INFORME DE LABORATORIO HIDROLIIS ENZIMATICA DE LA LACTOSA

RESULTADOS OBTENIDOS EN LA PRCTICA

DATOS EXPERIMENTALES
Tabla 1. Datos de curva de calibracin
ppm glucosa
100
200
300
700
800
900

Absorbancia
0,056
0,101
0,165
0,293
0,355
0,412
Grafica1.curva de calibracin DNS

Curva de calibracion DNS

1000
800
600
ppm glucosa

f(x) = 2351.26x - 41.57

R = 0.99
Azucares Red.
Linear (Azucares
Red.)

400
200
0
0

0.2

0.4

0.6

Absorbancia

Tabla.2 lectura espectrofotometro

Preparado enzimtico (ml)
0
0.04
0.14
0.44

Absorbancia
1,519
2,073
2,180
2,839

FACTOR DE DILUCION (FD) 1:10

Calculo de las concentraciones experimentales segn la absorbancia hallada:
Dnde:

Y =2351,3 X 41,573

Y= Concentracin
X= Absorbancia
Con la siguiente ecuacin, y reemplazando los valores obtenidos experimentalmente
de absorbancia, encontramos las concentraciones. Para que las unidades de la
concentracin queden expresadas en g/L., multiplicamos todos los datos por 10 y a su
vez los dividimos en 1000. Siendo as tendremos que:
Muestra de clculo

Y 1=( 2351.3 ( 1,519 )41.573 g /l )10/1000=35,300517

Y 2=( 2351.3 ( 2,073 )41.573 g /l )10/1000=48,326719
Y 3=( 2351.3 ( 2,180 )41.573 g /l )10 /1000=50,84261
Y 4=( 2351.3 ( 2,839 )41.573 g /l )10/1000=66,337677

Tabla 3: datos para la lactasa

Preparado enzimtico
0
0.04
0.14
0.44

Absorbancia

1,519
2,073
2,180
2,839

Concentracin(g/l)
35,300517
48,326719
50,84261
66,337677

CALCULO DE AZUCARES REDUCTORES

Determinacin de los azucares reductores reales se realiza mediante la siguiente
ecuacin.

Azucares reductores Reales = Azucares reductoresObtenidos Azucares reductores Blanco

Muestra de clculo

Azucares reductores Reales =48,32671935,300517=13,026202

Tabla 4.
Preparado enzimtico

Concentracin(g/l)

Azucares reductores

0
0.04
0.14
0.44

reales (g/l)
0
13,026202
15,542093
31,03716

35,300517
48,326719
50,84261
66,337677

Grficas 1. Azucares reductores reales vs Dosificacin

Azucares reductores reales (g/l) Vs Dosificacion

35
30
25
20
15
10
5
0
0

0.04

0.14

0.44

DETERMINACIN DE LOS AZUCARES REDUCTORES TERICOS.

3 42 g /l360 g /l

x=52.6316 g/l Azucares reductoresteoricos

50 g /lx
Determinacin del % de hidrolisis

%H=

AR Reales
100
AR Teoricos

Muestra de clculo:

Para preparado enzimtico= 0.04ml

%H=

13,026202
100=24,89907
52.6316

Tabla 5
Preparado
enzimtico

Azucares
reductores reales
(g/l)
0
13,026202
15,542093
31,03716

0
0.04
0.14
0.44

Azucares
reductores
tericos (g/l)
52,6316
52,6316
52,6316
52,6316

% de hidrolisis

0
24,7497739
29,52996
58,9705804

Grficas 2. % de hidrolisis vs Dosificacin

% Hidrolisis Vs Dosificacion
70
60
50
40
30
20
10
0
0

0.04

0.14

0.44

CALCULO DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA (AE)

AE=

U=

U
ml de preparado enzimatico

mmol glucosa
mlmin

Muestra de clculo:

U=

13,026202g 1mol Glucosa 1000mmol

1
mmol Glucosa

=1,2061298
L
180g Glucosa 1 mol Glucosa 60min
l*min

1.2061298

Actividad Enzimtica=

U
=
Dosificacin ( mL ) 0.04 mL

Preparado enzimtico

Azucares reductores
reales (g/l)

0
0.04
0.14
0.44

0
13,026202
15,542093
31,03716

mmol Glucosa
mL*min

AE

=30,153245

mmol Glucosa
l*min

mmol Glucosa
L*min
0
30,153245
10,279162
6,5313889

Grficas 3. Actividad enzimtica vs Dosificacin

Actividad enzimatica Vs dosificacion

35
30
25
20
15
10
5
0
0

0.04

0.14

0.44

CUESTIONARIO
1-Interprete los datos obtenidos a la luz de la teora y proponga
explicaciones en caso de que exista divergencia entre los resultados
esperados y los obtenidos.
En las grficas 2 y 3 se puede evidenciar que entre ms dosificacin de enzima
aumenta el % de hidrolisis de la lactosa y por tanto aumentan los azucares
reductores (galactosa y glucosa). Esto se debe a que al dosificar con ms
enzima lactasa hay ms sitios activos expuestos, siempre y cuando haya
suficiente sustrato para transformar en productos.

En la grfica 4 se puede evidenciar que a mayor dosificacin de enzima menor

actividad enzimtica, con una misma cantidad de sustrato y una mayor
concentracin enzimtica los sitios activos de algunas de ellas no van a
presentar catlisis porque el sustrato no es suficiente para reaccionar con todos
los sitios activos disponibles y por tanto decrece su actividad enzimtica. Pues
estas presentan su mayor actividad en condiciones de saturacin (cintica de
michaelis menten).
No existe divergencia entre los datos obtenidos y los esperados, esto es
posible siempre y cuando se controlen las condiciones ptimas de
funcionamiento para la enzima lactasa como lo son su PH y temperatura, pues
si no se controlan estos parmetros podra ocurrir una desnaturalizacin o
inactivacin de la enzima perdiendo drsticamente su actividad enzimtica
porque podra cambiar la conformacin del sitio activo; algo que no se
evidencio en la prctica de hidrolisis de lactosa puesto que aumento la
produccin de azucares reductores en el transcurso del tiempo, adems de
que el tiempo de reaccin fue corto y no hubo diferencia significativa.
2-Cmo se podra hacer un clculo aproximacin del grado de hidrlisis
de lactosa basndose en los resultados obtenidos?
El grado de hidrlisis es un porcentaje que se calcula por medio de la formula:
Hidrolisis=

azucares reductores reales

100
azucares reductores teoricos

En donde:
45
Azucares reductores teoricos=

( gl )lactosa en leche360(g) =47.368 g /L

342( g)

3-Qu se entiende por azcares reductores? Cul es la reaccin

qumica que fundamenta el mtodo de Fehling para la determinacin de
azcares reductores?
Los azcares reductores son aquellos azcares que poseen su grupo
carbonilo (grupo funcional) intacto, y que a travs del mismo pueden reaccionar
como reductores con otras molculas. Los azcares reductores provocan la
alteracin de las protenas mediante la reaccin de glucosilacin no enzimtica
tambin denominada reaccin de Maillard o glicacin.
Todos los monosacridos y los disacridos con enlace monocarbonilo, cuando
se encuentran en solucin a pH alcalino, tienen la capacidad de reducir otros
compuestos. Esta capacidad reside en las caractersticas del grupo carbonilo

(C anomrico en formas cicladas) libre. Esta propiedad, y por tanto, la

presencia de un azcar reductor, se ponen de manifiesto mediante la reaccin
de FEHLING.
El reactivo de Fehling consta de :
-Fehling A: CuSO4 disuelto en H2O
-Fehling B: NaOH y tartrato Na-K disuletos en agua
Fundamento de la reaccin: En medio alcalino, el cobre procedente del
CuSO4 se encuentra en forma de hidrxido cprico, y se forma la
correspondiente sal Na2SO4. Cuando el Cu (OH)2 (de color azul) se calienta
en presencia de un compuesto reductor se forma xido cuproso (de color rojo
ladrillo).

Si hay un compuesto reductor, el Cu cambia su estado de oxidacin de (2+ a

1+), lo que se evidencia por el cambio de color.
4-Proponga diferentes tcnicas de anlisis que permitan la determinacin
cuantitativa de lactosa, glucosa y galactosa en forma separada cuando se
tiene una mezcla de estos tres azcares.
Tcnicas para la determinacin cuantitativa de la lactosa:
Cintica de la reaccin de hidrlisis de la lactosa catalizada por la enzima
-Galactosidasa por el mtodo de Michaelis- Menten
El anlisis cuantitativo del efecto de cada uno de los factores que intervienen
en la reaccin enzimtica, es evaluado a travs de la expresin de velocidad de
reaccin. Los factores ms importantes son la concentracin de enzima, de
sustrato y de productos (inhibidores, activadores), el pH y la temperatura.
Por otra parte, en el caso de cintica heterognea, adems se deben
considerar los efectos de restricciones difusionales y de particin de las
especies reactivas. El modelo ms utilizado para describir la cintica de la
reaccin de hidrlisis de la lactosa por la enzima -Galactosidasa es el
conocido como de Michaelis-Menten con inhibicin competitiva por producto.
Una forma de anlisis se basa en la teora del estado estacionario que propone

la existencia de un estado transiente muy breve (del orden de los seg) y que
la concentracin del complejo [enzima-sustrato] es constante frente a la
concentracin de sustrato y producto.
Determinacin cuantitativa de glucosa IVD (Spinreact)
En el mtodo GOD-POD, en un primer paso la glucosa oxidasa cataliza la
oxidacin de la D-glucosa a cido D-glucnico con formacin de perxido de
hidrgeno. ste es utilizado por la peroxidasa para oxidar a la 4-aminofenazona
y al fenol, dando lugar a una quinonaimina coloreada. La intensidad de color
ser proporcional a la concentracin de glucosa presente inicialmente. (En
ocasiones se utilizan otros sustratos en lugar de 4-aminofenazona+fenol, tales
como o-dianisidina, guayacol y ABTS.)
La glucosa oxidasa (GOD) cataliza la oxidacin de glucosa a cido glucnico.
El perxido de hidrgeno (H2O2), producido se detecta mediante un aceptor
como gnico de oxgeno, fenol ampirona en presencia de peroxidasa (POD):
Fundamento:
En el mtodo GOD-POD, en un primer paso la glucosa oxidasa cataliza la
oxidacin de la D-glucosa a cido D-glucnico conformacin de perxido de
hidrgeno. ste es utilizado por la peroxidasa para oxidar a la 4aminofenazona y al fenol, dando lugar a una quinonaimina coloreada. La
intensidad de color ser proporcional a la concentracin de glucosa presente
inicialmente. (En ocasiones se utilizan otros sustratos en lugar de 4aminofenazona+fenol, tales como o-dianisidina, guayacol y ABTS.)Esquema de
la reaccin.

5-En qu consiste el pI de una protena? Cual es el pI de las protenas

de la leche y del suero de leche?

En el punto isoelctrico se da precipitacin de la protena por estado basal.

El pI es el punto isoelctrico de una protena, es el pH al que una sustancia
anftera tiene carga neta cero, de modo que no se desplaza al aplicar un
campo elctrico. A medida que las molculas de protena se van acercando a
su punto isoelctrico irn perdiendo carga elctrica (lo ms habitual) o ganando
cargas de signo contrario, hasta llegar al valor de pH en que la carga neta sea
cero y las protenas dejen de moverse.
* El pH del punto isoelctrico ms frecuente es entre 4.6-4.7; a este pH, las
protenas de la leche se encuentran en su punto de menor solubilidad, debido a
la reduccin de repulsiones intermoleculares, por lo que precipitan.
* El punto isoelctrico de las protenas del suero de leche se produce al
alcanzar el punto isoelctrico de la casena con anulacin de las cargas
elctricas que las mantienen separadas por las fuerzas de repulsin que
generan, impidiendo la floculacin.
En la leche
pI de la -s1-casena: 4,44 - 4,76
pI de la -casena: 4,83-5,07
pI de la -casena: 5,45 - 5,77

En el suero de leche
pI de la -lactoalbmina: 5.2
pI de la -lactoglobulina: 5.2 - 7,5
pI de la Seroalbumina: 4,7 - 5,2

6-Qu se entiende por jarabe de suero? Cules son sus aplicaciones?

Por qu es necesario desproteinizar el suero de leche para obtener
jarabe de suero?
El jarabe de suero es el proceso mediante el cual se hidroliza la lactosa del
suero y el hidrolizado se concentra en 60% a 70% de slidos. Los jarabes de
suero son muy estables a temperatura ambiente, presentando problemas de
deterioro solo por hongos y levaduras. El jarabe de suero se puede emplear
como sustituto de parciales de slidos de leche y azcar en helados, confitera,
aderezos, productos de panadera y bebidas refrescantes de alto valor nutritivo.
Es necesario desproteinizar el suero de leche para obtener jarabe de suero
porque el suero es un lquido altamente contaminante precisamente por su alto
contenido en sustancias proteicas, dando lugar a problemas de evacuacin
particularmente difciles por motivo de su considerable volumen. (6g/L).
7-Cules son las condiciones ptimas de trabajo de la lactasa? Por qu
en algunos experimentos no se utilizaron estos valores?
Las condiciones ptimas a las cules se presenta la mayor actividad enzimtica
de la lactasa (46,6 U/ml) son 48 C y pH de 6,5 aunque tambin puede actuar
en rangos de pH de 4,5 a 8,0 y temperaturas de 45 - 50 C siendo
relativamente termoestables, lo cual favorece el uso de esta enzima en la
hidrlisis de la lactosa en leche y productos lcteos que tienen un pH similar.

Pero se debe tener en cuenta de que organismo proviene la enzima lactasa,

pues dependiendo de esto tambin tienen unas condiciones ptimas de trabajo,
Actualmente solo algunas se utilizan en la produccin a gran escala de la
enzima: A. niger, A. oryzae, K. lactis, K. marxianus y C kefyr.
:
ORIGEN
A.niger
A.oryzae
K. lactis
K. marxianus
C.kefyr

pH OPTIMO
3.0-4.0
5.0
6.5-7.3
6.6
6.2

TEMPERATURA OPTIMA
55-60
50-55
35
37
45-47

8-Qu otras aplicaciones tiene la enzima lactasa a nivel industrial

diferentes a la de obtencin de leche deslactosada?

Se emplea como ingrediente en sopas.

Transformacin en lactulosa, empleada en la elaboracin de productos
para alimentacin infantil.
Como edulcorante sustituyendo el azcar en postres y helados.

9-Cul es la clasificacin de las siguientes enzimas de acuerdo a los

parmetros de la Enzyme Commission. Para cada enzima indique la
clase, la subclase y la subsubclase:
Enzima

Clase

Subclase

Subsubclase

Lactasa
(EC 3.2.1.108)
-galactosidasa (EC
3.2.1.23)
Quimotripsina
(EC 3.4.21.1)

Hidrolasa
(EC 3)
Hidrolasa
(EC 3)

Glicosilasas
(EC 3.2)
Glicosilasas
(EC 3.2)

Hidrolasa (EC 3)

Peptidasas (EC 3.4)

Renina (Quimosina)
(EC 3.4.23.15)

Hidrolasa (EC 3)

Peptidasas (EC 3.4)

Glicosidasas
(EC 3.2.1)
Glicosidasas
(EC 3.2.1)
Serina
Endopeptidasa
s (EC 3.4.21)
Acido
Asparttico
Endopeptidasa
s (EC 3.4.23)

CONCLUSIONES

El grado de hidrlisis de una enzima es proporcional a la concentracin

de azucares reductores, debido al rompimiento de los enlaces
glucsidos que unen los monosacridos generando un aumento en la
concentracin de tales azucares.

En el uso de las enzimas se debe conocer ntimamente sus condiciones

ptimas de trabajo para obtener resultados esperados, pues a veces
estas condiciones como lo son el ph y la temperatura; si no son los
ptimos pueden afectar la actividad cataltica de la enzima y por ende
todo el proceso.

La aplicacin de la biotecnologa en la industria alimentaria ha

proporcionado facilidad a las personas intolerantes a la lactosa, con la
produccin de leche deslactosada debido a que estas personas carecen
de la enzima lactasa y por tanto no desdoblan la lactosa,

Como las condiciones ptimas de la lactasa son similares al pH de la

leche 6.6, no se tuvo que acidificar o neutralizar el medio, por tanto el
uso de esta enzima para desdoblar la lactosa en la leche es muy fcil y
econmico.

el % de hidrolisis iba aumentando conforme se aumentaba la

dosificacin de enzima, esto se evidencio con la produccin de
azucares reductores (galactosa y glucosa).

Para que la accin de la enzima se de en perfectas condiciones se

deben tener claros factores como tiempo de reaccin, concentracin de
enzima, concentracin de sustrato, temperatura de operacin adems se
debe asegurar que la enzima este activa y que sea manejada

correctamente, esto har que la hidrlisis de la lactosa sea del 100%.

Se pudo concluir por medio de la prctica que la lactosa es un

disacrido con una molcula del azcar de la glucosa limitada a una
molcula del azcar de la galactosa. Una vez que la lactosa est partida,
el cuerpo humano metaboliza fcilmente los productos de la glucosa y
de la galactosa.

Tambin se puede concluir que la manipulacin de las enzimas es un

proceso bastante crtico ya que por cualquier variacin en el medio, pH,
o la temperatura se generan cambios que afectan en este caso la
hidrlisis de la lactosa.

RECOMENDACIONES

Controlar el pH y la temperatura en la que se trabaja el enzima, puesto

que si estas condiciones no son ptimas para la enzima, se puede
inactivar o en su defecto desnaturalizarse.

Para realizar la prctica de hidrolisis enzimtica de la lactosa es

necesario trabajar con leche descremada, puesto que la grasa de la
leche influye negativamente en la actividad enzimtica.

Por consiguiente se recomienda realizar la prctica experimental con

mucho cuidado y de manera minuciosa debido a que cualquier cambio
en la concentracin, temperatura y dems condiciones pueden llegar a
inactivar las enzimas.

BIBLIOGRAFIA

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