Anda di halaman 1dari 8

PENENTUAN PROTEIN METODE LOWRY

SYAFIRA SALSABILA (G84130036)


EMA LINDAWATI (G84110010)

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PENDAHULUAN
Protein yang tersusun dari rantai asam amino akan memiliki berbagai macam
struktur yang khas pada masing-masing protein. Karena protein disusun oleh asam
amino yang berbeda secara kimiawinya, maka suatu protein akan terangkai melalui
ikatan peptida dan bahkan terkadang dihubungkan oleh ikatan sulfida. Selanjutnya
protein bisa mengalami pelipatan-pelipatan membentuk struktur yang bermacammacam. Adapun struktur protein meliputi struktur primer, struktur sekunder, struktur
tersier, dan struktur kuartener. Struktur primer merupakan struktur yang sederhana
dengan urutan-urutan asam amino yang tersusun secara linear yang mirip seperti tatanan
huruf dalam sebuah kata dan tidak terjadi percabangan rantai. Struktur primer terbentuk
melalui ikatan antara gugus amino dengan gugus karboksil. Ikatan tersebut
dinamakan ikatan peptida atau ikatan amida (Berg et al. 2006). Struktur ini dapat
menentukan urutan suatu asam amino dari suatu polipeptida (Voet & Judith
1995). Struktur sekunder merupakan kombinasi antara struktur primer yang
linear distabilkan oleh ikatan hidrogen antara gugus =CO dan =NH di sepanjang tulang
belakang polipeptida. Salah satu contoh struktur sekunder adalah -heliks dan -pleated.
Struktur ini memiliki segmen-segmen dalam polipeptida yang terlilit atau terlipat
secara berulang (Khopkar 2007). Struktur tersier dari suatu protein adalah lapisan yang
tumpang tindih di atas pola struktur sekunder yang terdiri atas pemutarbalikan tak
beraturan dari ikatan antara rantai samping (gugus R) berbagai asam amino. Struktur ini
merupakan konformasi tiga dimensi yang mengacu pada hubungan spasial antar struktur
sekunder. Struktur ini distabilkan oleh empat macam ikatan, yakni ikatan hidrogen,
ikatan ionik, ikatan kovalen, dan ikatan hidrofobik. Dalam struktur ini, ikatan
hidrofobik sangat penting bagi protein. Asam amino yang memiliki sifat hidrofobik
akan berikatan di bagian dalam protein globuler yang tidak berikatan dengan air,
sementara asam amino yang bersifat hodrofilik secara umum akan berada di sisi
permukaan luar yang berikatan dengan air di sekelilingnya (Murray et al 2009). Struktur
kuarterner adalah gambaran dari pengaturan sub-unit atau promoter protein dalam
ruang. Struktur ini memiliki dua atau lebih dari sub-unit protein dengan struktur tersier
yang akan membentuk protein kompleks yang fungsional. ikatan yang berperan dalam
struktur ini adalah ikatan nonkovalen, yakni interaksi elektrostatis, hidrogen, dan
hidrofobik. Protein dengan struktur kuarterner sering disebut juga dengan protein
multimerik. Jika protein yang tersusun dari dua sub-unit disebut dengan protein dimerik
dan jika tersusun dari empat sub-unit disebut dengan protein tetramerik (Lodish et al.
2003).
Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret. Prinsip kerja
metode Lowry adalah reduksi Cu2+ (reagen Lowry B) menjadi Cu + oleh tirosin,
triptofan, dan sistein yang terdapat dalam protein. Dalam metode ini terlibat 2 reaksi.
Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana metode biuret yang
dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu + kemudian akan
mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat-phosphotungstat,
menghasilkan heteropoly-molybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik
(rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang
dapat dideteksi secara kolorimetri. Kekuatan warna biru terutama bergantung pada
kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya. Metode Lowry mengkombinasikan
pereaksi biuret dengan pereaksi lain (Folin-Ciocalteauphenol) yang bereaksi dengan

residu tyrosine dan tryptophan dalam protein (Lowry et al. 1951). Reaksi ini
menghasilkan warna kebiruan yang bisa dibaca di antara 500 750 nm, tergantung
sensitivitas yang dibutuhkan. Akan muncul puncak kecil di sekitar 500 nm yang dapat
digunakan untuk menentukan protein dengan konsentrasi tinggi dan sebuah puncak
besar disekitar 750 nm yang dapat digunakan untuk menentukan kadar protein dengan
konsentrasi rendah. Inilah yang menyebabkan penentuan kadar protein metode Lowry
dapat dilakukan di dua panjang gelombang spektrofotometer. Warna yang diserap
maksimum oleh larutan pada panjang gelombang 500 nm adalah warna hijau kebiruan
atau hijau dengan warna komplementernya merah atau ungu-kemerahan (Rahayu 2005).
Warna yang terlihat pada larutan adalah tidak berwarna.
Praktikum ini bertujuan menentukan kadar protein dalam suatu sampel dengan
metode Lowry, yaitu dengan metode spektrofotometri menggunakan kurva standar.

METODE
Bahan dan Alat
Alat-alat yang dipakai yaitu tabung reaksi, pipet Mohr, bulb, Spectro UV-VIS
Genesys 10 UV, Vortex Vibrifix VFI electronic. Bahan yang digunakan adalah akuades,
BSA, protein sampel, reagen C, dan reagen D.
Prosedur Penelitian
Pembuatan Kurva Standar
Sebanyak 7 buah tabung reaksi yang bersih dan kering disiapkan dan diberi label
0, 20, 40, 60, 100, 120, 140. Larutan standar 0 g/ml dibuat dari 10 ml akuades. Larutan
standar 20 g/ml dibuat dari 0,20 ml BSA yang diencerkan dengan 9,80 ml akuades.
Larutan standar 40 g/ml dibuat dari 0,40 ml BSA yang diencerkan dengan 9,60 ml
akuades. Larutan standar 60 g/ml dibuat dari 0,60 ml BSA yang diencerkan dengan
9,40 ml akuades. Larutan standar 100 g/ml dibuat dari 1,00 ml BSA yang diencerkan
dengan 9,00 ml akuades. Larutan standar 120 g/ml dibuat dari 1,20 ml BSA yang
diencerkan dengan 8,80 ml akuades. Larutan standar 140 g/ml dibuat dari 1,40 ml
BSA yang diencerkan dengan 8,60 ml akuades. Setiap larutan tersebut dihomogenkan
dengan Vortex kemudian dipindahkan sebanyak 1 ml ke dalam masing-masing tabung
berlabel sesuai dengan konsentrasinya. Lalu 5 ml reagen C ditambahkan ke dalamnya
dan diinkubasi selama 10 menit, ditambahkan 0,5 ml reagen D ke dalamnya dan
diinkubasi kembali selama 30 menit. Kemudian nilai absorbansi tiap tabung dibaca pada
panjang gelombang 500 nm dan dicatat hasil pembacaannya.
Penentuan Konsentrasi Protein Sampel
Sebanyak 3 buah tabung bersih dan kering disiapkan dan diberi label 1, 2, 3.
Tabung 1 diisi dengan 1 ml protein sampel, sedangkan tabung 2 dan 3 diisi dengan
protein sampel yang diencerkan terlebih dahulu. Sebanyak 5 ml protein sampel
diencerkan dengan 5 ml air, dihomogenkan dengan menggunakan Vortex dan
dipindahkan ke dalam tabung 2 sebanyak 1 ml. Kemudian sebanyak 2,50 ml protein
sampel diencerkan dengan 7,50 ml air, dihomogenkan dengan menggunakan Vortex dan

dipindahkan ke dalam tabung 3 sebanyak 1 ml. Disediakan juga tabung berisi 1 ml


akuades sebagai blangko. Lalu larutan pada setiap tabung ditambah 5 ml reagen C,
diinkubasi selama 10 menit, ditambah 0,50 ml reagen D dan diinkubasi kembali selama
30 menit. Kemudian nilai absorbansi tiap tabung dibaca pada panjang gelombang 500
nm dan dicatat hasil pembacaannya.
(3 enter)

HASIL DAN PEMBAHASAN


Tabel 1 Hasil pengukuran absorbansi deret standar protein (BSA) metode Lowry pada
panjang gelombang 500 nm
No.
1
2
3
4
5
6
7

Nama sampel
Standar
Standar
Standar
Standar
Standar
Standar
Standar

1 (blangko)
2
3
4
5
6
7

Contoh Perhitungan :
Absorbansi terkoreksi

Konsentrasi
(g/mL)
0
20
40
60
100
120
140

Absorbansi
0.035
0.033
0.048
0.052
0.058
0.109
0.066

Absorbansi
terkoreksi
0
-0,002
0,013
0,017
0,023
0,074
0,031

= Absorbansi sampel Absorbansi blangko


= 0.033 0.035
= - 0.002

Pengenceran [BSA] g/ml


[BSA] stok = 1 g/ml = 1000 g/ml
N1 = 1000 g/ml
N2 = 20 g/ml
V2 = 10 ml
V1 x N1
=
V2 x N2
V2 x N2
V1
=
N1
=

10 ml x 20 g/ml
1000 g/ml

=
0.20 ml
Jadi, 0.20 ml 1000 g/ml ditera dengan akuades (9.80 ml) sampai total 10.00 ml.

0.08
0.07
0.06
0.05
Absorbansi

0.04

f(x) = 0x - 0
R = 0.61

0.03
0.02
0.01
0
-0.01 0

20

40

60

80

100

120

140

160

Konsentrasi (g / mL)

Gambar 1 Hubungan antara konsentrasi protein dalam g/mL dengan absorbansinya pada
spektrofotometer UV-VIS Genesys 10 UV dengan panjang gelombang 595 nm.

Tabel 2 Hasil pengukuran absorbansi protein sampel metode Bradford pada panjang
gelombang 500 nm
No
.

Nama
Sampel

Blanko

Sampel
1
(1 ml)
Sampel
2
(0.50
ml)
Sampel
3 (0.25
ml)

Ulanga
n

Absorban
si

Absorban
si
Terkoreks
i

1
2
1
2

0.050
0.050
0.101
0.124

0
0
0.051
0.074

1
2

0.064
0.075

0.014
0.025

1
2

0.053
0.053

0.003
0.003

Contoh Perhitungan
Absorbansi terkoreksi

Rata-rata
Absorban
si
Terkoreks
i

Konsentra
si Protein
(g/ml)

0.0625

165.5

0.0195

116.0

0.003

67.0

= Absorbansi sampel Absorbansi blangko


= 0.101 0.050
= 0.051
Rata-rata Absorbansi terkoreksi
=
Absorbansi terkoreksi U1 Absorbansi terkoreksi U2
2

0.051 0.074
= 2
= 0.0625
y= a + bx ; x = Konsentrasi protein, y = Rata-rata absorbansi terkoreksi
y = 0,0004x - 0,0037
Rata-rata A terkoreksi = intersep + slope . Konsentrasi protein
Rata-rata A terkoreksi - intersep
Konsentrasi protein = slope

0.0625 (0.0037)
0.0004

= 165.5 g/ml
Konsentrasi protein sebenarnya
= Konsentrasi protein x Faktor Pengenceran
1
= 165.5 x 1
= 165.5 g/ml
Prinsip kerja metode Lowry adalah reduksi Cu 2+ (reagen Lowry B) menjadi Cu+
oleh tirosin, triptofan, dan sistein yang terdapat dalam protein. Ion Cu + bersama dengan
fosfotungstat dan fosfomolibdat (reagen Lowry E) membentuk warna biru karena
menghasilkan heteropoly-molybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik
terkatalis Cu, sehingga dapat menyerap cahaya (Lowry dkk 1951). Panjang gelombang
500 nm merupakan panjang gelombang maksimal dimana serapan optimal sehingga
absorbansi dapat dibaca pada spektrofotometer UV-VIS (Irwan -).
Dalam percobaan ini, dilakukan dua macam perlakuan, yaitu membuat larutan
standar dan protein sampel. Dua macam larutan ini sama-sama diberikan reagen C,
diinkubasi 10 menit, diberikan reagen D, dan diinkubasi 30 menit. Fungsi perlakuan
pertama (larutan standar) adalah untuk membuat kurva standar berdasarkan hasil
pembacaan nilai absorbansinya, sedangkan perlakuan kedua (protein sampel) digunakan
untuk mengetahui konsentrasi protein sebenarnya dalam campuran. Reagen C
merupakan campuran antara reagen A dan reagen B, sementara reagen D merupakan
hasil pengenceran reagen Folin-Ciocalteu dalam asam. Fungsi reagen C yaitu untuk
membentuk warna kebiruan pada larutan. Reagen D yang mengandung reagen FolinCiocalteu merupakan pereaksi kompleks yang berisi fosfomolibdat dan fosfotungstat.
Fungsi dari reagen ini adalah membentuk kompleks warna biru yang disebabkan dari
reaksi antara tirosin yang ada dalam protein dengan fosfomolibdat dan fosfotungstat
(Rohman 2007).
Kurva standar dihasilkan dari hubungan antara konsentrasi larutan protein
standar dan nilai absorbansi yang dihasilkannya. Persamaan yang didapatkan pada
percobaan ini adalah y = 0,0004x - 0,0037 dengan nilai R hanya sebesar 0.6064.
Berdasarkan teori, semakin besar konsentrasi larutan uji, maka semakin besar pula nilai
absorbansinya (Khopkar 2007). Hasil pengukuran absorbansi deret standar protein
metode Lowry pada panjang gelombang 500 nm dapat dilihat di Tabel 1. Nilai
absorbansi yang didapatkan tidak selalu berbanding lurus dengan konsentrasi larutan
sehingga dapat dikatakan percobaan kurang sesuai dengan teori. Hal ini berpengaruh

pada koefisien korelasi (r) yang didapatkan. Nilai regresi standar (r) yang didapatkan
cukup kecil, yaitu 0.7787 % berada jauh di luar standar minimal yang besarnya 0.995
%. Nilai ini menunjukkan rendahnya ketepatan percobaan atau adanya penyimpangan
selama percobaan yang mungkin disebabkan oleh kesalahan yang berasal dari praktikan.
Kesalahan yang mungkin terjadi adalah kesalahan dalam pengenceran protein BSA,
biasanya dalam hal volume BSA yang digunakan. Selain itu, praktikan kurang cermat
dalam menggunakan kadar reagen C dan kadar reagen D, serta larutan yang
terkontaminasi.
Hasil pengukuran absorbansi protein sampel metode Lowry pada panjang
gelombang 500 nm dapat dilihat di Tabel 2. Data yang diperoleh menunjukkan bahwa
nilai absorbansi semakin meningkat seiring dengan peningkatan konsentrasi protein
sampel pada setiap tabung. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa semakin
banyak volume protein sampel dalam campuran, jumlah protein yang terlarut akan
semakin sedikit, sehingga nilai absorbansinya semakin besar. Tabung 1 berisi 0 ml
protein sampel berfungsi sebagai blangko dan memiliki nilai absorbansi terukur 0 dan
konsentrasi protein 0 g/ml, tabung 2 berisi Sampel 1 dengan kadar protein 100 %
dalam campuran memiliki rata-rata nilai absorbansi terkoreksinya 0.0625 dan
konsentrasi protein 165.5 g/ml, tabung 3 berisi Sampel 2 dengan kadar protein 50 %
dalam campuran memiliki rata-rata nilai absorbansi terkoreksinya 0.0195 dan
konsentrasi protein 116.0 g/ml, tabung 4 berisi Sampel 3 dengan kadar protein 25 %
dalam campuran memiliki rata-rata nilai absorbansi terkoreksinya 0.003 dan dan
konsentrasi protein 67.0 g/ml. Hasil percobaan sesuai dengan teori bahwa semakin
sedikit kadar protein yang terlarut, semakin kecil nilai absorbansinya (Khopkar 2007).

SIMPULAN DAN SARAN


Simpulan
Kadar protein dari suatu sampel bisa ditentukan dengan beberapa metode, salah
satunya metode Lowry. Metode Lowry menggunakan prinsip spektrofotometri untuk
melihat nilai absorbansi dan hubungannya dengan kadar protein heteropolymolybdenum blue yang dihasilkan. Konsentrasi protein sampel dapat ditentukan setelah
membuat kurva standar dari percobaan. Berdasarkan data dan hasil percobaan, dapat
disimpulkan bahwa semakin besar konsentrasi protein dalam sampel, semakin tinggi
nilai absorbansinya.
Saran
Sebaiknya alat spektrofotometer disediakan lebih dari satu sehingga praktikan
tidak menunggu lama untuk menggunakannya setelah menyiapkan sampel yang akan
diukur absorbansinya.

DAFTAR PUSTAKA
Berg, J.M., J.L. Tymoczko, and L. Stryer. 2006. Biochemistry 5th Ed. New York (USA):
W.H. Freeman and Company
Irwan R. -. Pengaruh penambahan MnCl2 terhadap produksi enzim protease dari
Bacillus licheniformis HSA3-1a. Jurnal Ilmiah Biokimia Universitas Hasanudin.
(-):Khopkar S. 2007. Konsep Dasar Biokimia. Jakarta (ID): UI Pr.
Lodish et al. 2003. Molecullar Cell Biology Fifth Edition. New York (USA): WH
Freeman&Company
Lowry , Rosenbrough , Farr, Randall. 1951. Protein Measurement with the Folin Phenol
Reagent. New York (USA): Kluwer Academic Publishers.
Murray RK. et.al. 2009. Harpers Illustrated Biochemistry 28 th ed. New York (USA) :
Lange Medical Publications, hlm. 155, 459
Rahayu A, Suranto, Purwoko T. 2005. Analisis karbohidrat, protein, dan lemak pada
pembuatan kecap lamtoro gung (Leucaena leucocephala) terfermentasi
Aspergillus oryzae. Bioteknologi. 2(1): 14-20.
Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta (ID): Pustaka Pelajar
Voet D. & Judith G. Voet. 1995. Biochemistry 2nd edition. New York (USA): John
Wiley & Sons, Inc. p. 795-822

Lampiran 1 Rancangan kerja Penentuan Protein Metode Lowry