Apoptosi

v Vogt, 1842: la morte cellulare parte del normale sviluppo

v Lockshin and Williams, 1965: propongono il termine morte
cellulare programmata (Programmed Cell Death, PCD)
osservando che alcune cellule destinate a morire
durante la metamorfosi di anfibi e insetti sembrano essere
guidate da un programma intrinseco alla cellula stessa
v Kerr, Wyllie and Currie, 1972: introducono il termine
apoptosi (dal greco antico: come il cadere delle foglie) per
descrivere la morte cellulare associata con una serie di
caratteristiche morfologiche comuni e ben definite
v Horvitz and Sulston, fine degli anni 70: caratterizazione
genetica dei componenti critici che regolano i meccanismi
apoptotici utilizzando il nematode C.elegans (premio Nobel
per la medicina 2001)

Lo studio dellapoptosi in C. elegans

vDurante lo sviluppo di C. elegans, si formano

1090 cellule: di queste, 959 resteranno a
far parte del verme adulto (postmitoticamente), e 131 vanno incontro ad
apoptosi.
vRicerca di mutazioni in cui il pattern di
morte cellulare alterato: identificazione
di regolatori apoptotici poi ritrovati anche
in mammiferi

 Ced-3 e ced-4: mutazioni che li

inattivano portano alla
conservazione di tutte e 131 le
cellule condannate a morte

Ced-9: mutazioni che inattivano

ced-9 portano a morte cellulare
estesa a tutte le cellule, livelli
aumentati di espressione di ced-9
bloccano lapoptosi.

Apoptosi
un suicidio che implica una reazione attiva della
cellula
pu verificarsi sia in seguito a stimoli esterni (agenti
chimici, fisici, ormoni, citochine, farmaci) che a
stimoli endogeni (turnover cellulare,
differenziamento terminale, rimodellamento
durante sviluppo e morfogenesi)

Evoluzione dellapoptosi

vLapoptosi esiste in tutti gli organismi pluricellulari

vOrganismi monocellulari: presente in forme pi o
meno simili anche nei batteri, forse in difesa
contro infezioni virali (che a loro volta hanno
escogitato numerosi mezzi per inattivare il
programma apoptotico endocellulare)

Peculiarit del processo apoptotico:

una cascata di reazioni si susseguono in un ordine

stereotipato al fine di terminare la vita cellulare
molte di queste reazioni sono bloccabili in punti ben
precisi sia dallesterno (agenti farmacologici o
inibitori di natura sintetica) che dallinterno
(modulazione di geni endogeni)
i residui cellulari restano vengono eliminati
rapidamente da fagociti, professionali e non,
evitando linnesco di una reazione infiammatoria

Un problema esistenziale:
Perch una cellula dovrebbe suicidarsi?

A volte la morte cellulare rappresenta un evento positivo per lorganismo

1. Lapoptosi richiesta per un normale

sviluppo embrionale
2. Lapoptosi necessaria per la distruzione
di cellule che rappresentano una minaccia
per lintegrit dellorganismo

Apoptosi, sviluppo embrionale e differenziamento

vMetamorfosi: il riassorbimento della coda

del girino
vSviluppo: apoptosi delle cellule occupanti lo
spazio interdigitali, formazione delle
appropriate sinapsi neuronali;
vDifferenziamento: turnover fisiologico delle
cellule mature in tessuti continuamente
proliferanti (p.es., cellule intestinali, neutrofili)

Apoptosi e difesa dellorganismo

vContro cellule infettate da virus (ad opera

di linfociti T citotossici);
vContro cellule del sistema immune
autoreattive;
vContro cellule in cui si verifica un danno al
DNA;
vContro cellule tumorali.

Caratteristiche morfologiche dellapoptosi

Diminuzione del volume cellulare (perdita di liquidi

intracellulari per processi attivi mediati dalle
pompe di membrana)
Condensazione e marginalizzazione della cromatina e
frammentazione della stessa
Formazione di protuberanze (blebs) citoplasmatiche,
delimitate da membrana (esposizione di PS) e
contenenti frammenti di cromatina condensata e
di organelli cellulari -> corpi apoptotici

La cellula in apoptosi subisce modificazioni

morfologiche e biochimiche che portano alla sua
frammentazione e ne favoriscono la fagocitosi

normali

apoptotiche

La scale.a di DNA frammentato di

una cellula apopto8ca

Normal Cell
Cell shrinkage away
from neighbouring cells
Plasma membrane blebbing
Cytoplasmic and nuclear condensation
Margination of condensed
chromatin

Nuclear and cellular

fragmentation
Apoptotic Bodies

Phagocytosis

Dierenze morfologiche fra apoptosi e necrosi

Membrane
breaks down
resulting in an
inflammatory
response!

Edema!

Membrane
intact until
phagocytosed !

Pyknosis!

Morphological Differences between Apoptosis and Necrosis

Apoptosis

vs

Necrosis

Nuclei

Dense Condensation of
Chromatin

Irregular Chromatin
Clumping

Cytoplasmic
Organelles

Morphologically Intact

Disrupted

Cell Membrane

Apoptotic Bodies,
Blebbing

Blebbing and Loss of

integrity

Cell Volume

Cells shrink

Cells swell

In Tissues

Single Cells Affected

Groups of Cells Affected

Tissue Response

None

Inflammation

Necrosi vs apoptosi

Distruzione causata da una bomba

(Nagasaki, 1945)

Demolizione di un rudere

Che cosa succede quando

lapoptosi non funziona?

Il KO per Apaf-1 arresta lo sviluppo

embrionale

Mancanza di apoptosi interdigitale

Mancanza di aLvazione della

caspasi 3

Diminuita apoptosi in vitro di cellule

Apaf-1 -/-

Ruolo dellapoptosi nella tumorigenesi

Aumento della sopravvivenza cellulare e riduzione dellapoptosi nelloncogenesi

mutatazione di geni oncosoppressori p53 (50% dei tumori umani )

Iperespressione di Bcl-2 in alcune leucemie and linfomi B.

Perdita di espressione del fattore attivante lapoptosi (Apaf-1) nel melanoma

Malattie Associate a deregolazione dell Apoptosi

Aumento Apoptosi
AIDS
Malattie Neurodegenerative
malattia di Alzeheimer,
Morbo di Parkinson,
Malattia di Huntington

Inhibizione Apoptosi
Cancro
linfoma Follicolare
carcinomi con mutazione di p53
Malattie Autoimmuni
Lupus erytematoso Sistemico
Infectioni Virali
Herpesvirus, poxvirus, adenovirus

Ruolo dell apoptosi nelle Malattie Neurodegenerative

Apoptosi fisiologica durante lo sviluppo embrionale del
cervello innescata dallassenza di fattori di crescita
Tossicit di aggregati di proteine con anomalie strutturali
possono innescare apoptosi nella malattia di
Alzeheimer, nel morbo di Parkinson, nella malattia di
Huntington (Caspasi 9 attivata nel cervello degli alzheimeriani)
amyloid-

IC Ca2+
Oxidative stress

Neuronal
Receptors

Apoptosis

Aggregati -Huntington

FADD/
Caspase 8

Apoptosis

Le fasi del programma apoptotico

1. Decisione se iniziare o meno la procedura
di suicidio cellulare
2. Passaggio del punto di non
ritorno (commitment)
3. Lesecuzione

Via intrinseca

Via estrinseca

La decisione ed il passaggio del punto

di non ritorno
v Proteine regolatorie hanno il compito di
integrare i segnali pro- ed anti-apoptotici, e a
seconda delle circostanze intra- ed extra-cellulari
avviare o meno lesecuzione
1. Adattatori, in grado di trasdurre direttamente
segnali apoptotici agli esecutori
2. Regolatori della funzionalit mitocondriale
(membri della famiglia Bcl-2)

Il mitocondrio
Fasi precoci -> mantenimento della funzionalit
mitocondriale
Rilascio di proteine normalmente residenti
allinterno del mitocondrio (citocromo c, Smac,
HtrA2/Omi, AIF)
Caduta del potenziale di membrana mitocondriale
e perdita della permeabilit della stessa (caspasimediata)
Collassamento e/o fissione dei mitocondri

Il citocromo c
normalmente risiede nello spazio fra la membrana interna ed
esterna mitocondriale e funziona nel pathway respiratorio
mitocondriale
viene rilasciato dai mitocondri nel cytosol dopo stimoli apoptotici
forma un complesso con Apaf-1 (lomologo di Ced-4) e procaspasi 9
(inattiva) in presenza di ATP -> apoptosoma, che porta ad autoattivazione della procaspasi 9 -> innesco della fase di esecuzione
il rilascio precede i cambiamenti morfologici, un fenomeno del
tipo tutto-o-nulla ed rapidissimo e sincrono (meno di 5 minuti)
varie ipotesi per la via duscita: Bax-channels, megacanale
mitocondriale (o PTP, permeability transition pore)

apoptosoma
Apaf-1
WD-40 Repeats
CARD CED-4

dATP

*cytochrome c

dADP

Pro-caspase-3/-7

Apaf-1
unfolding

Pr
o

L
S

* *
S

CARD

CARD

*
L

Pro-caspase-9

Active
caspase-9

Active
caspase-3/-7

Altre proteine rilasciate dal mitocondrio

vSmac/Diablo
vHtrA2/Omi
v AIF: proteina dello spazio intermembrana ->
nucleo -> cambiamenti nella morfologia nucleare
associati allapoptosi (caspasi-indipendente)
Coinvolto nellapoptosi solo in seguito a particolari
stimoli (necessario per la cavitazione nei primi
stadi embrionali)
v EndoG: proteina dello spazio intermembrana ->
nucleo -> cambiamenti nella morfologia nucleare
associati allapoptosi

CITOPLASMA

NUCLEO

ICAD
ICAD

CAD

caspasi-3

CAD

Frammentazione DNA

EndoG

AIF

HMW + oligonuclosomi

Condensazione croma8na +HMW

Regolazione mitocondriale da parte della Bcl2 family

membri pro-apoptotici si legano
al PTP > apertura > rilascio
del citocromo c
membri anti-apoptotici si legano
al PTP | apertura

BH3-only inducono la
oligomerizzazione di Bax o Bak sul
mitocondrio > canale > rilascio
del citocromo c
membri anti-apoptotici |
oligomerizzazione e formazione del
canale

La rimozione dei cadaveri

Pathways anti-apoptotici

Altre forme di morte cellulare

Necroptosi, entosi

La necroptosi
Innescata da s8moli che pi frequentemente
inducono apoptosi:
legame di un ligando ai death receptors (processo quindi
regolato)

Non richiede fuoriuscita di citocromo C, n aLvazione

di caspasi n coinvolge Bcl2 family
La membrana cellulare perde permeabilit, non c
frammentazione nucleosomale del DNA, c perdita di
funzionalit mitocondriale
tuL fenomeni simili alla morte per necrosi

Possibili meccanismi molecolari

Danno cellulare che aLva s8moli pro-
apopto8ci (p.es. aLvazione dei death
receptors)
cellula che avvia il processo apopto8co

Contemporaneamente, il danno cellulare

porta a disfunzione mitocondriale e perdita del
pool di ATP
lapoptosi non pu procedere, e quindi la cellula
prosegue il suo cammino verso la morte per
necrosi

Ladesione cellulare pu portare alla

inges8one di una cellula da parte della
vicina

Cara.eris8che dellentosi
Ladesione intercellulare (mediata da caderine ed altre
molecole) regolata dallinterazione delle cellule epiteliali con
la matrice extracellulare, che orienta e limita le interazioni
cellula-cellula
In par8colari condizioni in cui le cellule epiteliali non aderiscono
alla matrice extracellulare, ci pu essere un processo estremo
di adesione che porta allinges8one cellulare
Nelle prime fasi, il processo reversibile e la cellula ingerita
vitale
La cellula ingerita (entocita) viene quindi degradata per
fusione con i lisosomi dellospite
Un meccanismo di protezione an1-metasta1co?

Tra la vita e la morte

LAutofagia

Cara.eris8che
Autophagy is a response to nutrient stress to
maintain adequate internal levels of nutrients (self-
cannibaliza8on).
Role in cell death is best revealed if apoptosis is
disabled (bax/bak-/-, caspase inhibitors, Bcl-xL++).
In nutrient-poor condi8ons (or equivalent eects
on mTOR signaling), autophagy maintains survival.
In nutrient-rich condi8ons, autophagy promotes
cell death in response to other types of stress.

Sopravvivenza o morte cellulare?

Nella maggior parte delle circostanze, lautofagia cos8tuisce
un meccanismo di ada.amento allo stress
Le modalit con cui lautofagia si trasforma in un processo di
morte cellulare non sono chiare
anche dopo estensiva auto-cannibalizzazione in assenza di fa.ori di
crescita, le cellule possono recuperare se trasportate in condizioni
adeguate

Non ci sono evidenze che geni coinvol8 nel processo di

autofagia siano implica8 in processi di morte cellulare
siologica (es. sviluppo embrionale)
nematodi KO per bec-1, ortologo di ATG6/beclina 1 e topi KO per la
beclina 1 hanno un numero maggiore di cellule apopto8che

Autophagy/xenophagy
Autophagy eat oneself
Xenophagy eat foreign
maGer
Highly conserved and
regulated process that
maintains cellular
homeostasis and protects
cells against starvaKon and
microbe invasion

3 Stages
IniKaKon: nutrient starvaKon, growth
factor-mediated starvaKon
ExecuKon
MaturaKon
Nature reviews microbiology 2004 2:301

Autophagic process
Cytoplasmic organelles and porKons of
cytoplasm sequestered in double membrane-
bound vacuoles
Source of membrane mulKfactorial (ribosome-
free ER?)
Fuse with lysosomes

Science 2004 306:990

Nature reviews microbiology 2004 2:301

Ultrastructural examples of apoptotic and autophagic cell death

Levine, B. et al. J. Clin. Invest. 2005;115:2679-2688

Copyright 2005 American Society for Clinical Investigation

Lum et al., 2005

IniKaKon:Signaling pathways

Trimeric G proteins
Growth receptors
PI3K (classes I & III)
protein phosphatases
mTOR

ExecuKon
Requires covalent-conjugaKon pathways
Requires Atg3, Atg7, Atg10
Homologs of ubiquiKnylaKon proteins
Modies pathway components but does not target them for
degradaKon
ProducKon of PIP3 via hVPS34 (class III PI3K)
Inhibited by wortmanin, 3-Methyladenine
Promotes proteolysis->producKon of amino acids
Complex formed between hVPS34, Atg14, & Atg6 (Beclin-1) which is
necessary for downstream recruitment and localizaKon of Atg5 & Atg12
Covalent linkage of Atg5 and Atg12 on pre-autophagosomal membrane
Protease cleavage of Atg8 (MAP1 Light chain 3 (LC3), followed by
covalent lipidaKon to phosphaKdylethanolamine and translocaKon to
autophagosome membrane

Fusion
Autophagosomes fuse with endosomes
Acquire characterisKcs of lysosomes
LAMP1 & 2
Accessible to DAMP
Cathepsins, acid phosphatases

Vesicle fusion mediated by Rabs (Rab24)

Involved in many processes

ATG6/Beclin 1: tumour suppressor gene
Deleted in sporadic breast, ovarian, prostate CA

Dauer formaKon in C. elegans

ATG5 & ATG7: Dictyostelium nitrogen starvaKon
Prevent premature senescence
Host defense against pathogen invasion

Autofagia ed omeostasi cellulare

Lautofagia coinvolta nella eliminazione di proteine
danneggiate che se accumulate possono portare alla
formazione di aggrega8
Eliminazione di organelli malfunzionan8
Mentre leliminazione di proteine pu essere svolta
anche da altri sistemi (proteasoma), lautofagia
lunico processo cellulare che pu portare alla
degradazione di interi organelli (mitocondri,
perossisomi, ecc.)

Autofagia e malaLe
neurodegenera8ve
Autofagosomi si accumulano nel cervello dei
pazien8 aeL da diverse malaLe degenera8ve
inizialmente, lautofagia ritenuta come un meccanismo
patogene8co e scatenante la morte cellulare
a.ualmente, almeno nei modelli animali chiaro che
lautofagia rappresenta un meccanismo di difesa e
laccumulo di autofagosomi una risposta siologica e di
tenta8vo di clearance delle componen8 cellulari
danneggiate

Microbes & autophagy

Diverse strategies
Host defense
Bacterial manipulate it to survive intracellularly

Nature reviews microbiology 2004 2:301

Autofagia e cancro
La dimostrazione che il gene per la beclina
perso in diversi tumori e quindi un candidato
oncosoppressore ha portato ad ipo8zzare che
lautofagia sia un meccanismo
prevalentemente di difesa contro i tumori
Lautofagia per pu anche promuovere la
sopravvivenza delle cellule tumorali in
condizioni di stress (mancanza di nutrien8,
tra.amen8 farmacologici)

Modelli animali di studio del rapporto

fra autofagia e cancro
Solo una copia di bec-1 (beclina) persa nei
tumori mammari
Topi bec-1 +/-: diminuita autofagia, aumento
della frequenza di diversi 8pi di tumori
Due altri gene oncosoppressori (PTEN e p53)
s8molano lautofagia inibendo la funzione di
TOR

Autofagia ed invecchiamento
Il digiuno intermi.ente promuove la longevit
La dieta (restrizione calorica) un indu.ore di
autofagia in tu.e le specie
La aumentata longevit indo.a da restrizion calorica
non viene mantenuta se vi inaLvazione
dellautofagia
modelli animali semplici (verme, moscerino)

Vi una diminuita espressione dei geni autofagici

con laumentare dellet

ALvazione dellautofagia aumenta la

longevit nei mammiferi

Gli animali sono sta8 tra.a8 con rapamicina inibitore di mTOR e quindi aLvatore
dellautofagia- a par8re da 600 giorni di et (adulta-inizio della vecchiaia). I topi sopravvivono
Pi a lungo dopo tra.amento (meccanismi molecolari ancora da denire).