ARTICULO DE REVISION

PRUEBAS DIAGNSTICAS DE LABORATORIO

PARA DETECTAR INFECCIONES POR EL VIRUS
INFLUENZA AH1N1
Lic. Tecnlogo Medico David G. Quispe Aranda
Especialista Laboratorio Clnico y Anatoma Patolgica

INTRODUCCION
Desde la primera deteccin del virus AH1N1
en nuestra poblacin a la situacin actual, el
comportamiento epidemiolgico de este ha
cambiado rpidamente. En nuestro pas, en el rea
metropolitana y rural actualmente el virus circula
ampliamente en la poblacin, con elevada
diseminacin sobre todo en nios en edad escolar y
adultos mayores.
El nmero de personas que entran en
contacto con el virus incrementa diariamente. En
funcin de estos hechos el diagnstico del nuevo
virus de influenza A (H1N1), se reserva para
aquellos pacientes con infecciones moderadas o
graves que requieran internacin o que pertenezcan
a los grupos de riesgo.

La confirmacin diagnstica de la infeccin

por el virus de influenza A (H1N1), requiere el
empleo de tcnicas complejas de referencia como el
cultivo viral o la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR). Por el importante retraso que
implica el cultivo viral (das), las tcnicas ms
recomendables son las basadas en la deteccin de
material genmico principalmente PCR en tiempo
real (RT-PCR), que pueden ofrecer resultados en
horas.
En la actualidad hay una variedad de
pruebas disponibles para detectar los virus de la
influenza. Las ms comunes se denominan
"pruebas de diagnstico rpido de la influenza" y
pueden realizarse en ambientes ambulatorios. Estas
pueden arrojar resultados en 30 minutos o menos.

Desafortunadamente, la capacidad de estas

pruebas para detectar la influenza puede variar
considerablemente. Estas se basan en la deteccin
de antgenos virales, pero
no permiten el
diagnostico especifico de subtipos virales y tiene
una sensibilidad limitada en comparacin con las
pruebas de referencia que son ms precisas y
sensibles y se realizan
en laboratorios
especializados, como los que se encuentran en los
hospitales nacionales o los laboratorios de salud
pblica.
El Ministerio de Salud ha dispuesto la
descentralizacin del diagnstico, de acuerdo con
las capacidades existentes en cada lugar, es por
eso que en nuestro medio, la inmunofluorescencia
indirecta tiene una alta correlacin, cercana al 90 %,
con las muestras procesadas por RT-PCR en tiempo
real, no as la inmunofluorescencia directa. Por lo
tanto se puede hacer vigilancia estacional y
screening de ser necesario. En este caso se enva
a los laboratorios referenciales especializados que
correspondan los positivos de AH1N1 y 10 % de los
negativos.
La muestra idnea para la deteccin del
virus de la gripe A es un aspirado nasofarngeo
obtenido en los tres das que siguen a la aparicin
de los sntomas tambin pueden utilizarse
hisopados nasofarngeos; porque el virus replica con
altos ttulos en las cavidades nasales y en la
garganta. An no se dispone de informacin acerca
del valor diagnstico en muestras no respiratorias,
como por ej.: materia fecal. Los sueros obtenidos de
fase aguda y convaleciente podran ser utilizados
para demostrar el aumento del ttulo de anticuerpos
especficos.
Los factores que podran contribuir a una
menor sensibilidad en las pruebas de laboratorio
para detectar el virus de la nueva gripe A (H1N1),
incluyen: el tipo de muestra respiratoria, la calidad
de la muestra, el tiempo de aparicin de la
enfermedad a la recogida de muestras, la edad del
paciente, el tiempo de la recogida de muestras para
las pruebas, y el almacenamiento (4-8C). No se
deben utilizar los hisopos de algodn con mango de
madera. No son aceptables las muestras
coleccionadas con hisopos hechos con alginato de
calcio.

La sensibilidad de la RIDTs para detectar

virus de la gripe B son ms bajas que para la
deteccin del virus de la gripe A.
La especificidad de RIDT es generalmente alta. Sin
embargo, especialmente en los perodos de baja
actividad de influenza (ej.: al comienzo o final de la
estacin) pueden ocurrir falsos positivos; por lo
tanto, un resultado positivo por un mtodo rpido
requiere la confirmacin por cultivo o RT-PCR en
tiempo real.
Cuando se utilicen los ensayos RDIT, el informe
debe ir acompaado de alguna explicacin que

DETECCIN RPIDA DE ANTGENOS

A. PRUEBAS DE DIAGNSTICO RPIDO DE
INFLUENZA o (Rapid Diagnostic Influenza Test
-RDITs)
Se basan en la deteccin de un antgeno
viral
mediante
inmunocromatografia
o
inmunoanlisis, detectan la nucleoprotena (NP) del
virus Influenza A (protena altamente conservada) y
se caracterizan porque permiten obtener un
resultado en un tiempo menor a 30 minutos y
pueden ser realizados en el centro de atencin del
paciente. Permiten tomar decisiones en el momento
y orientan al mdico acerca de la conducta a seguir
con cada paciente. Se dispone de varios ensayos de
distintos proveedores, algunos permiten:
1. Detectar ambos virus de Influenza A y B sin
diferenciarlos, pero ninguno de los RDIT
permite distinguir entre los subtipos (H1N1 y
H3N2 estacionales), ni proveer informacin
acerca de la sensibilidad a los antivirales.
2. Deteccin nica del virus de la gripe A.
Las pruebas rpidas varan en su capacidad para
detectar los virus de la influenza y son ms eficaces
para detectar la influenza en nios que en adultos.
Estos ensayos presentan sensibilidad baja a
moderada (10-70%) en la deteccin de Influenza
estacional en muestras respiratorias, si se compara
con el cultivo o a la RT-PCR.
Cuando el virus de influenza circula en la
comunidad (alta prevalencia), un resultado positivo
indica que probablemente el virus est presente en
la muestra. Saber si es Influenza A o B puede
orientar la conducta mdica a seguir. Un resultado
negativo no asegura la ausencia de infeccin.
Existen los resultados falsos negativos, y si la
sospecha de que el paciente puede estar infectado
es alta, deben implementarse las medidas de control
y/o tratamiento del paciente, independientemente
del resultado negativo de la prueba.

oriente al mdico en la conducta a seguir.

Un resultado RIDT negativo no descarta la

infeccin por el virus de la gripe A (H1N1)
B. ANLISIS DE INMUNOFLUORESCENCIA
Un mtodo muy extendido y sensible para el
diagnstico de las infecciones por los virus de la
gripe A y B y otros cinco virus respiratorios de
importancia
clnica.
El
anlisis
de
inmunofluorescencia puede utilizarse para la
deteccin de virus en muestras clnicas o en cultivos
celulares. Son preferibles las muestras clnicas,
obtenidas lo antes posible tras la aparicin de los
sntomas, ya que el nmero de clulas infectadas
presentes disminuye durante el curso de la
infeccin.
Inmunofluorescencia indirecta (IFI)
Esta tcnica permite distinguir entre los virus
Influenza A y B. Si da positivo para Influenza A por
IFI, ese paciente pasa a considerarse un caso
sospechoso. No diferencia el virus AH1N1 del de la
Influenza
A
estacional.
La
tcnica
de
inmunofluorescencia requiere calidad de muestra
clnica, pericia del operador, la sensibilidad y
especificidad de la tcnica para este nuevo virus no
se conocen an. Por lo tanto, un resultado negativo
no debe ser asumido como diagnstico definitivo
para el nuevo virus. El resultado se obtiene en horas
de tomada la muestra.

CULTIVO DE VIRUS

REACCIN EN CADENA DE LA
POLIMERASA EN TIEMPO REAL
(RCP-TR)

El cultivo celular puede utilizarse para

detectar virus respiratorios de importancia clnica.
El aislamiento de virus es una tcnica sensible que
presenta la ventaja de que el virus est disponible
tanto para la identificacin como para la ulterior
caracterizacin antignica, gentica y la preparacin
de vacunas. La lnea celular preferida para el cultivo
de virus de la gripe es la MDCK (Madin Darby
Canine Kidney Cells).

Esta tcnica detecta y cuantifica mRNA en

muestras pequeas. El diagnstico molecular es
actualmente el mtodo de eleccin para la deteccin
y caracterizacin del virus de la influenza A (H1N1).
Consiste en la deteccin del genoma viral (ARN)
directamente en muestras clnicas o luego del
cultivo de dichas muestras clnicas.

Los cultivos gripales positivos exiben los

efectos citopticos como resultado de la replicacin
Viral a partir de los 5 das posteriores a la infeccin,
pero es preciso identificar el virus por un anlisis de
inmunofluorescencia
utilizando
anticuerpos
monoclonales
especficos
o
bien
por
hemaglutinacin (HA) y anlisis antignico
(determinacin del subtipo) por inhibicin de la
hemaglutinacin (IHA) utilizando antisueros de
referencia seleccionados en el medio de cultivo
celular (sobrenadante).

El uso de ensayos de amplificacin genmica que

estn diseados para detectar ms de un gen viral
son los ms apropiados para una correcta
identificacin. Entre los genes blanco para la
amplificacin son importantes:
El gen de la matriz (M) de influenza tipo A,
El gen de hemaglutinina (HA) especfico
para el virus A (H1N1)
Los genes de HA especficos de influenza A
estacional (H1/H3).

Todas las muestras positivas por RT-PCR en

tiempo real y un 10 % de las muestras negativas
(para
estudios
de
vigilancia
virolgica
/
epidemiolgica) son cultivadas en monocapas de
clulas MDCK, se incuba en una estufa a 37C con
5% de CO2 y atmsfera hmeda durante 7 das. Las
monocapas celulares inoculadas se observan
diariamente al microscopio ptico invertido, para
detectar la aparicin del efecto citopatico viral.
Los cultivos con efecto citopatico positivo o las
clulas sin el al final del perodo de incubacin (7
das) se cosechan (clulas + sobrenadante) y se
extrae el ARN por RT-PCR en tiempo real.

Esta es una potente tcnica para la

identificacin de genomas del virus . El genoma del
virus es un ARN de hebra nica; en primer lugar hay
que sintetizar una copia de ADN (ADNc) utilizando
una
polimerasa
de
transcripcin
inversa
(transcriptasa inversa, TI). El procedimiento de
amplificacin del genoma de ARN (RCP -TI)
requiere un par de oligonucletidos cebadores. Los
pares de cebadores se disean en funcin de la
secuencia conocida del gen HA de los subtipos de
gripe A y del N1, y amplifica especficamente el ARN
de un solo subtipo. Los ADN generados mediante
cebadores especficos de cada subtipo pueden
despus analizarse utilizando tcnicas de gentica
molecular como la secuenciacin.

Si el resultado es:
- positivo, el virus detectado debe ser tipificado.
- negativo, se informa.
El aislamiento del virus de influenza A (H1N1) es
diagnstico de infeccin. Los resultados se pueden
obtener entre 7 a 10 das por lo que no es til para
el manejo clnico. Un cultivo negativo no excluye
infeccin por el nuevo virus. Para el diagnstico del
virus de influenza A (H1N1) se realiza el cultivo y
secuenciacin del genoma.

La prueba de RT-PCR puede ser positiva para

influenza A pero negativa para los subtipos
estacionales H1 y H3. En ese caso se debe
confirmar la presencia del nuevo virus de influenza A
(H1N1) con un RTPCR especfica.

El tiempo aproximado para tener el resultado es de

24 horas a partir de hisopados clnicos o de cultivos
de clulas infectadas pero el protocolo de la OMS
indica repetir las determinaciones negativas a fin de
confirmar el diagnstico por lo que se requiere un
tiempo adicional.
- Un resultado positivo indica que el paciente est
presuntivamente infectado con el nuevo virus de
influenza pero no se identifica el estadio de la
infeccin.
- Un resultado negativo, no excluye la posibilidad
de que el virus este presente.
Limitaciones
Los analistas deben estar entrenados y
familiarizados con los procedimientos de
muestreo y la interpretacin de los resultados
previo a la realizacin de la prueba.
Un resultado falso negativo puede ocurrir si
existe
una
cantidad
inadecuada
de
organismos presentes en la muestra debido a
una recoleccin, manejo o transporte
inapropiados.
Un resultado falso negativo puede ocurrir si
hay un exceso de plantilla de DNA/RNA en la
reaccin.

La deteccin de Ac especficos en el suero

de pacientes infectados se puede realizar mediante
ensayos de inhibicin de la hemoaglutinacin (IHA),
microneutralizacin (NV) e
inmunoanlisis
enzimtico .
Estos ensayos deberan ser capaces de detectar la
respuesta de Ac luego de la infeccin por este virus.
Las pruebas en sangre serolgicas en fases aguda
(dentro de 1 semana de inicio de la enfermedad) y
de convalecencia (recogidas 2-3 semanas ms
tarde) pueden ayudar a de establecer un diagnstico
retrospectivo de la infeccin por virus de la gripe
para
los
estudios
epidemiolgicos
y
de
investigacin.
El aumento de 4 veces del ttulo de anticuerpos ante
el virus Influenza A (H1N1), en una segunda
serologa a los 10-14 das. A pesar ser una prueba
cuyo resultado se obtiene de forma tarda, la
presencia de hasta un 10% de falsos negativos en la
deteccin de PCR en tiempo real en las muestras
respiratorias, hace necesaria esta determinacin
serolgica, especialmente en los casos de sospecha
clnica en los que la PCR en tiempo real resulte
negativa, y se considere necesario conocer la
positividad.

IDENTIFICACIN SEROLGICA
Los ensayos serolgicos son mtodos
diagnsticos indirectos que detectan los anticuerpos
(Ac) que pueden estar presentes en el suero de
pacientes que han sido infectados con este virus.
Se considera que dos sueros, uno de la fase aguda
y otro de fase convaleciente podran ser utilizados
para detectar el aumento en el ttulo de anticuerpos
especficos que resulten indicadores de infeccin
reciente.

A. INHIBICIN
(IHA)

DE

LA

HEMOAGLUTINACIN

El virus Influenza A (H1N1) puede aglutinar

glbulos rojos de humano, cobayo, pollo y pavo en
reacciones de hemoaglutinacin. Por lo tanto, la
IHA, es una tcnica que podr ser utilizada para la
deteccin de niveles de Ac especficos en el suero
de un paciente que ha sido infectado.

B. MICRONEUTRALIZACIN (NV)

Los Ac neutralizantes especficos presentes en el

suero de un paciente pueden neutralizar o reducir la
infectividad del virus. Esta neutralizacin de la
infectividad se visualiza mediante la reduccin del
nmero de placas virales (unidades formadoras de
placas, UFP) que se obtienen luego de enfrentar un
nmero fijo de UFP frente a diluciones del suero del
paciente en estudio y posterior infeccin de
monocapas celulares. La reduccin del nmero de
UFP virales detectadas en presencia del suero de
un paciente es indicador de la presencia de Ac
especficos en el mismo. Un aumento de 4 veces o
ms en el ttulo de Ac especficos para el virus
Influenza A (H1N1), resultara indicador de infeccin
reciente.

CONCLUSIONES
En la actualidad como hemos visto se disponen
de diferentes tipos de pruebas diagnsticas para
detectar la presencia de virus de Influenza en
muestras respiratorias, incluyendo pruebas de
deteccin antignica, aislamiento de virus en cultivo
celular o deteccin de cidos nucleicos especficos
mediante PCR. Estas pruebas difieren en cuanto a
su sensibilidad y especificidad, su disponibilidad
comercial, el tiempo necesario para obtener
resultado y su capacidad para distinguir entre
diferentes tipos de virus gripales ( A, B o C) o
subtipos de virus A ( nuevo virus pandmico H1N1 o
virus estacional H3N2, etc). La deteccin de
anticuerpos en suero frente a virus griaples requiere
la recogida de sueros pareados con al menos dos
semanas de intervalo, por lo que no tiene inters
clnico, aunque puede ser til para diagnostico
retrospectivo de la infeccin en estudios
epidemiolgicos.
Considerando la mayor validez y relativa rapidez
de las tcnicas de deteccin genmica (PCR) estas
seran las pruebas ideales para el diagnstico de la
nueva gripe pandmica. A pesar de la reconocida
falta de estandarizacin de estas tcnicas, existe
informacin suficiente como para aceptar la validez
de sus diagnsticos. No obstante, en una situacion
epidmica, resulta inviable su uso masivo, al menos
como prueba de diagnstico clnico generalizado.
Por ello tendremos que considerar criterios de coste
y utilidad para la seleccin de pacientes candidatos
a su empleo. Por lo tanto en la mayora de los
pacientes con sospecha de gripe, la alternativa a
considerar al diagnstico clnico emprico es el
empleo de pruebas de diagnstico rpido, que si
bien no permiten identificar el subtipo de virus,
podran orientar en el manejo del paciente.

Aunque no es un criterio
diagnstico, es caracterstica en
las formas graves la presencia de
niveles elevados de CPK y LDH.
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