STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIUM MIKROBIA

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

OLEH :
NAMA : AYU MAULIDA PUTRI
NIM : H1E107001
KELOMPOK : 10 (SEPULUH)
ASISTEN : DESYFITRIYANI

PROGRAM STUDI TEKNIK LINGKUNGAN

FAKULTAS TEKNIK

UNIVERSITAS LAMBUNG MANGKURAT

BANJARBARU

OKTOBER, 2009
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Tahapan penting yang mutlak harus dilakukan selama bekerja di ruang

praktikum mikrobiologi adalah prinsip “sterilisasi”. Sterilisasi berarti proses

pemusnahan bakteri dengan cara membunuh mikroorganisme. Dalam kegiatan

penelitian mikroba, digunakan alat dan medium yang steril, maka sterilisasi ini

adalah usaha untuk membebaskan alat atau bahan-bahan dari segala macam

kehidupan atau kontaminasi oleh mikroba (Anaya, 2009).

Media tumbuh bagi mikroba memiliki keragaman dalam hal tipe nutrisi

tergantung mikroba yang mengimbanginya. Sumber nutrien bisa berasal dari alamiah

maupun buatan seperti campuran zat-zat kimiawi. Media dituang ke dalam wadah-

wadah selain sesuai juga disterilkan sebelum digunakan. pH medium perlu

disesuaikan dan ditentukan dengan nilai yang optimum bagi pertumbuhan mikroba.

Sterilisasi dengan pemanasan basah sering kali disebut otoklaf. Metode ini

merupakan metode yang paling sering digunakan pda sterilisasi. Hal ini di dasarkan

pada fakta bahwa umumnya spora bakteri dapat bertahan pada pemanasan titik didih

air (100oC pada level laut). Mereka dapat melemah pada temperature yang lebih

tinggi, hal ini tidak dapat dilakukan tanpa menaikkan tekanannya. Padahal umunya

pemanasan berada pada tekanan atmosfer, yaitu sebesar 1 atm. Untuk alas an ini

ruang pada otoklaf digunakan pada saat pengukusan pada tekanan 15 Lb In 2 ,

dengan temperature mencapai 121oC dan dilakukan selama 15-20 menit (Levinson,

1992).
 Sterilisasi basah biasanya dilakukan di dalam autoklaf dengan menggunakan

uap air jenuh bertekanan pada suhu 121oC selama 15 menit. Karena naiknya titik

didih air menjadi 121oC itu disebabkan oleh tekanan 1 atm maka daur sterilisasi

tersebut seringkali juga dinyatakan 1 atm 15 menit. Namun hal ini hanya berlaku

untuk tempat-tempat dengan ketinggian yang sama dengan permukaan laut. Jika

sterilisasi dilakukan tanpa kelembaban, maka disebut dengan sterilisasi panas kering

atau sterilisasi kering dan jika dilakukan dengan menggunakan gas atau bahan kimia

maka disebut dengan sterilisasi kimiawi. Metode sterilisasi umum yang digunakan di

laboratorium mikrobiologi secara rutin adalah sterilisasi dengan menggunakan panas

(Hadioetomo, 1993).

1.2 Tujuan
Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mempelajari proses sterilisasi dan
tahapan prepasi media tumbuh mikroba.
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Proses menghancurkan semua jenis kehidupan sehingga menjadi steril

disebut sterilisasi. Sterilisasi seringkali dilakukan dengan pengaplikasian udara

panas. Ada dua metode yang sering digunakan, yaitu :

1) Panas lembab dengan uap jenuh bertekanan. Sangat efektif untuk sterilisasi

karena menyediakan suhu jauh di atas titik didih, proses cepat, daya tembus

kuat dan kelembaban sangat tinggi sehingga mempermudah koagulasi protein

sel-sel mikroba yang menyebabkan sel hancur. Suhu efektifnya adalah 121oC

pada tekanan 5 kg/cm2 dengan waktu standar 15 menit. Alat yang digunakan :

pressure cooker, autoklaf (autoclave) dan retort.

2) Panas kering, biasanya digunakan untuk mensterilisasi alat-alat laboratorium.

Suhu efektifnya adalah 160oC selama 2 jam. Alat yang digunakan pada

umumnya adalah oven (Amir, 2009).

Sterilisasi adalah suatu proses yang dilakukan untuk mematikan semua

organisme yang terdapat pada atau didalam suatu benda. Ada 4 cara yang dilakukan

untuk mensterilisasi medium yaitu :

a) Mendidihkan medium beberapa jam sehingga semua benih kehidupan mati.

b) Otoklaf untuk sterilisasi menggunakan uap air panas bertekanan.

c) Tyndalisasi merupakan cara untuk mendidihkan medium dengan uap untuk

beberapa menit saja.

d) Penyaringan dilakukan dengan cara menyaring medium dengan saringan

porselin/tanah diatom yang mengakibatkan zat-zat organik tidak akan

mengalami penguraian (Hadioetomo, 1993).

Biakan murni bakteri adalah biakan yang terdiri atas satu spesies bakteri yang

ditumbuhkan dalam medium buatan. Medium buatan tersebut berfungsi sebagai

medium pertumbuhan. Pada medium ini bakteri dapat tumbuh dan berkembangbiak.

Bahan dasar yang digunakan untuk medium pertumbuhan ini adalah agar-agar.

Untuk bakteri heterotrof, medium dilengkapi dengan air, molekul makanan (misal

gula) sumber nitrogen dan mineral. Untuk hasil yang lebih baik agar bakteri tumbuh,

alat dan bahan yang digunakan disterilkan terlebih dahulu (Syamsir, 2008).

Lamanya waktu sterilisasi yang dibutuhkan bahan dipengaruhi oleh :

1. Resistensi mikroorganisme dan enzim terhadap panas

2. Kondisi pemanasan

3. pH bahan

4. Ukuran wadah/kemasan yang disterilkan

5. Keadaan fisik bahan (Hidayat, 2008).

Konsistensi medium dapat dibuat bermacam-macam bergantung pada

keperluannya. Misalnya medium cair seperti kaldu nutrient atau kaldu glukosa dapat

digunakan untuk berbagai keperluan seperti pembiakan organisme dalam jumlah

besar, penelaahan fermentasi dan berbagai macam uji. Bila diinginkan medium padat

dapat ditambahkan bahan pemadat ke dalam medium kaldu. Medium padat biasanya

digunakan untuk mengamati penampilan atau morfologi koloni dan mengisolasi

biakan murni. Sedangkan medium dengan konsistensi pertengahan disebut medium

setengah padat. Kegunaanya antara lain untuk menguji ada tidaknya motilitas dan
kemampuan fermentasi. Medium setengah padat seringkali mengandung baik gelatin

maupun agar-agar namun dalam konsentrasi lebih kecil daripada medium padat

(Hadioetomo, 1993).

Medium dapat dibuat beracam-macam bergantung kepada keperluannya.

Bahan yang paling umum digunakan untuk membuat medium menjadi padat dapat

dipakai agar. Praktisnya semua media yang digunakan untuk penyediaan medium

mikrobia sudah secara komersial dalam bentuk bubuk dan juga dalam bentuk siap

pakai. Dalam penyediaan media, kebanyakan bersifat alamiah sudah mengandung

semua nutrien yang dibutuhkan. Oleh karena itu, dalam pembuatan medium mikroba

dalam lingkup mikrobiologi sangat berkaitan dengan sterilisasi. Hal ini agar medium

yang dibuat dapat berhasil. Jadi, proses sterilisasi pun perlu dipelajari lebih dalam

(Pleczar,1986).

Zat-zat hara yang ditambahkan kedalam media tumbuh suatu mikroba adalah :
 Nitrogen, pada umumnya bakteri tidak dapat langsung menggunakan N2

bebas dari udara sehingga keperluannya diberikan.

 Karbon, sebagai sumber karbon digunakan berbagai gula, pati, glikogen.

 Vitamin, berbagai vitamin yang diperlukan bakteri adalah Thiamine,

riboflavin, asam nikotinat, asam pantotenat, biotin.

 Garam –garam kimia yang diperlukan adalah K, Na, Fe dan Mg

 Air sangat diperlukan untuk pertumbuhan dan pembiakan mikrobia. Air yang

digunakan dalam pembuatan media adalah aquadest (Lay. 1992).

Kebanyakan bakteri dapat hidup paling baik dalam keadaan sekitar netral,

oleh karena itu sebelum digunakan biasanya medium disesuaikan pada pH sekitar 7.

hanya sedikit bakteri yang dapat hidup dalam lingkungan ekstrem yang kisaran pH
nya 8,5 atau 2,2 karena itu pH harus disesuaikan dengan jenis mikroba yang

ditumbuhkan (Volk & Wheeler, 1993).

Panas lembab sangat efektif digunakan meskipun pada suhu yang tidak begitu

tinggi, karena ketika uap air berkondensasi pada bahan-bahan yang disterilkan

dilepaskan panas sebesar 686 kalori per gram uap air pada suhu 121oC. Panas ini

mendenaturasikan atau mengkoagulasikan protein pada organisme hidup dan dengan

demikian mematikannya (Amir, 2009).

Faktor – faktor yang menyebabkan berhentinya pertumbuhan mikroba antara

lain:

1. Penyusutan konsentrasi nutrisi yang dibutuhkan dalam pertumbuhan mikroba

karena habis terkonsumsi.

2. Produk akhir metabolisme yang menghambat pertumbuhan mikroba karena

terjadinya inhibisi dan represi.

Medium yang digunakan dalam fermentasi harus memenuhi syarat – syarat

sebagai berikut:

1. Mengandung nutrisi yang dibutuhkan bagi pertumbuhan sel.

2. Mengandung nutrisi yang dapat digunakan sebagai sumber energi bagi sel.

3. Tidak mengandung zat yang menghambat pertumbuhan sel.

4. Tidak terdapat kontaminan yang dapat meningkatkan persaingan dalam

penggunaan substrat.

Hal yang perlu ditekankan pada sterilisasi medium ini adalah larutan nutrisi

tidak boleh di sterilisasi bersamaan dengan larutan glukosa agar tidak terjadi proses

karamelisasi (Lay, 1992).

 BAB III

METODE PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Rabu tanggal 30 September 2009

bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas MIPA Unlam Banjarbaru.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah gelas piala, gelas ukur,

cawan Petri, pipet volumetrik, jarum ose, oven, otoklaf, lampu spiritus, pembakar

Bunsen, neraca analitik, hot plate, kertas saring, kapas.

Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah kentang, aquadest

500 ml, PDA bubuk 19,5 gr, NA bubuk 10 gr.

3.3 Prosedur Kerja

Pembuatan Mediunm Nutrient Agar

1. Ditimbang NA bubuk sebanyak 10 gr

2. Dituang aquadest sebanyak 500 ml ke dalam gelas ukur

3. Dipindahkan aquadest tersebut ke dalam Erlenmeyer

4. Dimasukkan NA ke dalam erlenmeyer

5. Dimasukkan magnetic stirer ke dalam Erlenmeyer

6. Ditaruh di atas hot plate

7. Dinyalakan, diatur suhunya dan kecepatannya

8. Ditunggu hingga mendidih dan homogen.

9. Dibuat sumbat dari kapas.

10. Disumbatkan pada erlenmeyer yang sudah berisi media PDA.

 11. Disterilisasi dengan menggunakan otoklaf pada suhu 1210C, tekanan 1 – 2

atm

Pembuatan Media Potato Dextrose Agar

1. Ditimbang PDA bubuk sebanyak 10 gr

2. Dituang aquadest sebanyak 500 ml ke dalam gelas ukur

3. Dipindahkan aquadest tersebut ke dalam Erlenmeyer

4. Dimasukkan PDA ke dalam erlenmeyer

5. Dimasukkan magnetic stirer ke dalam Erlenmeyer

6. Ditaruh di atas hot plate

7. Dinyalakan, diatur suhunya dan kecepatannya

8. Ditunggu hingga mendidih dan homogen.

9. Dibuat sumbat dari kapas.

10. Disumbatkan pada beaker gelas yang sudah berisi media PDA.

11. Disterilisasi dengan menggunakan otoklaf pada suhu 1210C, tekanan 1 – 2

atm
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Hasil yang dapat diperoleh dari praktikum kali ini adalah sebagai berikut :

Table 1. Hasil Praktikum

No Nama Media Gambar Keterangan
1 Media Nutrient Agar NA bubuk = 10 gr
(NA) Aquadest = 500 ml.
Warna sebelum= putih keruh
Warna sesudah = kuning cerah

2 Media Potato Dextose PDA bubuk = 19,5 gr

Agar (PDA) aquadest = 500 ml.
warna sebelum = putih keruh
warna sesudah = kuning bening

4.2 Pembahasan
Medium pertumbuhan mikrobia adalah suatu bahan yang terdiri dari

campuran nutrien yang diperlukan mikrobia untuk pertumbuhannya. Dengan

menggunakan bahan medium pertumbuhan, aktivitas mikrobia dapat dipelajari dan

dengan menggunakan medium tumbuh dapat dilakukan isolasi mikrobia menjadi

biakan murni. Pada dasarnya bahan-bahan untuk pertumbuhan medium dapat

dikelompokkan menjadi 3 kelompok yaitu bahan dasar yang meliputi air, agar yang

bersifat tidak diuraikan oleh mikrobia, gelatin yang merupakan protein yang dapat
diuraikan oleh mikrobia, dan silika gel yaitu bahan yang mengandung natrium silikat

khusus untuk menumbuhkan mikrobia yang bersifat obligat autotrof, unsur-unsur

nutrien yang dapat diambil dari bahan alam, meliputi karbohidrat, lemak dan asam-

asam organik, sumber nitrogen yang mencakup pepton dan protein, garam-garam

kimia (K, Na, Fe dan Mg), vitamin, dan sari buah, ekstrak sayuran dan susu. Serta

bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang sengaja ditambahkan ke dalam medium

dengan tujuan tertentu seperti indikator maupun antibiotik.

Dalam praktikum mikrobiologi harus menggunakan alat yang steril. Hal ini

bertujuan agar tidak terjadi kontaminasi terhadap lingkungan luar sehingga di dapat

hasil yang maksimal. Proses membuat peralatan menjadi steril disebut dengan proses

sterilisasi. Dimana sterilisasi adalah proses membebaskan suatu bahan seperti

medium pertumbuhan mikrobia ataupun peralatan laboratorium dari semua bentuk

kehidupan. Dalam proses sterilisasi ada empat cara utama yang dipakai, yaitu dengan

pemanasan, penggunaan bahan kimia, penyaringan (filtrasi), dan radiasi.

Sterilisasi penyaringan ini khususnya untuk bahan-bahan yang termolabil,

seperti ekstrak enzim, serum, toksin bakteri, dan medium pertumbuhan. Sterilisasi

dengan pemanasan, yaitu dengan pemijaran (menggunakan alat pijar/pembakar

spritus), udara panas (untuk peralatan yang terbuat dari bahan gelas, menggunakan

oven/hot air sterilizer dengan temperatur 170-1800 C selama 2-3 jam), uap air

panas/Tyndalisasi (sterilisasi bahan berair yang tidak tahan akan panas atau suhu

tinggi, seperti broth medium, ekstrak buah atau sayur, dengan menggunakan

dandang, temperaturnya 1000 C selama 30 menit dan diulang tiga kali dengan

interval 24 jam), dan uap air panas bertekanan (menggunakan autoklaf, temperatur
1210 C, 2 atm selama 15 menit dan untuk medium pertumbuhan mikroba, alat gelas,

dan larutan termolabil).

Dalam praktikum kali ini dilakukan percobaan dalam pembuatan media

Nutrient Agar (NA) dan media Potato Dextrose Agar (PDA). Dilihat dari

komposisinya, komposisi NA berbeda dengan PDA. NA komposisinya berasal dari

bahan olahan seperti beef extract dan peptone sehingga nutrisi yang dimilikinya lebih

banyak. Hal ini menyebabkan pertumbuhan mikrobanya menjadi lebih singkat, yaitu

selama 1 x 24 jam. PDA yang berbahan dasar alami yaitu langsung berasal dari

kentang murni didominasi dengan banyaknya kandungan karbohidrat. Oleh karena

itu hal ini yang menyebabkan pertumbuhan mikroba menjadi lebih lama, yaitu

selama 2 x 24 jam. Selain itu, perbedaan komposisi ini juga menyebabkan perbedaan

fungsinya, dimana medium NA berfungsi sebagai pertumbuhan bakteri dan media

PDA digunakan sebagai pertumbuhan jamur.

Terdapat beberapa persyaratan medium pertumbuhan untuk NA dan PDA.

Persyaratan itu antara lain adalah

a. Harus mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba

b. Harus mempunyai tekanan osmosa, tegangan permukaan, yang sesuai dengan

kebutuhan mikroba yang ditumbuhkan

c. Harus berada dalam kondisi steril sebelum digunakan, agar mikroba yang

diinginkan dapat tumbuh baik.

Dalam praktikum kali ini dilakukan percobaan dalam pembuatan media

Nutrient Agar (NA) dan media Potato Dextrose Agar (PDA). Untuk pembuatan

media NA digunakan 10 gr NA bubuk yang kemudian di larutkan dengan aquadest

sebanyak 500 ml. Kedua bahan tersebut dimasukkan ke dalam Erlenmeyer,

dipanaskan sekaligus dilakukan penghomogenan larutan di atas hot plate stirrer

dengan stirrer magnetic. Setelah mendidih dan homogen dilakukan sterilisasi dengan

otoklaf pada suhu 121oC tekanan 1-2 atm. Selanjutnya didiamkan 2x24 jam

didapatkan medium Na sebanyak 500 ml dengan warna kuning cerah.

Sama halnya dengan NA, saat pembuatan medium PDA digunakan 19,5 gr

bubuk PDA yang dicampurkan dengan aquadest sebanyak 500 ml. Kedua bahan

tersebut dimasukkan ke dalam Erlenmeyer, dipanaskan sekaligus dilakukan

penghomogenan larutan di atas hot plate stirrer dengan stirrer magnetic. Setelah

mendidih dan homogen dilakukan sterilisasi dengan otoklaf pada suhu 121oC

tekanan 1-2 atm Setelah didiamkan selama 2x24 jam didapatkan hasil medium PDA

dengan warna kuning bening.

 BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil praktikum yang dilakukan dapat di ambil kesimpulan

sebagai berikut :

1. Proses sterilisasi adalah proses membebaskan suatu bahan seperti medium

pertumbuhan mikrobia ataupun peralatan laboratorium dari semua bentuk

kehidupan.

2. Tahapan prepasi medium mikroba adalah mensterilkan peralatan yang akan

digunakan dalam pembuatan media, serta mempersiapkan bahan-bahan yang

akan digunakan. Pemilihan proses sterilisasi yang digunakan tergantung dari

jenis peralatan dan bahannya.

3. Hasil dari percobaan ini merupakan sebuah media NA dan PDA. Dimana

media NA berfungsi untuk menumbuhkan bakteri dan media PDA untuk

menumbuhkan jamur.

5.2 Saran

Dalam praktikum ini hendaknya melakukan tahapan-tahapan sterilisasi

dengan benar, agar media yang dibuat tidak terkontaminasi dan tidak cepat rusak

sehingga dapat menjadi tempat tumbuh mikroba dengan baik.

 DAFTAR PUSTAKA

Anaya. 2009. Biakan Murni dan Sterilisasi.

http://www.e-dukasi.net/index.php
Diakses tanggal 4 Oktober 2009

Amir. 2008. Pengendalian Mikroorganisme.

http://rachdie.blogsome.com/2006/10/14/pengendalian-mikroorganisme/
Diakses tanggal 4 Oktober 2009

Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek : Teknik dan Prosedur

Dasar Laboratorium. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Hidayat,Nur. 2008. Sterilisasi.

http://ptp2008.wordpress.com/2008/10/29/sterilisasi-dingin-dengan-paa/
Diakses tanggal 4 Oktober 2009

Jawel, E dan Levinson, W. E. 1992. Medical Microbiology and Immunology Prentice

Hall International Inc, USA.

Lay, B & Sugyo, H. 1992. Microbiology. Rajawali Press. Jakarta.

Pelczar,Jr.et al.1986. Dasar-Dasar Mirobiologi.Penerbit Universitas Indonesia:

Jakarta.

Syamsir, Elvira. 2008. Prinsip Sterilisasi Komersial Produk Pangan.

http://id.shvoong.com/exact-sciences/
Diakses tanggal 4 Oktober 2009

Volk and Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar, Edisi kelima. Erlangga. Jakarta