Bergantung keperluannya kolom utama dapat digunakan untuk analisis
atau preparatif setiap komponen yang keluar kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan
keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction colector selain kolom utama dikenal pula kolom
pengaman.
Kolom utama berisi fasa dian dan jenisnya bervariasi bergantung pada keperluan, misalnya
dikenal kolom C8, C-18, cyanopropyl, dan penukar ion. Kolom utama untuk HPLC biasanya
berukuran panjang berkisar antara 5-30 cm dan diameter dalam berkisar 4,510 mm.
Kolom pengaman (guard coloumn) disebut juga pra-kolom karena letaknya sebelum sistem
pemasukan cuplikan. Kolom ini berukuran pendek 5 cm dengan diameter 4,6 mm biasanya
dipaking dengan partikel silika berukuran besar dari ukuran partikel kolom utama. Kolom
pengaman mempunyai dua fungsi yaitu: menyaring kotoran yang terbawa oleh fasa gerak dan
untuk menjenuhkan fasa gerak dalam rangka menghindarkan terjadinya erosi fasa diam oleh
aliran pelarut.
Kolom merupakan jantung kromatograf, keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung
pada pilhan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :
a) Kolom analitik
Garis tengah dalam 2-6 mm, panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk kemasan pelikel
biasanya panjang kolom 50-100 cm, untuk kemasan mikropartikel berpori biasanya 10-30 cm.
b) Kolom preparatif
Umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar, dan panjang 25-100 cm.
3. Pompa

a)
b)
c)
d)

Pada HPLC, pompa ini berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang
berisi serbuk halus. Digunakan pompa bertekanan tinggi dalam metode ini sebagai akibat
penggunaan fasa gerak yang berupa zat cair yang akan sukar mengalir dalam kolom yang
dipadatkan dengan serbuk halus. Oleh karena itu, agar zat cair dapat melewati kolom secara tepat
maka dibutuhkan bantuan pompa yang bertekana tinggi. Pompa yang digunakan dalam HPLC
harus memenuhi persyaratan sebagai berikut :
Menghasilkan tekanan sampai 5000 psi
Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit
Bahan tahan korosi
Keluaran bebas pulse

Dikenal 3 jenis pompa yang masing-masing memiliki keuntungan yaitu :


a) Pompa Reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan
piston maju mundur yang dijalankan oleh motor. Gerakan piston memberikan aliran eluen yang
konstan, memiliki volume internal kecil (35-400 mL) menghasilkan tekanan tinggi (sampai
10.000 psi). Piston berupa batang gelas dan berkontak lengsung dengan pelarut.
b) Pompa Displacement

Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) tersiri dari tabung yang dilengkapi pendorong
yang digerakkan oleh motor. Menghasilkan aliran yang cenderung tidak tergantung pada tekanan
balik kolom dan viskositas pelarut. Memiliki keterbatasan kapasitas pelarut (
250 mL) dan
tidak mudah untuk pergantian pelarut.
c) Pompa Pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi.Pompa jenis ini murah,
tetapi memiliki keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) kecepatan alir
bergantung pada viskositas pelarut dan tekanan balik kolom.
4. Injector Sample
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikan secara langsung ke dalam fase gerak yang
mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari
tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop)
internal atau eksternal.
Salah satu jenis penyuntik untuk memasukan sampel ke dalam sistem (kolom) kromatografi
adalah penyuntik loop.
Dalam prakteknya, loop tidak perlu diisi penuh, tapi bila tidak diisi penuh akan
mengakibatkan lebih jeleknya presisi hasil eksperimen dan ketergantungan presisi tersebut
kepada bagaimana si-operator menggunakan penyuntik.
Perlu diingat, bahwa penyuntik tidak boleh dicabut sebelum pegangan (handle) penyuntik diputar
dari posisi load (pengisap) ke posisi inject (suntik). Karena sampel akan mengalir ke saluran
pembuangan. Hal yang terakhir ini tentunya tidak diinginkan, pegangan penyuntik harus diputar
cepat agar pemutusan aliran ke dalam diinginkan. Pegangan penyuntik harus diputar cepat agar
pemutusan aliran ke dalam kolom, antara posisi pengisian (load) dan posisi penyuntikan (inject)
berlangsung cepat.

Yang menjadi faktor ketidak tepatan pengukuran HPLC salah satunya terletak pada
keterulangan pemasukan cuplikan kedalam paking kolom. Masalahnya kebanyakan memasukan
cuplikan kedalam kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh karen itu cuplikan yang
dimasukkan harus sekecil beberapa puluh mikroliter. Beberapa teknik pemasukan cuplikan
kedalam sistem dapat diuraikan sebagai berikut :
a) Injeksi Syringe
Syringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan
tekanan sampai 1500 psi. Akan tetapi keterulangan injeksi stringe ini sedikit lebih baik dari 2-3
% dan sering lebih jelek.

b) Injeksi Stop Flow


Aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan
disuntikan langsung kedalam ujung kolom. Setelah menyambung kembali kolom maka pelarut
dialirkan kembali. Untuk memasukkan cuplikan kedalam fasa gerak perlu dua langkah :
sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dan posisi load. Cuplikan masih berada
dalam loop ; kran diputar untuk mengubah posisi load menjadi posisi injeksi dan fasa gerak
membawa cuplikan kedalam kolom (kran cuplikan).
c) Kran Cuplikan
Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan. Untuk
memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu 2 langkah, yaitu: sejumlah volume
cuplikan disuntikan ke dalam loop dalam posisi load, cuplikan masih berada dalam loop; kran
diputar untuk mengubah posisi load menjadi posisi injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan ke
dalam kolom.
5. Detektor
Ada dua jenis detektor yaitu detektor selektif, adalah detektor yang peka terhadap golongan
senyawa tertentu saja. Dan detektor universal, yaitu detektor yang peka terhadap golongan
senyawa apapun kecuali pelarutnya. Diantara detektor yang digunakan dalam KCKT adalah
a) Detektor Universal
Detektor Ultra Violet Visible (Sinar Tampak)
Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organik. Detektor
UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang, sehingga panjang gelombang UV yang
digunakan dapat dipilih sesuai dengan jenis cuplikan yang diukur.
Detektor UV-Visible (uv-sinar tampak) paling banyak digunakan, karena sensitivitasnya
yang baik mudah menggunakannya, tidak merusak senyawa yang di analisis, dan memungkinkan
untuk melakukan elusi bergradien. Ada yang dipasang pada panjang gelombang tetap yaitu pada
panjang gelombang 254 nm, dan ada yang panjang gelombangnya dapat dipilih sesuai dengan
diinginkan antara 190-600 nm. Detektor dengan panjang gelombang variabel ini ada yang
dilengkapi alat untuk memilih panjang gelombang secara otomatis dan dapat me-nol-kan sendiri
(allto zero). Detektor jenis ini juga ada yang menggunakan drode erray (sebagai pengganti photo
tube), sehingga dapat melakukan pembacaan absorban yang kontinyu pada berbagai panjang
gelombang.

Detektor Indeks Bias


Detektor indeks bias memberi respons terhadap senyawa yang dianalisis apapun,
termasuk pelarutnya sendiri. Prinsip dasar kerja detektor ini adalah perubahan indeks bias karena
adanya komponen sampel dalam pelarut. Detektor ini bersifat tidak merusak (non-destruktif),
sensitivitasnya cukup tinggi (minimum 10-6 g) dan umumnya digunakan dalam pekerjaan
preparatif. Dengan detektor ini tidak dapat dilakukan elusi bergradien. Detektor ini digunakan
dalam kromatografi eklusi dan dalam analisis karbohidrat.
Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam menggunakan detektor indeks bias :
Bila digunakan lebih dari satu pelarut, maka campuran dahulu hingga homogen dan bebaskan
dari gas terlarutnya.
Setelah detektor dihidupkan, tunggu beberapa lama sebelum digunakan sampai detektor stabil.

Bila digunakan lebih dari satu detektor yang dipasang berurutan, maka tempatkanlah detektor
indeks bias pada urutan terakhir.
Untuk saluran pembuangan, gunakanlah selang teflon berdiameter dalam (inner diameter) yang
besar tapi pendek.
Tempatkan detektor pada kondisi suhu yang dipelihara tetap.
Jaga agar sel indeks bias selalu bersih.
Sel pembanding harus diisi dengan pelarut yang telah dilewatkan melalui kolom,
Detektor Spektrometer Massa
Detektor Spektrometer Inframerah
b) Detektor Selektif
Detektor Fluoresensi
Didasarkan kepada prinsip bahwa molekul-molekul tertentu dapat menyerap energi pada
panjang gelombang yang lebih pendek membentuk suatu keadaan tereksitasi dan kemudian
secara hampi bersamaan turun kembali ke keadaan dasar (ground state) dengan memancarkan
energi pada panjang gelombang yang lebih panjang.

a)
b)
c)
d)
e)
f)

Detektor Konduktivitas Listrik


Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik (konduktometri) dan
polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solut-solut yang
dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organik maupun anorganik. Adapun persyaratan
detektor yaitu: cukup sensitif, stabilitas, dan keterulangan tinggi, tidak erusak cuplikan, respon
linier terhadap solut, reliabilitas tinggi dan mudah digunakan.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut :
Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprousibel
Mempunyia sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar sangat kecil
Stabil dalam pengoperasiannya
Mempunyia sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita
Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas
Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fasa gerak

6. Rekorder
Rekorder adalah alat untuk mencetak hasil percobaan pada lembar berupa kumpulan puncak
(kromatogram) kromatogram HPLC yang didapat berguna untuk analisis kualitatif dan
kuantitatif. Luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran dan jumlah peak
menyatakan jumlah komponen. Analisis kualitatif dapat dilakukan dengan cara membandingkan
waktu retensi (rt) analit atau sampel dengan waktu retensi standar. Sedangkan analisis kuantitatif
depat dilakukan dengan didasarkan pada luas peak atau tinggi peak dengan metode standar
kalibrasi.

B. ALAT DAN BAHAN


Alat :
1. Instrumen HPLC
2. Spatula
3. Labu ukur 50 mL
4. Labu ukur 10 mL
5. Neraca analitik terkalibrasi
6. Corong pendek
7. Pipet tetes
8. Gelas kimia 20 mL
9. Gelas ukur 500 mL
10. Ultrasonic vibrator
11. Pipe seukuran (1,2,3,4,5 mL)
12. Kertas saring Whattmann
13. Membrane PTFE dan selulosa nitrat

1 set
1 buah
6 buah
6 buah
1 set
1 buah
6 buah
1 buah
1 buah
1 set
1 buah
1 lembar
1 lembar

Bahan :
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Natrium benzoat p.a


Vitamin C standar
Kafein
Metanol for HPLC
Sampel minuman yang mengandung vit.C
Kalium dihidrogenfosfat
Aquabides
Asetonitril

2,5 mg
1 mg
5 mg
secukupnya
5 mL
0,68 g
secukupnya
80 mL + secukupnya

C. PROSEDUR KERJA
1. Pembuatan fasa gerak (pelarut)
Dihitung dan ditimbang jumlah KH2PO4 yang diperlukan untuk membuat larutan KH2PO4 0,01
M sebanyak 500 mL dalam aquades. Kemudian di ajust pH pada nilai 2,65 dengan asam fosfat.
Dilakukan penyaringan untuk larutan KH2PO4 menggunakan membrane selulosa nitrat.
Dilakukan penyaringan pula untuk asetonitril dengan PTFE. Dihilangkan gelembung pada
larutan dengan ultrasonic vibrator selama 15 menit. Dibuat campuran larutan fasa gerak
KH2PO4 dan asetonitril (60:40) untuk keperluan larutan standar dan larutan sampel, sesuai
kebutuhan.
2. Pembuatan larutan induk natrium benzoat, vitamin C, dan kafein

Ditimbang zat standar natrium benzoat 2,5 mg, vitamin c 1 mg, dan kafein 5 mg. Dicampurkan
ketiga zat standar dengan melarutkan dalam 50 mL fasa gerak secara kuantitatif pada labu ukur.
Dihomogenkan selama 5 menit menggunakan ultrasonic vibrator.
3. Pembuatan deret larutan standar benzoat, vitamin C, dan kafein
Dipipet larutan induk masing-masing 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, dan 5 mL, diencerkan dengan
fasa gerak dalam labu ukur 10 mL. Dihomogenkan larutannya, kemudian disaring semua larutan
standar tersebut dengan menggunakan membrane PTFE. Ditempatkan hasil saringan ke dalam
vial bertutup yang telah diberi label. Dilakukan degassing selama 5 menit. Larutan standar siap
diinjeksikan.
4. Pembuatan larutan sampel
Dipipet 5 mL larutan sampel , dilarutkan dengan fasa gerak hingga 10 mL secara kuantitatif pada
labu ukur. Dilakukan penyaringan dengan PTFE, ditampung dalam botol vial bertutup.
Dihilangkan gelembung pada larutan sampel dengan menggunakan ultrasonic vibrator selama 5
menit.

5. Penyiapan instrumen HPLC


Sementara melakukan preparasi sampel dan standar, dihidupkan peralatan HPLC sesuai dengan
langkah berikut :
a) Dikondisikan instrumen HPLC dengan: fasa gerak dengan sistem elusi gradien dengan kondisi:

Kolom
Panjang gelombang
Laju alir
Volume injeksi
b)
c)
d)
e)
f)

Waktu (menit)
0
1
2
3
4
5
: C-18 (12,5 cm)
: 254 nm
: 0,75 mL/menit
: 20 L

%Asetonitril
60
40
20
30
40
60

% KH2PO4
40
60
80
70
60
40

Dipastikan kabel penghubung listrik telah tersambung dengan benar.


Ditekan tombol ON pada sakelar listrik.
Diisi botol fasa gerak dengan volume yang memadai dan dikosongkan botol penampung.
Ditekan tombol ON pada alat, berturut-turut untuk power, detektor, dan pompa.
Dilakukan pemrograman alat dengan komputer. Diikuti langkahnya sesuai instruksi dalam
komputer.
g) Dipilih mode yang akan digunakan sesuai dengan parameter kondisi instrumen
h) Apabila kromatogram telah menunjukkan base line yang mendatar , maka instrumen siap
digunakan

i)
j)
k)
l)
m)

Diinjeksikan berturut-turut larutan standar (dimulai dari konsentrasi terendah), dan terakhir
larutan sampel.
Dicetak hasil pengukuran, dicatat kondisi percobaannya.
Setelah selesai digunakan, dimatikan pompa dengan menyoroti tanda pompa dalam komputer.
Ditutup file sesuai petunjuk, lalu dimatikan komputer.
Untuk mematikan, ditekan tombol OFF pada pompa, detektor, dan power secara berurutan.
Diputuskan sambungan listrik.

6. Perhitungan hasil analisis


Dari hasil operasi instrumen akan diperoleh kurva kalibrasi. Bila kurva kalibrasi diperoleh
dengan koefisien regresi > 0,997 , maka boleh melanjutkan perhitungan kadar zat aditif dalam
sampel. Dihitunglah kadarnya dalam satuan % w/w . Bila tidak diperoleh kurva yang linier, maka
dilakukan diskusi untuk mencari penyebabnya.
D. HASIL DAN ANALISIS DATA
Analsis kuantitatif HPLC didasarkan pada pengukuran luas atau area puncak dalam kromatogram. Pada percobaan penentuan kadar
vitamin c, kafein, dan natrium benzoat dalam sampel dengan menggunakan metode HPLC, digunakan satu deret standar yang
konsentrasinya bervariasi, yaitu 10 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, dan 50 ppm. HPLC adalah suatu metode pemisahan dari analit
berdasarkan perbedaan interaksi pada fasa diam dan fasa diamnya. Sehingga akan didapatkan waktu retensi yang berbeda-beda antara
komponen yang satu dengan komponen yang lainnya.
Metode yang digunakan pada pengujian ini adalah metode fasa terbalik dimana fasa gerak yang digunakan ini bersifat relatif
lebih polar daripada fasa diamnya. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran kalium dihidrogen fosfat dan asetonitril dengan
perbandingan 60 : 40. Sedangkan fasa diamnya berupa silika yang direaksikan dengan organoklorosilana.

Struktur Fasa diam


Berdasarka urutan kepolaran antara vitamin c, kafein, dan natrium benzoat. Bahwa vitamin c lebih besar dari kafein lebih
besar dari natrium benzoat. Maka waktu retensi vitamin c lebih kecil dari kafein lebih kecil dari natrium benzoat. Sehingga larutan
standar yang digunakan mempunyai harga regresi lebih mendekati satu.
Dalam preparasi larutan standar dan sampel digunakan membran PTFE (Poly Tetra Fluoro Ethylene) untuk proses pemurnian
larutan standar maupun sampel yang dipisahkan dari pengotornya.
Sebelum pengujian sampel, terlebih dahulu dibuat kurva kalibrasi dari deret larutan standar dengan konsentrasi yang telah
ditentukan. Kurva diplotkan antara konsentrasi setiap larutan standar terhadap luas area peak yang diperkirakan sebagai peak dari
vitamin C, pada masing-masing kromatogramnya.
Penentuan peak vitamin C pada kromatogram larutan standar ini dilakukan dengan mengamati peak yang waktu retensinya
relatif tetap atau sama pada setiap konsentrasi larutan standar, serta memerhatikan luas area peaknya. Karena larutan standar adalah

larutan vitamin C maka kadar vitamin C di dalamnya adalah yang terbesar dibanding komponen lain sebagai hasil penguraian vitamin C
atau senyawa lainnya (pengotor). Adanya penguraian ini ditunjukkan salah satunya dari adanya lebih dari satu peak pada kromatogram.
Dari data kromatogram deret larutan standar, diperoleh waktu retensi untuk vitamin c 1.98; waktu retensi kafein 2.54; dan
waktu retensi natrium benzoat 4.38.
Waktu retensi pada larutan standar menjadi acuan dalam menentukan komponen-komponen yang terdapat dalam sampel. Pada
kromatogram sampel terdapat empat puncak, yaitu :
Komponen kesatu dengan waktu retensi sebesar 1.79; dan luas area sebesar 220807
Komponen kedua dengan waktu retensi sebesar 1.99; dan luas area sebesar 1779127
Komponen ketiga dengan waktu retensi sebesar 4.40; dan luas area sebesar 15581524
Komponen keempat dengan waktu retensi sebesar 4.81; dan luas area sebesar 478118
Komponen kesatu dalam sampel diduga bukan vitamin c, karena waktu retensi untuk vitamin c dimulai dari 1.98, sebagaimana
hasil dari kromatogram yang tertera. Sedangkan pada komponen kedua, diidentifikasikan sebagai komponen vitamin c, karena waktu
retensinya mendekati waktu retensi vitamin c. Dan pada komponen ketiga waktu retensinya mendekati waktu retensi natrium benzoat
yang dimulai dari 4.38. sehingga diidentifikasikan bahwa komponen ketiga sebagai komponen natrium benzoat. Komponen keempat
pada sampel diduga bukan natrium benzoat, karena selisih waktu retensinya sangat jauh dengan waktu retensi natrium benzoat.
Berdasarkan hasil pengolahan data, kadar natrium benzoat dalam sampel adalah 115,757 mg, sedangkan kadar vitamin c
adalah 3,53664 mg.

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil praktikum kali ini dilakukan penentuan kadar zat aditif dalam sampel dengan menggunakan HPLC, pada
larutan sampel yang digunakan yaitu Mizone terdapat dua kadar zat aditif, yaitu kadar komponen vitamin c dan kadar komponen natrium
benzoat.
Kadar vitamin c yang terkandung dalam sampel yaitu sebesar 3,53664 mg dan kadar natrium benzoat yang terkandung dalam
sampel sebesar 115,757 mg.

DAFTAR PUSTAKA
Day, R.A., A.L. Underwood. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta: Erlangga.
Hendayana, Sumar. (2006) . KIMIA PEMISAHAN Metode Kromatografi dan Elektroforensis Modern. Bandung : PT. Remaja Rosdakarya.
Tim Kimia Analitik Instrumen. (2009). Penuntun Praktikum Kimia Analitik Instrumen (KI 512). Bandung : Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA
UPI.

Lampiran
A.

Data Pengamatan

1. Cara pembuatan larutan


a)
KH2PO4
Pembuatan fasa gerak (pelarut)

Dihitung dan ditimbang jumlah yang diperlukan

Dilarutkan dalam aquades sampai volume 500 mL


Di ajust pH pada nilai 2,65 dengan asam fosfat

Larutan KH2PO4 0,01


M

Dilakukan penyaringan menggunakan membrane selulosa nitrat

Dilakukan penyaringan pula dengan PTFE

Asetonitril
Dihilangkan gelembung pada larutan dengan ultrasonic vibrator selama 15 menit


Fasa gerak (pelarut)
Dibuat campuran larutan fasa gerak KH2PO4 dan asetonitril (60:40)
b)
Zat standar
Pembuatan larutan induk natriun benzoat, vitamin c, dan kafein

Ditimbang natrium benzoat 2,5 mg, vitamin c 1 mg, dan kafein 5 mg

Dicampurkan ketiga zat standar dengan melarutkan dalam 50 mL fasa gerak secara kuantitatif
pada labu ukur
Dihomogenkan selama 5 menit menggunakan ultrasonic vibrator
Larutan induk natrium
benzoat, vitamin c dan
kafein

c)

Larutan induk natrium


benzoat, vitamin c dan
kafein
Pembuatan deret larutan standar natrium benzoat, vitamin c, dan kafein

Dipipet masing-masing 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, dan 5 mL


Diencerkan dengan fasa gerak dalam labu ukur 10 mL
Dihomogenkan larutannya
Disaring semua larutan standar tersebut dengan menggunakan membrane PTFE
Ditempatkan hasil saringan ke dalam vial bertutup yang telah diberi label. Dilakukan degassing
selama 5 menit.
Larutan standar

d)
Larutan sampel
Pembuatan larutan sampel

Dipipet 5 mL

Dilarutkan dengan fasa gerak hingga 10 mL secara kuantitatif pada labu ukur
Dilakukan penyaringan dengan PTFE
Ditampung dalam botol vial bertutup

Larutan sampel
Dihilangkan gelembung pada larutan sampel dengan menggunakan ultrasonic vibrator selama 5
menit.

2. Data pengamatan

a.

Cara Kerja
Pembuatan fasa gerak (pelarut)
Dihitung
dan
ditimbang
jumlah
KH2PO4 yang diperlukan untuk membuat
larutan KH2PO4 0,01 M sebanyak 500
mL dalam aquades
Di ajust pH pada nilai 2,65 dengan
asam fosfat
Dilakukan penyaringan untuk larutan
KH2PO4 menggunakan
membrane
selulosa nitrat

Pengamatan

Dilakukan penyaringan pula untuk


asetonitril dengan PTFE
Dihilangkan gelembung pada larutan
dengan ultrasonic vibrator selama 15
menit
Dibuat campuran larutan fasa gerak
KH2PO4 dan asetonitril (60:40)

Larutan sudah
ada.
Larutan tidak
berwarna

Larutan asetonitril =
larutan tidak berwarna
Larutan KH2PO4 = 120
mL
Asetonitril = 80 mL
Fasa gerak = larutan
tidak berwarna
b. Pembuatan larutan induk natriun
benzoat, vitamin c, dan kafein
Ditimbang zat standar natrium benzoat
2,5 mg, vitamin c 1 mg, dan kafein 5 mg
Dicampurkan ketiga zat standar dengan
melarutkan dalam 50 mL fasa gerak
secara kuantitatif pada labu ukur
Dihomogenkan
selama
5
menit
Larutan induk natrium
menggunakan ultrasonic vibrator.
benzoat, vitamin c , dan
kafein = larutan tidak
berwarna
c. Pembuatan deret larutan standar natrium
benzoat, vitamin c, dan kafein

Dipipet larutan induk masing-masing 1


mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, dan 5 mL
Diencerkan dengan fasa gerak dalam
labu ukur 10 mL
Dihomogenkan larutannya
Disaring semua larutan standar tersebut
dengan menggunakan membrane PTFE
Ditempatkan hasil saringan ke dalam vial
bertutup yang telah diberi label
Dilakukan degassing selama 5 menit
Larutan deret standar =
larutan tidak berwarna
d. Pembuatan larutan sampel
Dipipet 5 mL larutan sampel
Dilarutkan dengan fasa gerak hingga 10
mL secara kuantitatif pada labu ukur
Dilakukan penyaringan dengan PTFE
Ditampung dalam botol vial bertutup
Dihilangkan gelembung pada larutan
sampel dengan menggunakan ultrasonic
vibrator selama 5 menit.
e. Penyiapan instrumen HPLC
Sementara melakukan preparasi sampel
dan standar, dihidupkan peralatan HPLC
sesuai dengan langkah berikut:
a) Dikondisikan instrumen HPLC dengan:
fasa gerak dengan sistem elusi gradien
dengan kondisi:
Waktu
%Asetonitril
% KH2PO4
(menit)
0
60
40
1
40
60
2
20
80
3
30
70
4
40
60
5
60
40
Kolom
Panjang gelombang
Laju alir
Volume injeksi

: C-18 (12,5 cm)


: 254 nm
: 0,75 mL/menit
: 20 L

b) Dipastikan kabel penghubung listrik

Sampel
berupa
minuman MIZONE
Sampel = larutan tidak
berwarna

Laju
alir
diubah
menjadi 0,5 mL/menit

telah tersambung dengan benar.


c) Ditekan tombol ON pada sakelar
listrik.
d) Diisi botol fasa gerak dengan volume
yang memadai dan dikosongkan botol
penampung.
e) Ditekan tombol ON pada alat,
berturut-turut untuk power, detektor, dan
pompa.
f) Dilakukan pemrograman alat dengan
komputer. Diikuti langkahnya sesuai
instruksi dalam komputer.
g) Dipilih mode yang akan digunakan
sesuai dengan parameter kondisi
instrumen
h) Apabila
kromatogram
telah
menunjukkan base line yang mendatar ,
maka instrumen siap digunakan
i) Diinjeksikan
berturut-turut
larutan
standar (dimulai dari konsentrasi
terendah), dan terakhir larutan sampel.
j) Dicetak hasil pengukuran, dicatat kondisi
percobaannya.
k) Setelah selesai digunakan, dimatikan
pompa dengan menyoroti tanda pompa
dalam komputer.
l) Ditutup file sesuai petunjuk, lalu
dimatikan komputer.
m) Untuk mematikan, ditekan tombol
OFF pada pompa, detektor, dan power
secara berurutan. Diputuskan sambungan
listrik.

1.

Hasil Pengukuran

Pengukuran deret standar

Vitamin C

Der
et

Konsentr
asi

2.2

6.6

8.8

11

Area
1846
67
5363
15
7429
76
9587
51

Kafei
n
Konsent
Deret
rasi
1

10.4

31.2

41.6

52

Area
4618
95
1391
986
1891
473
2398
312

Tr
2.54
2.82
2.55
2.84

Tr
1.98
2.08
1.99
2.08

Natrium
Benzoat
Der Konsentr
et
asi

B.

5.6

16.8

22.4

28

Area
2314
3
1236
28
1318
03
2323
08

Perhitungan

1.

Pembuatan Larutan KH2PO4


Massa KH2PO4 yang diperlukan
n = MxV
m = n x Mm
= M x V x Mm
Massa KH2PO4 = 0,01 M x 0,5 L x 136 g/mol
= 0,68 gram

2.

Pembuatan Larutan
standar 10 mL dari 1 mL larutan induk
V 1 M1
= V2 M2
1 mL x 100 ppm
= 10 mL x M2
M2
= 10 ppm
standar 10 mL dari 2 mL larutan induk
V 1 M1
= V2 M2
2 mL x 100 ppm
= 10 mL x M2

Tr
4.38
4.48
4.46
4.53

3.

M2
= 20 ppm
standar 10 mL dari 3 mL larutan induk
V 1 M1
= V2 M2
3 mL x 100 ppm
= 10 mL x M2
M2
= 30ppm
standar 10 mL dari 4 mL larutan induk
V 1 M1
= V2 M2
4 mL x 100 ppm
= 10 mL x M2
M2
= 40ppm
standar 10 mL dari 5 mL larutan induk
V 1 M1
= V2 M2
5 mL x 100 ppm
= 10 mL x M2
M2
= 50 ppm
Pembuatan Larutan Baku Vitamin C 1000 ppm
a. vitamin C
Konsentrasi (ppm) =

1000 ppm =
Massa Vitamin C = 22 mg
b. kafein
Konsentrasi (ppm)

1000 ppm =

Massa kafein = 104 mg


b. Natrium Benzoat
Konsentrasi (ppm)

1000 ppm =

Massa Natrium Benzoat = 56 mg


2.

Pembuatan Deret Larutan Standar Vitamin C

Larutan Standar 1 mL
V 1 M1
= V2 M2
1 mL x 22 ppm
= 10 mL x M2
M2
= 2,2 ppm

Larutan Standar 2 mL
V 1 M1
= V2 M2
2 mL x 22 ppm
= 10 mL x M2
M2
= 4,4 ppm

Larutan Standar 3 mL
V 1 M1
= V2 M2
3 mL x 22 ppm
= 10 mL x M2
M2
= 6,6 ppm
Larutan Standar 4 mL
V 1 M1
= V2 M2
4 mL x 22 ppm
= 10 mL x M2
M2
= 8,8 ppm
Larutan Standar 5 mL
V 1 M1
= V2 M2
5 mL x 22 ppm
= 10 mL x M2
M2
= 11 ppm

3.

Pembuatan Deret Larutan Standar kafein

Larutan Standar 1 mL
V 1 M1
= V2 M2
1 mL x 104 ppm
= 10 mL x M2
M2
= 10,4 ppm

Larutan Standar 2 mL
V 1 M1
= V2 M2
2 mL x 104 ppm
= 10 mL x M2
M2
= 20,8 ppm
Larutan Standar 3 mL
V 1 M1
= V2 M2
3 mL x 104 ppm
= 10 mL x M2
M2
= 31,2 ppm
Larutan Standar 4 mL
V 1 M1
= V2 M2
4 mL x 104 ppm
= 10 mL x M2
M2
= 41,6 ppm
Larutan Standar 5 mL
V 1 M1
= V2 M2
5 mL x 104 ppm
= 10 mL x M2
M2
= 52 ppm

4.

Pembuatan Deret Larutan Standar natrium benzoat

Larutan Standar 1 mL
V 1 M1
= V2 M2
1 mL x 56 ppm
= 10 mL x M2
M2
= 5,6 ppm

Larutan Standar 2 mL

V 1 M1
2 mL x 56 ppm
M2

= V2 M2
= 10 mL x M2
= 11,2 ppm

Larutan Standar 3 mL
V 1 M1
= V2 M2
3 mL x 56 ppm
= 10 mL x M2
M2
= 16,8 ppm
Larutan Standar 4 mL
V 1 M1
= V2 M2
4 mL x 56 ppm
= 10 mL x M2
M2
= 22,4 ppm
Larutan Standar 5 mL
V 1 M1
= V2 M2
5 mL x 56 ppm
= 10 mL x M2
M2
= 28 ppm

5. Perhitungan hasil analisis


# Vitamin C
Berdasarkan kurva kalibrasi didapat persamaan garis y = 252891x 26551
Luas area vitamin c = 1779127
y = 252891x 26551
1779127 = 252891x 26551
x=
x = 7,140 ppm
Konsentrasi vitamin c dalam sampel = 7,140 ppm
Massa vitamin c
= 7,140 mg/L x 10 mL
=
x 10 mL
= 0,0714 mg
Kadar vitamin c = 0,0714 mg/10 mL
Maka dalam 500 mL sampel mizone, kadar vitamin c =

x 0,0714 mg

= 3,57 mg
# Natrium Benzoat
Berdasarkan kurva kalibrasi didapat persamaan garis y = 63567x 31197
Luas area natrium benzoat = 15581524
y = 63567x 31197
15581524 = 63567x 31197

x=
x = 245,610 ppm
Konsentrasi natrium benzoat dalam sampel = 245,610 ppm
Massa natrium benzoat
= 245,610 mg/L x 10 mL
=
x 10 mL
= 2,4561 mg
Kadar natrium benzoat = 2,4561 mg/10 mL
Maka dalam 500 mL sampel mizone, kadar
natrium benzoat =
x 2,4561 mg
= 122,805 mg
Diposkan 9th January oleh Novie Nurlaeli

LABORATORIUM KROMATOGRAFI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA
2011
ABSTRAK
Tiga metode yang handal, cepat dan selektif telah dikembangkan dan divalidasi untuk penentuan lamotrigin di hadapan kenajisannya,
2,3-asamdichlorobenzoic. Metode pertama adalah metode spektrofotometrimenggunakan asam p-chloranilic membentuk produk berwarna
dengan maks5192 nm. Semua variabel yang mempengaruhi reaksi memiliki telah diselidiki dan kondisi yang dioptimalkan. Hukum Beer
adalah dipatuhi selama rentang konsentrasi 10 - 200g/ml dengan akurasi rata-rata 100,130,44%. Rasio molar dari ion-asosiasi yang dibentuk
kompleks ditemukan menjadi 1: 1 seperti yang disimpulkan dengan metode Job. Kondisi stabilitas konstan (Kf), standar energi bebas,
molar absorptivitas ( ), dan indeks sensitivitas dievaluasi. Metode kedua adalah didasarkan pada pemisahan KLT dikutip dari obat
(Rf = 0,750,01) dari kenajisannya (Rf = 0,230,01) diikuti dengan pengukuran densitometri dari utuhobat bintik-bintik pada 275 nm. Pemisahan
dilakukan pada pelat silika gel menggunakan etil asetat: metanol:amonia 35% (17: 2: 1 v/v/v) sebagai fase gerak. Rentang Linearitas adalah 0,510g / spot dengan akurasi rata-rata 99,991,33%. Metode ketiga adalah akurat dan sensitif stabilitas-menunjukkan HPLC metode yang
didasarkan pada
pemisahan lamotrigin dari
pengotor
pada
kolom
fase
terbalik C18, menggunakan fase
gerak
asetonitril : metanol : 0.01Mkalium orthophosphate (pH 6,70,1) (30: 20: 50 v / v / v) pada suhu ambien 255 C dan deteksi UV pada
275nm dalam waktu analisis keseluruhan dari sekitar 6 menit, berdasarkan pada daerah puncak.. Pengulangan injeksi, intraday dan
interday pengulangan dihitung. Prosedur ini memberikan respon linier selama rentang konsentrasi 1-12g/ml dengan akurasi, rata-rata
99,501,30%. Metode yang diusulkan telah berhasil diterapkan untuk penentuan dari lamotrigin dalam bubuk massal, dalam bentuk dosis dan
di hadapan pengotornya. Hasil yang diperoleh dianalisis dengan ANOVA untuk menilai bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan antara
masing-masing tiga metode dan melaporkan satu. Validasi dilakukan sesuai dengan pedoman USP.

PENDAHULUAN
A. Tinjauan Pustaka
Saat ini Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau biasa juga disebut HPLC merupakan teknik
pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu

sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan
industri-industri makanan. KCKT dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970an. Kegunaan umum KCKT adalah untuk : pemisahan sejumlah senyawa organic, anorganik,
maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities), analisis senyawa-senyawa tidak
mudah menguap (non volatil), penentuan molekul-molekul netral, ionic, maupun switter ion,
isolasi dan pemurnian senyawa, pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama,
pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace element) dalam jumlah banyak, dan
dalam skala proses industri.
KCKT merupakan metode tidak desktruktif dan dapat digunakan baik dalam analisis
kualitatif maupun kuantitatif. Kromatografi merupakan teknik yang mana solute (zat terlarut)
terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solute-solut ini melewati suatu kolom
kromatografi. Interaksi KCKT pada dasarnya terdiri atas 8 komponen pokok, yaitu : wadah fase
gerak, system penghantaran fase gerak, alat untuk memasukkan sampel, kolom, detector, wadah
penampung buangan fase gerak, tabung penghubung, suatu computer atau integrator atau
penekan.
(Rohman & Ganjar, 2009)
KCKT sangat cocok untuk memisahkan minyak atsiri dan kadang-kadang menunjukkan
keuntungan yang berarti kesetimbangan metode kolom terbuka (kapiler) dan KG yang sekarang
dipakai, pendadahan keudara minimum, hasil urai karena suhu tinggi dicegah, senyawa yang
tidak atsiri dapat dipisahkan, dan laju perolehan kembali cuplikan tinggi. Akan tetapi, minyak
atsiri sering terdiri atas campuran yang sangat rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau
memisahkan golongan senyawa menjadi komponennya.
(Hostettmann, 1995)
Pada kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas dengan bermacam dimeter.
KCKT berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter kecil,
2-8mm dengan ukuran partikel penunjang penunjang 50mm, sedangkan laju aliran dipertinggi
dengan tekanan yang tinggi.
(Khopkar, 1990)
Terdapat 2 mode operasional HPLC yaitu mode isokratik dan metode gradient. Mode
isokratik serupa dengan instrumental dalam KG, hanya dalam HPLC komposisi fase geraknya
yang sama selama pengukuran berlangsung. Sebaliknya, dalam mode gradient komposisi fase
gerak divisualisaikan selama pengukuran berlangsung.
(Hendayana, 2006)
KCKT adalah suatu metode yang menggabungkan koefisien kolom dan kecepatan analisis.
KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fase gerak
cairan dan fase diam cairan ataupun padat. Kelebihan KCKT antara lain dapat dilaksanakan pada
suhu kamar, cepat dan mudah pelaksanaannya, peka dari detector KCKT dapat divariasi dan
unik, pelarut pengembang dapat dipakai berulang kali demikian juga dengan kolomnya, ideal
untuk molekul besar dan ion, mudah memperoleh cuplikan, daya pisahnya baik, dan dapat
dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis.
(Harbone, 1987)
Berdasarkan sistem peralatannya maka HPLC termasuk kromatografi kolom karena
dipakai pada fase diam yang terpacking dalam kolom sedangkan berdasarkan proses
pemisahannya HPLC digolongkan sebagai kromatografi adsorbs dan partisi. Prinsip
kromatografi partisi linarut antara 2 pelarut yang tidak bercampur yang ada pada fase diam dan

fase gerak. Jika linarut ditambahkan ke dalam sistem yang terdiri dari dua pelarut yang tidak
tercampur dan keseluruhan sistem dibiarkan setimbang, linarut akan tersebar antara dua fase.
(Anonim, 1995)
B. Tujuan
Diharapkan mampu memahami :
1. Cara pemisahan dan identifikasi suatu senyawa (analisis kualitatif) dengan menggunakan
KCKT/HPLC
2. Penetapan kadar suatu senyawa (analisis kuantitatif) menggunakan KCKT

METODOLOGI
A. Alat dan Bahan
Alat :
Gelas ukur
Corong
Kertas saring
Pipet ukur
Mikropipet
Mikrosyringe (syringe Hamilton)
Shimadzu UV / VIS spektrofotometer 1601
Labu ukur
Split injector
Bahan :
asam 2,3-diklorobenzoic
etil asetat
metanol
amonia
asetonitril
kalium orthophosphate 0,01M
Lamotrigin
Lamictal tablet
Aseton
Silika C-18

B. Preparasi Sampel
10 tablet ditimbang seksama dan digerus halus
Diambil 100mg lamotrigin dimasukkan dalam labu takar 100ml
Dilarutkan dalam 50 ml aseton atau methanol
Larutan diaduk dengan pengaduk magnetic selama 10 menit

Disaring dan diukur volumenya


Dilakukan replikasi tiga kali
C. Prosedur dan Sistem Kromatografi
Prosedur
Fase diam: silica C18
Fase gerak: campuran asetronitril:methanol:kalium ortophosfat 0,01M (pH 6,70,1 ) (30:20:50
v/v/v)
Deteksi: digunakan sebuah model 600LC pompa seri dan 600 kontroler unit,detector absorbansi
uv 275 nm,745 modul data.
Flow rate : 1,5ml/min
Pengkondisian kolom 30 menit dilakukan pada suhu kamar 255C
Volume injeksi 20l
Pembuatan fase gerak
Dilakukan pencampuran asetonitril:Metanol:Kalium ortophosfat 0,01M (30:20:50 v/v/v)
dengan pH 6,70,1
Disaring menggunakan membrane filter 0,45 m
Degassed dalam ultrasonic sebelum digunakan
Kalibrasi
Larutan baku 0,04mg/ml (setara dengan 0,01-0,12 mg lamotrigin) dipindah ke labu ukur, diadkan
10ml dengan fase gerak
Disuntikkan 20l dari masing-masing konsentrasi
Dihitung daerah puncak rata-rata dan diplot terhadap konsentrasi
Didapatkan persamaan regresi linier
Dilakukan Aplikasi tablet sesuai dengan preparasi sampel

HASIL PERCOBAAN
tabel 2. Hasil kesesuaian sistem HPLC
Tabel 1.Validasi laporan HPLC untuk penentuan lamotrigin
Tabel 3. Penentuan kadar lamotrigin dalam campuran sintesis

PEMBAHASAN
Metode HPLC dikembangkan dan diterapkan untuk penentuan lamotrigin dengan
campuran asam 2,3-dichlorobenzoic. Untuk mengoptimalkan HPLC dilakukan uji
parameter,untuk komposisi fase gerak dan pH. Pemisahan yang memuaskan diperoleh dengan
fase gerak asetonitril: metanol: 0,01 M kalium orthophosphate pH 6,7 0,1 (30: 20: 50 v / v / v)
menggunakan kolom C18 di suhu ruang. Analisis dilakukan oleh elusi isokratik dengan laju
aliran 1,5 ml / menit dan dideteksi pada 275 nm (Gambar 6). Jangkauan linier 1-12g ml-1
Diperoleh dengan akurasi rata-rata 99,50 1,30% seperti yg ditunjukkan pada Tabel 1. Tes
kesesuaian sistem metode HPLC dievaluasi pada Tabel 2.
Hasil dalam (Tabel 4) menunjukkan tidak ada gangguan dari eksipien tablet seperti kalsium
karbonat, hidroksipropil selulosa, aluminium magnesium silikat, povidone, natrium glikolat
pati,sakarin natrium dan magnesium stearat. Selain itu, Asam 2,3-dichlorobenoic ditemukan
kurang dari batas 0.2%.

KESIMPULAN

Metode HPLC dikembangkan dan diterapkan untuk penentuan lamotrigin dengan campuran asam
2,3-dichlorobenzoic.
Ditemukan asam 2,3-diklorobenzoik kurang dari batas 0,2%
Diperoleh akurasi rata-rata lamotrigin 99,50 1,30%

DAFTAR PUSTAKA

http://bangpae.blogspot.com/2012/09/laporan-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html

BAB I
PENDAHULUAN
1.1.Tujuan Percobaan Praktikum
Pemisahan senyawa dengan metode High Performance Liquid Chromatografr (HPLC).
1.2. Teori
Kromatografi gas adalah salah satu mode pemisahan kromatografi yang digunakan
untuk Memisahkan semua zat yang berbentuk uap/gas atau dapat diuapkan ,tanpa mengalami
penguraian dan menggunakan gas sebagai fase geraknya.prinsip kerja dari metode kromatografi
gas adalah menyuntikkan contoh kedalam ujung kolom kromatografy gas,lalu contoh tersebut
diuapkan dan dielusi oleh gas inert yang digunakan sebagai fase geraknya.perbedaan yang cukup
mencolok dari sebagian besar metode kromatografi lainnya yaitu terletak pada fase geraknya
.fase gerak yang digunakan tidak ikut berinteraksi dengan senyawa atau molekul dari alat
tersebut,sehingga fase gerak yang digunakan hanya berfungsi sebagai zat yang membawa alat
kedalam kolom. Keuntungan dari analisis menggunakan kromatografi gas adalah kecepatan
analis yang relative lebih cepat dalam memisahkan komponen dari suatu senyawa yang tentunya
sangat beragam.selain itu kromatografi gas dapat memisahkan senyawa-senyawa yang memiliki
perbedaan titik didih yang sangat kecil dan tidak mungkin dipisahkan dengan cara penyulingan
atau cara lain.
Analisis dengan menggunakan kromatografi gas merupakan salah stu teknik analisis
yang memiliki tingkay kepekaan yang sangat tinggi,sehingga dapat digunakan untuk analisis
dengan rentang yang sangat luas kepekaan dari kromatografy gas adalah dapat mendeteksi
sampai satuan ppb (part per billion).keuntungan tambahan dari tingkat kepekaan yang tinggi
adalah cuplikan yang diperlukan sangat sedikit sekali .dengan beberapa mikroliter saja,sudah
mampu untuk menganalisis secara lengkap .komponen-komponen kromatografi gas umumnya
terdiri atas tangki gas pembawa ,injector ,kolom berikut oven ,detector dan system pengolah
data.
Kromatografi gas-cair (biasa disebut kromatografi gas) merupakan analisis yang sangat
bermanfaat
Pelaksanaan
kromatografi
gas-cair
Pengantar
Seluruh bentuk kromatografi terdiri dari fase diam dan fase gerak. Dalam seluruh bentuk
kromatografi yang lain, anda akan menemui fase gerak adalah cairan. Dalam kromatografi gascair, fase gerak adalah gas seperti helium dan fase diam adalah cairan yang mempunyai titik
didih yang tinggi diserap pada padatan.Bagaimana kecepatan suatu senyawa tertentu

bergerak melalui mesin, akan tergantung pada seberapa lama waktu yang dihabiskan untuk
bergerak dengan gas dan sebaliknya melekat pada cairan dengan jalan yang sama.
Diagram alir kromatografi gas-cair
Injeksi

sampel

Sejumlah kecil sampel yang akan dianalisis diinjeksikan pada mesin menggunakan semprit kecil.
Jarum semprit menembus lempengan karet tebal (Lempengan karet ini disebut septum) yang
mana akan mengubah bentuknya kembali secara otomatis ketika semprit ditarik keluar dari
lempengan
karet tersebut.Injektor berada dalam oven yang mana temperaturnya dapat
dikontrol. Oven tersebut cukup panas sehingga sampel dapat mendidih dan diangkut ke kolom
oleh gas pembawa misalnya helium atau gas lainnya.
Bagaimana

kerja kolom?

Material
padatan
Ada dua tipe utama kolom dalam kromatografi gas-cair. Tipe pertama, tube panjang dan tipis
berisi material padatan; Tipe kedua, lebih tipis dan memiliki fase diam yang berikatan dengan
pada bagian terdalam
permukaannya. Untuk menyederhanakan, kita akan melihat pada
kolom
terpadatkan. Kolom biasanya dibuat dari baja tak berkarat dengan panjang antara 1
sampai 4 meter, dengan diameter internal sampai 4 mm. Kolom digulung sehingga dapat
disesuaka dengan oven yang terkontrol secara termostatis. Kolom dipadatkan dengan tanah
diatomae, yang merupakan batu yang sangat berpori. Tanah ini dilapisis dengan cairan bertitik
didih tinggi, biasanya polimer
lilin.
Temperatur
kolom
Temperatur kolom dapat bervariasi antara 50 oC sampai 250 oC. Temperatur kolom lebih rendah
daripada gerbang injeksi pada oven, sehingga beberapa komponen campuran dapat
berkondensasi pada aw.al Kolom Dalam beberapa kasus, seperti yang anda akan lihat pada
bagian bawah, kolom memulai pada temperatur rendah dan kemudian terus menerus menjadi
lebih
panas
dibawah
pengawasan.
Ada tiga hal yang dapat berlangsung pada molekul tertentu dalam campuran yang diinjeksikan
pada kolom:
Molekul dapat berkondensasi pada fase diam.
Molekul dapat larut dalam cairan pada permukaan fase diam
Molekul dapat tetap pada fase gas
Dari ketiga kemungkinan itu, tak satupun yang bersifat permanen. Senyawa yang mempunyai
titik didih yang lebih tinggi dari temperatur kolom secara jelas cenderung akan berkondensasi
pada bagian awal kolom. Namun, beberapa bagian dari senyawa tersebut akan menguap kembali
dengan dengan jalan yang sama seperti air yang menguap saat udara panas, meskipun temperatur
dibawah 100 oC. Peluangnya akan berkondensasi lebih sedikit selama berada didalam kolom.
Sama halnya untuk beberapa molekul dapat larut dalam fase diam cair. Beberapa senyawa akan
lebih mudah larut dalam cairan dibanding yang lainnya. Senyawa yang lebih mudah larut akan
menghabiskan waktunya untuk diserap pada fase diam: sedangkan senyawa yang suka larut akan
menghabiskan waktunya lebih banyak dalam fase gas. Proses dimana zat membagi dirinya
menjadi dua pelarut yang tidak bercampurkan karena perbedaan kelarutan, dimana kelarutan

dalam satu pelarut satu lebih mudah dibanding dengan pelarut lainnya disebut
sebagai partisi.Sekarang, anda bisa beralasan untuk memperdebatkan bahwa gas seperti helium
tidak dapat dijelaskan sebagai pelarut. Tetapi, istilah partisi masih dapat digunakan
dalam kromatografi gas-cair. Anda dapat mengatakan bahwa substansi antara fase diam cair dan
gas. Beberapa molekul dalam substansi menghabiskan waktu untuk larut dalam cairan dan
beberapa lainnya menghabiskan waktu untuk bergerak bersama-sama dengan gas.
Waktu
retensi
Waktu yang digunakan oleh senyawa tertentu untuk bergerak melalui kolom menuju ke detektor
disebut sebagi waktu retensi. Waktu ini diukur berdasarkan waktu dari saat sampel diinjeksikan
pada titik dimana tampilan menunujukkan tinggi puncak maksimum untuk senyawa itu. Setiap
senyawa memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk senyawa tertentu, waktu retensi sangat
bervariasi dan bergantung pada:
Titik didih senyawa. Senyawa yang mendidih pada temperatur yang lebih tinggi daripada
temperatur kolom, akan menghabiskan hampir seluruh waktunya untuk berkondensasi sebagai
cairan pada awal kolom. Dengan demikian, titik didih yang tinggi akan memiliki waktu retensi
yang lama.
Kelarutan dalam fase cair. Senyawa yang lebih mudah larut dalam fase cair, akan
mempunyai waktu lebih singkat untuk dibawa oleh gas pembawa.. Kelarutan yang tinggi dalam
fase cair berarti memiiki waktu retensi yang lama.
Temperatur kolom. Temperatur tinggi menyebakan pergerakan molekul-molekul dalam
fase gas; baik karena molekul-molekul lebih mudah menguap, atau karena energi atraksi yang
tinggi cairan dan oleh karena itu tidak lama tertambatkan. Temperatur kolom yang tinggi
mempersingkat waktu retensi untuk segala sesuatunya di dalam kolom.
Untuk memberikan sampel dan kolom, tidak ada banyak yang bisa dikerjakan menggunakan titik
didih senyawa atau kelarutannya dalam fase cair, tetapi anda dapat mempunyai pengatur
temperatur. Semakin rendah temperatur kolom semakin baik pemisahan yang akan anda
dapatkan, tetapi akan memakan waktu yang lama untuk mendapatkan senyawa karena
kondensasi yang lama pada bagian awal kolom Dengan kata lain, menggunakan temperatur
tinggi, segala sesuatunya akan melalui kolom lebih cepat, tetapi pemisihannya kurang baik. Jika
segala sesuatunya melalui kolom dalam waktu yang sangat singkat, tidak akan terdapat jarak
antara puncak-puncak dalam kromatogram. Jawabannya dimulai dengan kolom dengan suhu
yang rendah kemudian perlahan-lahan secara teratur temperaturnya dinaikkan. Pada awalnya,
senyawa yang menghabiskan lebih banyak waktunya dalam fase gas akan melalui kolom secara
cepat dan dapat dideteksi. Dengan adanya sedikit pertambahan temperatur akan memperjelas
perlekatan senyawa. Peningkatan temperatur masih dapat lebih `melekatan` molekulmolekul fase diam melalui kolom.
Detektor
Ada beberapa tipe detektor yang biasa digunakan. Detektor ionisasi nyala dijelaskan pada bagian
bawah penjelasan ini, merupakan detektor yang umum dan lebih mudah untuk dijelaskan
daripada
detektor
alternative
lainnya.
Detektor ionisasi nyala
Dalam mekanisme reaksi, pembakaran senyawa organik merupakan hal yang sangat kompleks.
Selama proses, sejumlah ion-ion dan elektron-elektron dihasilkan dalam nyala. Kehadiran ion
dan elektron dapat dideteksi. Seluruh detektor ditutup dalam oven yang lebih panas dibanding
dengan temperatur kolom. Hal itu menghentikan kondensasi dalam detektor.

Jika tidak terdapat senyawa organik datang dari kolom, anda hanya memiliki nyala hidrogen
yang terbakar dalam air. Sekarang, anggaplah bahwa satu senyawa dalam campuran anda analisa
mulai masuk ke dalam detektor. Ketika dibakar, itu akan menghasilkan sejumlah ion-ion dan
elektron-elektron dalam nyala. Ion positif akan beratraksi pada katoda silinder. Ion-ion negatif
dan elektron-elektron akan beratraksi pancarannya masing-masing yang mana merupakan anoda.
Hal
ini
serupa
dengan
apa
yang
terjadi
selama
elektrolisis
normal.
Pada katoda, ion positif akan mendatangi elektron-elektron dari katoda dan menjadi netral. Pada
anoda, beberapa elektron dalam nyala akan dipindahkan pada elektroda positif; ion-ion negatif
akan memberikan elektron-elektronnya pada elektroda dan menjadi netral. Kehilangam elektronelektron dari satu elektroda dan perolehan dari elektroda lain, akan menghasilkan aliran elektronelektron dalam sirkuit eksternal dari anoda ke katoda. Dengan kata lain, anda akan memperoleh
arus listrik. Arus yang diperoleh tidak besar, tetapi dapat diperkuat. Jika senyawa-senyawa
organik lebih banyak dalam nyala, maka akan banyak juga dihasilkan ion-ion, dan dengan
demikian akan terjadi arus listrik yang lebih kuat. Ini adalah pendekatan yang beralasan,
khususnya jka anda berbicara tentang senyawa-senyawa yang serupa, arus yang anda ukur
sebanding dengan jumlah senyawa dalam nyala. Kekurangan utama dari detektor ini adalah
pengrusakan setiap hasil yang keluar dari kolom sebagaimana yang terdeteksi. Jika anda akan
mengrimkan hasil ke spektrometer massa, misalnya untuk analisa lanjut, anda tidak dapat
menggunakan detektor tipe ini. Hasil akan direkam sebagai urutan puncak-puncak; setiap
puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor. Sepanjang anda
mengontrol secara hati-hati kondisi dalam kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk
membantu mengidentifikasi senyawa yang tampak-tentu saja anda atau seseorang lain telah
menganalisa senyawa murni dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.
Area dibawah puncak sebanding dengan jumlah setiap senyawa yang telah melewati detektor,
dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui komputer yang dihubungkan dengan monitor.
Area yang akan diukur tampak sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar yang
disederhanakan. Perlu dicatat bahwa tinggi puncak tidak merupakan masalah, tetapi total area
dibawah puncak. Dalam beberapa contoh tertentu, bagian kiri gambar adalah puncak tertinggi
dan memiliki area yang paling luas. Hal ini tidak selalu merupakan hal seharusnya.. Mungkin
saja sejumlah besar satu senyawa dapat tampak, tetapi dapat terbukti dari kolom dalam jumlah
relatif sedikit melalui jumlah yang lama. Pengukuran area selain tinggi puncak dapat
dipergunakan dalam hal ini.
Perangkaian
kromatogram
gas
pada
spectrometer
massa
Hal ini tidak dapat dillakukan menggunakan detektor ionisasi nyala, karena detektor dapat
merusak senyawa yang melaluinya. Anggaplah anda menggunakan detektor yang tidak merusak.
Senyawa, Ketika detektor menunjukkan puncak, beberapa diantaranya melalui detektor dan
pada waktu itu dapat dibelokkan pada spektrometer massa. Hal ini akan memberikan pola
fragmentasi yang dapat dibandingkan dengan data dasar senyawa yang telah diketahui
sebelumnya pada komputer. Itu berarti bahwa identitas senyawa-senyawa dalam jumlah besar
dapat dihasilkan tanpa harus mengetahui waktu retensinya
OBSERVASI BIOTA PENGHASIL BIOTOKSIN DAN KUALITAS AIR
DI PERAIRAN BANJARMASIN

ABSTRAK
Telah dilakukan penelitian observasi biota penghasil biotoksin dan kualitas perairan di Perairan
Sungai Barito Banjarmasin, pada bulan Juni, Agustus dan Oktober 2003. Contoh diambil dari 9
stasiun, 3 stasiun berjarak 1 mil, 3 stasiun berjarak 2 mil dan 3 stasiun yang lainnya berjarak 3
mil dari pantai, sedangkan jarak antar stasiun adalah 1 mil. Parameter yang diamati meliputi
unsur hara dan kualitas air laut, jenis dan kelimpahan plankton serta kandungan saxitoksin pada
kerang yang ditangkap nelayan di lokasi studi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa di Perairan
Banjarmasin unsur haranya masih cukup baik dan jenis planton cukup banyak hanya
kelimpahannya masih rendah. Terdapat fitoplankton jenis dinoflagellata yaitu Dinophysis dan
Protoperidinium pada Perairan Banjarmasin walaupun tidak di semua stasiun dan dengan
kelimpahan yang masih rendah. Adapun kandungan saxitoksin pada kerang yang hidup di
perairan tersebut masih sangat rendah sehingga kerang masih aman untuk dikonsumsi.
PENDAHULUAN
Kekerangan merupakan makanan yang disukai oleh konsumen dalam dan luar negeri, serta
dipasarkan di warung pinggir jalan sampai restoran kelas internasional. Kerang-kerangan
mempunyai harga yang murah sampai yang mahal. Kekerangan juga merupakan produk
perikanan yang diekspor terutama ke Eropa yang mensyaratkan harus bebas dari semua jenis
marine biotoxin dan kandungan logam berat di bawah ambang batas. Kekerangan hidup melekat
benda-benda di dasar laut dan pada umumnya hidupnya tidak bergerak, atau bergerak sedikit
sekali dan sangat lambat. Makanan kerang adalah partikel halus baik yang tersuspensi maupun
yang mengendap di dasar perairan. Sebagai filter feeder, senyawa biotoksin dan logam berat
dapat terakumulasi dalam tubuh kerang tetapi dia sendiri tidak teracuni. Keracunan biotoksin
akibat makan ikan belum banyak dilaporkan di Indonesia, tetapi di Amerika Serikat dikatakan
bahwa keracunan makan ikan yang disebabkan oleh biotoksin ciguatera adalah sekitar 31%
(Bryan, 1987). Di Kalimantan Timur dilaporkan terjadi keracunan setelah makan kerang kepah
(Meristrix meristrix) pada bulan Januari 1988 (Setiapermana 1992). Hal ini menunjukkan bahwa
persentase keracunan biotoksin setara dengan keracunan akibat skromboid yang mencapai 33%.
Bean & Griffin (1990) juga melaporkan bahwa kejadian keracunan biotoksin dari fin fish adalah
80% dibandingkan dengan shellfish sebesar 9,8 %. Resiko terkena racun ciguatera lebih tinggi
apabila mengkonsumsi ikan karang herbivora atau carnivora. Peristiwa keracunan ciguatera telah
dialami oleh penduduk di kepulauan Mariana karena makan Morea laut (Gymnothoraxm
undulatus). Ikanikan yang mengandung ciguatera adalah bubara (Caranx sp), kakap merah
(Lutjanus sp), kerapu ( Plectropomus sp) (Ruyitno, 1982). Biotoksin yang terdapat pada ikan dan
kekerangan disebabkan karena adanya alga yang bersifat toksik. Paralytic Shellfish Poisoning
(PSP) telah meluas ke seluruh dunia dan spesies yang dominan dari dinoflagellata yang
menimbulkan PSP di Kanada adalah Alexandrium yang sering disebut Gonyaulax. Sedangkan
Neurotoxic Shellfish Poisoning (NSP) disebabkan oleh dinoflagelata Gymnodium, Ciguatera
Shellfish Poisoning (CSP) salah satunya disebabkan oleh Gambierdiscus dan Amnesic Shellfish
Poisoning (ASP) disebabkan oleh Pseudonitzchia. Peranginangin et al. (2001) melaporkan
kandungan okadaic acid (asam okadaat) pada ikan karang yang ditangkap di P. Seribu yang diuji
menggunakan alat HPLC. Ikan gigi jarang mengandung asam okadaat tertinggi terdapat dalam
isi perut yaitu 34,8 ppb, sedangkan pada daging hanya 16,3 ppb. Kandungan asam okadaat pada
kerang hijau dan kerang darah di Teluk Jakarta berturut-turut adalah 10,3 ppb dan 5,4 ppb,
kerang darah dari Sidoarjo sebesar 7,1 ppb dan kerang darah dari Lampung tidak terdeteksi.
Hasil penelitian tersebut mengindikasikan perlunya dilakukan monitoring secara terus menerus
terhadap perairan Indonesia mengingat jenis fitoplankton penghasil toksin telah ditemukan di

beberapa lokasi dan kandungan asam okadaat telah terdeteksi pada kerang dan ikan karang.
Namun demikian belum ada batas aman kandungan okadaat pada kerang untuk dikonsumsi
manusia. Penelitian biota penghasil toksin dan kualitas perairan di lokasi perairan Banjarmasin
perlu dilakukan sebagai dasar penentuan kebijakan dalam menentukan tindakan pengawasan
keamanan pangan bagi produk kekerangan. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui jenis dan
kelimpahan plankton terutama penghasil biotoksin di perairan Banjarmasin, Kalimantan Selatan.
BAHAN DAN METODE
Contoh diambil dari 9 stasiun : 3 stasiun di perairan laut sejauh 1 mil dari garis pantai, 3 stasiun
sejauh 2 mil dan 3 stasiun lain sejauh 3 mil dari garis pantai. Jarak antar stasiun adalah 1 mil.
Penetapan stasiun berdasarkan peta laut yang dikeluarkan oleh Dinas Hidro Oseanografi TNI AL,
No. 289 Edisi Januari 2002. Dari peta laut tersebut ditentukan posisi yang tepat untuk 9 stasiun,
kemudian posisi tersebut digunakan untuk penentuan pengambilan contoh di lapangan. Untuk
mencari posisi yang telah ditetapkan di laut digunakan alat Global Positioning System (GPS).
Pengamatan diulang 3 kali yaitu pada bulan Juni, Agustus dan Oktober 2003. Contoh yang
diambil adalah air laut (menggunakan alat water sampler), plankton (menggunakan alat
planktonet) dan kerang kepah (Meristrix meristrix) yang ditangkap oleh nelayan setempat. Posisi
pengambilan contoh di perairan di depan muara sungai Barito, Banjarmasin, Kalimantan Selatan
dapat dilihat pada Tabel 1. Parameter yang diamati adalah suhu dan oksigen terlarut (DO)
menggunakan DO meter, sedangkan untuk pH menggunakan PH meter. Analisis unsur hara air
laut meliputi nitrat, nitrit, fosfat amonia dan sulfur (menggunakan alat kolorimeter), sedangkan
analisis saxitoksin menggunakan HPLC (Kirschbaum et al.,1993).
Tabel 1. Stasiun lokasi pengambilan contoh di perairan Banjarmasin
Table 1. Sampling location at Banjarmasin waters
HASIL DAN BAHASAN
Hasil pengamatan terhadap kondisi fisik perairan di depan muara Sungai Barito disajikan pada
Tabel 2. Air laut yang diambil pada bulan Juni pada jarak 1 dan 2 mil sangat terpengaruh oleh air
sungai sehingga salinitasnya cukup rendah. Hal tersebut kemungkinan disebabkan oleh
bertiupnya angin darat, tetapi pada jarak 3 mil salinitasnya cukup tinggi yakni sekitar 27- 36 ppt.
Pada pengambilan contoh bulan Agustus pengaruh sungai terjadi sampai jarak 1 mil, hal ini
kemungkinan disebabkan karena bertiupnya angin tenggara yang mengakibatkan air sumber
penduduk di sekitar aliran sungai menjadi asin dan tidak dapat digunakan sebagai air minum.
Pada bulan Oktober salinitas air laut kembali menurun, karena pengaruh air hujan. Nilai pH air
laut pada bulan Juni dan Oktober pada jarak satu dan dua mil di bawah 8,0, sedangkan yang
berjarak 3 mil sudah melebihi 8,0. Kelarutan oksigen cukup bagus, di atas ambang batas minimal
yang ditentukan (3 mg/l), dan perairan tidak begitu jernih cenderung berlumpur. Pantai perairan
Banjarmasin landai dengan kedalaman hanya sekitar 3 m.
Tabel 2. Kondisi fisik air laut di perairan di depan muara sungai Barito, Banjarmasin
Table 2. Physical condition of seawater at Barito Estuary in Banjarmasin
Tabel 3. Kelimpahan fitoplankton di perairan Muara S. Barito, Banjarmasin pada bulan Juni
Table 3. Phytoplankton abudance at Barito Estuary Water Banjarmasin in June
Kelimpahan fitoplankton di perairan Banjarmasin pada bulan Juni disajikan pada Tabel 3. Dari
Tabel 3. Fitoplankton yang terdapat di perairan Banjarmasin adalah dinoflagellata jenis
Protoperidinium (Gambar 1) dan Dinophysis (Gambar 2) pada bulan Juni dan bulan Agustus

(Tabel 5) tetapi pada bulan Oktober Dinophysis tidak ditemukan (Tabel 7). Jumlah kedua jenis
dinoflagellata tersebut masih cukup rendah (kurang dari 1 x 106) sehingga belum
mengkawatirkan. Terdapat 15-18 jenis genus baciallariophyceae, tetapi jenis ini tidak
menghasilkan toksin dan jumlahnya masih cukup rendah. Dalam pengambilan contoh plankton
air laut terikut juga zooplankton dalam jumlah relatif sedikit. Jenis yang terikut yaitu silliata,
krustasea, ekinodermata, moluska, sagittoidea, tentakulata, urokordata dan larva (Tabel 4). Pada
pengambilan contoh bulan Agustus jenis yang tertangkap hampir sama dengan contoh bulan Juni
tetapi tidak terdapat tentakulata (Tabel 6). Sedangkan pada contoh bulan Oktober terdapat 6
genus yaitu silliata, krustacea, moluska, sagittoidea, urokordata dan larva trochopore (Tabel 8).
Gambar 1. Protoperidinium

Gambar 2. Dinophysis

Tabel 4. Kelimpahan Zooplankton di perairan Banjarmasin pada bulan Juni


Table 4. Zooplankton abundance at Banjarmasin waters in June
Tabel 5. Kelimpahan fitoplankton di perairan Banjarmasin pada bulan Agustus
Table 5. Phytoplankton abundance at Banjarmasin waters in August
Hasil analisis unsur hara dan BOD perairan Banjarmasin disajikan pada Tabel 9.
Tabel 9. Hasil analisis unsur hara di depan muara Sungai Barito di Banjarmasin
Table 9. Nutrients concentration at Barito Estuary in Banjarmasin water
Kandungan amonia terendah terjadi pada bulan Juni sedangkan kandungan amonia tertinggi
pada bulan Oktober. Kandungan nitrit pada contoh air laut tertinggi terjadi pada bulan Juni dan
terendah pada bulan Oktober. Meskipun demikian bila mengacu pada batas maksimum yang
diijinkan, kadar yang tinggi tersebut masih di bawah ambang batas. Kandungan ammonia dan
nitrit di perairan Banjarmasin sangat rendah mendekati nol, begitu juga kandungan nitrogen dari
nitrat tidak sebanyak kandungan fosfatnya kemungkinan tidak terjadi blooming. Perairan
dikatakan subur apabila perbandingan antara N dari nitrat dan P adalah 1 : 5. Apabila nitrat
sangat tinggi kemungkinan terjadi pertumbuhan plankton yang cukup tinggi. Kadar sulfat hampir
tidak ada, tetapi kandungan fosfatnya berfluktuasi dan tertinggi pada bulan Agustus. Hasil
analisis kandungan saksitosin disajikan pada Tabel 10.
Tabel 10. Kandungan saxitoksin pada kerang kepah (Meritrix meritrix) dari Banjarmasin
Table 10. Saxitoxine content of Meritrix meritrix from Banjarmasin waters.
Kandungan saxitoxin pada kerang kepah yang dianalisis dengan menggunakan HPLC ternyata
masih cukup rendah yaitu sekitar 1,43-3,32 ppb (batas maksimal 80 ppb). Hal ini kemungkinan
berasal dari plankton Dinophysis dan Protoperidinium, yang termakan oleh kerang. Batas
kandungan maksimal saxitoksin yang diperbolehkan adalah 80 mg/kg (Setiapermana, 1992).
KESIMPULAN
Hasil penelitian menunjukkan bahwa perairan Banjarmasin salinitasnya sangat dipengaruhi oleh
Sungai Barito dan angin tenggara. Adapun unsure haranya masih cukup baik dan jenis plankton
cukup banyak hanya kelimpahannya cukup rendah. Jenis dan jumlah plankton bervariasi pada
setiap pengambilan contoh. Plankton yang kemungkinan mengandung saxitoksin adalah jenis
dinoflagellata Dinophysis dan Protoperidinium, ditemukan tidak pada semua stasiun yang di
ambil contohnya. Kelimpahannya masih relatif rendah yaitu kurang dari 1 x 106. Kandungan
saxitoksin pada kerang yang hidup di perairan tersebut masih sangat rendah di bawah ambang
batas (80 ppm), sehingga masih aman untuk dikonsumsi.

BAB II
PROSEDUR KERJA

a.
1.
2.
3.
4.

2.1. Alat dan Bahan


a. Alat yang digunakan
- Satu set peralatan GC
- Kertas saring Whatman
- Erlenmeyer
- Gelas ukur
- Labu untuk tekanan vakum
- Pompa vakum
- Corong
- Botol semprot
- Pipet volum
- Stirer
b. Bahan yang digunakan
- Sampel
1. Metanol
2. Etanol
3. Iso Propil Alkohol
4. Amil Alkohol
- Aquadest
2.2. Prosedur Kerja.
Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah :
Persiapan Sampel
Memipet 50 ml sampel lalu masukkan ke gelas ukur.
Menyaring sampel tersebut dengan system vakum (sebelumnya alat dibilas dengan aquades).
Kemudian hasil saringan dicampurkan dengan larutan yang telah disediakan asisten.
Menghomogenkan kedua larutan tersebut ,dengan cara menggetarkan botol pada alat stirrer.

b. Penyiapan Larutan Standard


1. Memipet larutan standard methanol dengan menggunakan pipet volum (10l) sebanyak 15 kali
(untuk standart 15:15)
2. Melakukan langkah 1 untuk larutan etanol,iso propil alcohol (dengan pipet volum yang berbeda.
3. Menghomogenkan larytan dengan stirrer.
c.
1.
2.
3.
4.
5.

Injeksi larutan standard.


Mengecek dan menghidupkan alat
Membuka aliran gas dari tabung gas.
Mengidupkan kompresor.
Menginjeksikan sampel sebanyak 2 l.
Mengamati hasil pada detektor.

d. Injeksi Sampel.
Melakukan langkah seperti injeksi pada larutan standard untuk larutan sampel.
http://instrumentituasyiklhoo.blogspot.com/2012/05/laporan-hplc.html