Anda di halaman 1dari 23

LAPORAN PRAKTIKUM ANALISIS INSTRUMEN

KELOMPOK 1D
Anggota :
Rahmi

Sertiana

N.

A.

Ana Yuliana

1111102000085

1111102000109

Subhan Asfari

Hestiawati

1111102000086

1111102000110

Ambar

Niekha Zoelienna I.

Khaerinnisa

1111102000090
Ichsana

Eskha

1111102000111
Widya

1111102000092
Nindya

Nurfitriani

1111102000095
Sri Puji Astuti
1111102000097
M.A.W. Khairurrijal
1111102000102
Beryl Zahyin Adyani
1111102000106

Raaflyan

Wahyu

1111102000112
A.

Khairunnisa
1111102000113
Andis Saputra
1111102000119
Khairul Bahtiar A.
1111102000117

P.

Program Studi Farmasi


Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah
Jakarta
Landasan Teori
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
Kromatografi cair kinerja tinggi(KCKT) atau biasa disebut dengan
HPLC(High Performance Liquid Chromatography) dikembangkan pada akhir
tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, KCKT merupakan teknik
pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa
tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain farmasi,
lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-industri makanan.
Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawasenyawa
organik,
anorganik,
maupun
senyawa
biologis;
analisis
ketidakmurnian(impuritis); analisis senyawa-senyawa yang tidak menguap(nonvolatil); penentuan molekul-molekul netral,ionik, maupun zwitter ion; isolasi dan
pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir
sama; pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace elements),
dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses industri.

Cara Kerja KCKT

Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut


terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati
suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini di atur oleh distribusi solut
dalam fase gerak dan fase diam.
Prinsip kerja instumentasi HPLC
HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari
sebuah campuran komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiap
komponen dalam sampel berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan
HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi
untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yang biasa digunakan (pada kolom)
HPLC jenis fasa terbalik adalah RMe2SiCl, dimana R adalah rantai alkana C-18
atau C8. Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya
(gradien elusi), misalnya : air:asetonitril (80:20), hal ini bergantung pada
kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah
berdasarkan kepolarannya, dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini akan
teramati pada spektrum yang punsak-puncaknya terpisah.

Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok,


yaitu: wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak, alat untuk
memasaukan sampel, kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak,
tabung penghubung, dan suatu computer atau integrator atau perekam.

Gambar KCKT secara umum

1. Wadah fase gerak


Wadah fase gerak harus bersih dan lembam(inert). Wadah pelarut
kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase
gerak.Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1-2 liter
pelarut.
Fase
gerak
sebelum
digunakan
harus
dilakukan
degassing(penghilangan gas) yang ada fase gerak. Sebab adanya gas akan
berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detector sehingga
akan mengacaukan analisis.
2. Fase gerak
Fasa gerak dari HPLC merupakan zat cair yang disebut eluen atau pelarut.
Berfungsi untuk membawa komponen-komponen campuran menuju ke
detektor, selain itu juga dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena
itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penetu keberhasilan
proses pemisahan. Persyaratan zat cair yang akan digunakan sebagai fasa
gerak sebagai berikut:
a)
Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang
akan dianalisis
b)
Zat cair harus murni, untuk menghindari masuknya kotoran yang dapat
mengganggu interpretasi kromatogram
c)
Zat cair harus jernih, untuk meghindari penyumbatan pada kolom
d)
Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak
beracun
e)
Zat cair tidak kental dan harus sesuai dengan detektor
Fasa gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk
menghindari partikel-partikel kecil. Selain itu adanya gas dalam fasa gerak juga

harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain
terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fasa gerak tetap
selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah
selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas.
Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang
kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase
terbalik adalah campuran larutan buffer dengan metanol atua campuran air
dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fasa gerak yang paling
sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut
yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan
dengan fase normal ini kurang umum dibanding fase terbalik.
3. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai
syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni pompa harus inert terhadap
fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan
karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu
memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak
dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang
digunakan dengan kecepatan 20mL/menit.
Tujuan pengggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah
menjamin proses penghantaraan fase gerak berlangsung secara tepat,
reprodusibel, konstan, dan bebas dari pengguan. Ada 2 jenis pompa dalam
KCKT yaitu: pompa dengan tekanan konstan dan pompa dengan aliran fase
gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan ini
lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
Dikenal 3 jenis pompa yang masing-masing memiliki keuntungan yaitu :
a)
Pompa Reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa
dengan cara gerakan piston maju mundur yang dijalankan oleh motor.
Gerakan piston memberikan aliran eluen yang konstan, memiliki volume
internal kecil (35-400 mL) menghasilkan tekanan tinggi (sampai 10.000
psi). Piston berupa batang gelas dan berkontak lengsung dengan pelarut.
b)
Pompa Displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) tersiri dari tabung yang
dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Menghasilkan aliran
yang cenderung tidak tergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas
pelarut. Memiliki keterbatasan kapasitas pelarut (
c)

250 mL) dan tidak

mudah untuk pergantian pelarut.


Pompa Pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi.Pompa
jenis ini murah, tetapi memiliki keterbatasan kapasitas dan tekanan yang
dihasilkan (<2000 psi) kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut
dan tekanan balik kolom.

4. Penyuntikan sampel pada KCKT/ injektor

Sampel-sampel cair dan larutan disuntukkan secara langsung ke dalam fase


gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat
penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup Teflon yang
dilengkapi dengan keluk sampel(sampel loop) internal atau eksternal.

Pada saat pengisian sampel, sampel digelontor melewati keluk sampel dan
kelebihannya dikeluarkan ke pembuangan.Pada saat penyuntikan, katup
diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan
menggelontor sampel ke kolom. Presisi penyuntikan dengan keluk sampel ini
dapat mencapai nilai RSD 0,1%. Penyuntikan ini mudah digunakan untuk
otomatisasi dan sering digunakan untuk autosampler pada KCKT.
5. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Parameter
Tabung kolom

Fase diam

Tekanan
operasional
Fase gerak

Kolom konvensional
Stenless steel
Panjang 3, 10, 15, 20, dan
25 cm
Diameter luar 0,25 inci
Diameter dalam 4,6 mm
Porous, silika ukuran kecil,
silika
yang
dimodifikasi
secara
kimiawi,
atau
polimer-polimer stiren/divinil
benzen.
Rata-rata diameter partikel
3,5 atau 10 m dengan
kisaran sempit
500-3000 psi
(35-215 bar)
Hidrokarbon+pelarut-pelarut
terklorinasi
atau
alcohol
untuk fase normal. Untuk
fase
terbalik
digunakan
metanol atau asetonitril+air
atau buffer.
Kecepatan
alir
:
1-3
mL/menit

Kolom mikrobor
Stanless steel
Panjang 25 dan 50 cm
Diameter luar 0,25 inci
Diameter dalam 1 tau 2 mm
Porous, silika ukuran kecil,
silika
yang
dimodifikasi
secara
kimiawi,
atau
polimer-polimer stiren/divinil
benzen.
Rata-rata diameter partikel
3,5 atau 10 m dengan
kisaran ukuran partikel yang
sempit
1000-5000 psi
(70-350 bar)
Hidrokarbon+pelarutpelarut terklorinasi atau
alcohol untuk fase normal.
Untuk
fase
terbalik
digunakan metanol atau
asetonitril+air atau buffer.
Kecepatan alir : 10-100
L/menit.
Modifikasi instrumen
Sistem
penghantaran

Kinerja

pelarut
yang
mempu
memberikan control aliran
di bawah 10 L/menit.
Katup
injeksi
sampel
bervolume
kecil;
sel
detector bervolume kecil.
Efisiensi meningkat dengan Sangat efisien dan sensitif,
berkurangnya
ukuran akan
tetapi
lambat.
partikel fase diam, akan Konsumsi fase gerak hanya
tetapi umur kolom dengan dari kolom konvensional.
ukuran partikel 3 m lebih
pendek.

6. Fase diam
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil
benzene. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya
residu gugus silanol(Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagenreagen seperti klorosilan.Reagen-reagen ini berekasi dengan gugus silanol
dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lainnya.
Oktadesil silika(ODS atau C18 ) merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa dengan kepolaran yang
rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lebih
sesuai untuk solute yang polar.
7. Detektor KCKT
Detektor pada KCKT dikelompokan menjadi 2 golongan yaitu: detector
universal(yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik,
dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor
spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan
mendeteksi analit secara spesifik dan slektif, seperti detektor UV-Vis, detektor
fluoresensi, dan elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel
Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada
kadar yang sangat kecil
Stabil pada pengoprasiannya
Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mempu meminimalkan
pelebaran pita. Untuk kolom konvensional, selnya bervolume 8 l atau
lebih kecil, sementara kolom mikrobor selnya bervolume 1 l atau lebih
kecil lagi.
Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada
kisaran yang luas(kisaran dinamis linier)
Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
8. Rekorder
Rekorder adalah alat untuk mencetak hasil percobaan pada lembar berupa
kumpulan puncak (kromatogram). Kromatogram HPLC yang didapat berguna
untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Luas peak menyatakan konsentrasi
komponen dalam campuran dan jumlah peak menyatakan jumlah komponen.

Analisis kualitatif dapat dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi


(rt) analit atau sampel dengan waktu retensi standar. Sedangkan analisis
kuantitatif depat dilakukan dengan didasarkan pada luas peak atau tinggi
peak dengan metode standar kalibrasi.

JENIS-JENIS HPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase
diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika
fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan
pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase
normal dan HPLC fase terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada
sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan
jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam
kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi
adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam
silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai
silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi
yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai
reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga
dapat menyebabkan puncak yang berekor. (Kealey and Haines, 2002)
2. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara
kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika
adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana,
oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah
oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase
terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau
dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah,
peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut
akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi
ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding
jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang
mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat. (Kealey and Haines, 2002)
3. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau
anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di
pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren
resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan
media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut

campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar


ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total
atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase
gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan
ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.
(Meyer, 2004)
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampelsampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode
penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang
berlawanan. (Meyer, 2004)
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat
digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul
> 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang
bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel),
atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh
lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang
ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini
disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat
diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi
ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe
kromatografi yang lain. (Meyer, 2004)
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang
sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat
menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik
tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen
dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari
campuran yang sangat kompleks. (Meyer, 2004)
PARACETAMOL (ACETAMINOPHEN)

Paracetamol mengandung tidak kurang dari 98,0% dan tidak lebih dari
101,0% C8H9NO2, dihitung terhadap zat anhidrat
BM
: 151,16
Pemeriaan : Serbuk hablur, putih, tak berbau, rasa sedikit pahit

Kelarutan
: Larut dalam air mendidih dan dalam NaOH 1N, mudah larut dalam
etanol
Titik lebur : 168-172oC
Penyimpanan
: disimpan di dalam wadah tertutup rapat dan tidak tembus
cahaya
(anonym, 1995)
Acetaminophen atau Parasetamol adalah obat analgetik dan antipiretik yang
digunakan untuk melegakan sakit kepala, sengal-sengal atau sakit ringan dan
demam. Parasetamol digunakan dalam sebagian resep obat analgetik selesma
dan flu. Berbeda dengan obat analgetik yang lain seperti aspirin dan ibuprofen,
parastamol tidak memiliki sifat antiradang.
Parasetamol merupakan derivate dari asetanilida yang efek enalgetiknnya
dapat diperkuat dengan koffein dengan kira-kira 50% dan codein. Overdose
dapat
menimbulkan
antara
lain
mual,
muntah
dan
anoreksia.
Penanggulangannya dengan cuci lambung, juga perlu diberikan zat-zat penawar
(asam amino N-asetilsistein atau metionin) sedini mungkin, sebaiknya 8-10 jam
setelah intoksikasi. Penggunaan parasetamol dalam dosis besar dan dalam
jangka waktu yang lama dapat menyebabkan kerusakan pada hati, untuk itu
parasetamol dikontraindikasikan untuk pasien dengan gangguan fungsi hati
berat. Wanita hamil dapat menggunakan parasetamol dengan aman, juga
selama laktasi walaupun mencapai susu ibu. Interaksi dengan dosis tinggi
memperkuat efek antikoagulansia dan pada dosis biasa tidak interaktif ( Tjay,
2000). Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus
kromofor yang dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV.
(Sani Ali, 2012)

Metode Kerja
A. Judul Praktikum
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) / kromatografi cair
kinerja tinggi
B. Tempat dan tanggal praktikum
Laboratorium PNA, 1 dan 8 Oktober 2013
C. Alat dan Bahan
-

Beker glass
Labu erlenmeyer
Labu ukur
Mikropipet

Membran filter
Syringe
Pipet tetes
Gelas vial

HPLC
Aquadest
Paracetamol
Coffein

KPOH4
Dapar fosfat
Etanol

D. Prosedur Kerja
1. Pembuatan larutan standar campuran kafein dan parasetamol
Buat pengenceran dari larutan induk masing-masing larutan
parasetamol dan kafein.
Labu ukur 10 ml disiapkan sebanyak dua buah. Lakukan
pengenceran untuk mendapatkan 6 ppm kafein dan 10 ppm
parasetamol.
Lalu kedua larutan dicampur hingga homogen.
Larutan campuran dianalisis menggunakan HPLC, dengan optimasi
yang sesuai.
Diamati waktu retensi standar dan luas area dibawah kurva
kromatogram.
2. Analisis kualitatif larutan kafein dan parasetamol
Ditimbang masing-masing 5,0 mg kafein dan parasetamol
Dimasukkan ke dalam labu terukur 50 mL
Ditambahkan aquadest hingga batas tanda, sehingga didapat
larutan kafein dan larutan parasetamol dengan konsentrasi 100
g/mL (larutan induk)
Encerkan masing-masing larutan induk, hingga diperoleh larutan
dengan konsentrasi 10 g/mL.
Lalu masing-masing larutan dianalisis menggunakan HPLC, dengan
optimasi yang sesuai.
Diamati waktu retensi standar dan luas area dibawah kurva
kromatogram.
3. Pembuatan larutan standar Kafein dan Parasetamol untuk kurva
kalibrasi
Buat 5 seri standar yang terdiri dari campuran parasetamol dan
kafein dengan konsentrasi tertentu.
Larutan
standar
1
2
3
4
5

Parasetamol

Kafein

10
12
14
16
18

6
8
10
12
14

4. Penetapan kadar sampel dalam sediaan yang beredar


Ditimbang satu tablet sediaan yang mengandung paracetamol dan
kafein. Lalu digerus.
Serbuk dilarutkan menggunakan pelarut yang sesuai (air), cukupkan
hingga 100mL.
Dibuat larutan dengan konsentrasi 14 ppm untuk mengukur kadar
PCT
Dibuat larutan dengan konsentrasi 10 ppm untuk mengukur kadar
kafein

Lalu masing-masing larutan dianalisis menggunakan HPLC, dengan


optimasi yang sesuai.
Hasil kromatorgram berupa waktu retensi dan luas area dibawah
kurva diamati.

Hasil dan Pembahasan


KUALITATIF

Hasil
Standar Eksternal
N
o
1
2

Nama Peak
Standar Parasetamol (10
ppm)
Standar Kofein (10 ppm)

Waktu
Retensi
(menit)
1,63
4,34

27,942

Area
(mAU x
menit)
2,463

46,713

9,372

Tinggi
(mAU)

Sampel Campuran
N
o

Nama Peak

1
2

Senyawa 1
Senyawa 2

Waktu
Retensi
(menit)
1,72
3.73

Tinggi
(mAU)
37,602
47,751

Area
(mAU x
menit)
3,232
15,231

Perhitungan Kadar
Karena waktu retensi senyawa 1 hampir sama dengan parasetamol, maka
senyawa 1 dianggap parasetamol.

Serta karena waktu retensi senyawa 2 hampir sama dengan kofein, maka
senyawa 2 dianggap dianggap.

Pembahasan
Pada praktikum ini digunakan HPLC/KCKT untuk analisis paracetamol,
coffein, serta sampel campuran dari paracetamol dan coffein secara kualitatif.
Fase gerak yang digunakan adalah campuran KH 2PO4, metanol, dan asetonitril
dengan perbandingan 90 ml: 6 ml : 4 ml. Sedangkan Okta Desil Silan (C18)
digunakan sebagai fase diam. Penggunaan campuran eluen atau fase gerak yang

sedemikian rupa merupakan hasil dari pengalaman pemisahan campuran


parasetamol dengan kofein. Dapar fosfat (KH 2PO4) pH 4,5 digunakan karena
kedua senyawa tersebut stabil dalam kondisi yang sedikit asam. Campuran
metanol dengan asetontril akan mengkondisikan sistem eluen bersifat semi
polar, hal tersebut terkait sifat kepolaran senyawa yang dianalisis. Parasetamol
dan kofein bersifat semi polar karena mengandung gugus yang memiliki elektron
bebas (sehingga bersifat polar), sekaligus memiliki struktur siklik yang bersifat
nonpolar.Fase diam yang berupa okta desil silan (C18) bersifat nonpolar.
Kombinasi dari sistem eluent dan adsorban (fase diam) akan menimbulkan
proses tarik menarik solute pada sampel diantara keduanya sehubungan dengan
kemiripan dari sifat kepolaran solute dengan eluent dan adsorben. Hasilnya
berupa waktu retensi yang bersifat khas dari senyawa tertentu dalam solute
terhadap sistem KCKT yang digunakan.

Parasetam
olnknjnjolo
l

Kofein

Gugus yang menentukan sifat polar, Gugus yang menentukan sifat


nonpolar
Detektor yang digunakan berupa detektor UV-Vis dengan pertimbangan
bahwa senyawa yang dianalisis memiliki gugus kromofor. Panjang gelombang
yang digunakan adalah 215 nm, suhu 27.3 0C-27.50C, dan volume alir 0,7
ml/menit. Pengkondisian sistem kromatografi ini diadaptasi dari hasil
pengalaman optimasi untuk memisahkan sampel campuran parasetamol-kofein
serta disesuaikan dengan campuran eluen dan adsorban yang digunakan.
Sehubungan dengan telah diketahuinya komponen dalam sampel, maka elusi
digunakan dengan sistem isokratik, dimana gradien persentasi komponen eluen
selalu sama.
Sebelum dilakukan pengujan terhadap sampel campuran, dibuat larutan
standar dari komponen sampel tersebut. Metode analisis ini menggunakan
standar eksternal karena kadar komponen sampel cukup besar dan dalam
rentang deteksi teliti instrument analisis yang digunakan. Dibuat larutan standar
parasetamol dan kofein dengan kadar masing-masing 10 ppm. Medium pelarut
yang digunakan untuk pembuatan standar adalah aquades terkait
ketidaktersediaan aquades.Untuk meminimalisasi keikutsertaan pengotor saat
analisis, standar disaring terlebih dahulu dengan penyaring mikro.Selanjutnya
standar dianalisis menggunakan KCKT dengan sistem instrument yang telah
dipersiapkan sebelumnya, untuk menentukan waktu retensi masing-masing

senyawa. Diketahui bahwa waktu retensi parasetamol pada sistem KCKT ini
adalah 1,63 menit dengan luas area di bawah kurva 2,463 mAU*menit
sedangkan kofein 4,34 menit dengan luas area di bawah kurva 9,372
mAU*menit. Waktu retensi akan menjadi acuan untuk menentukan identitas peak
yang dihasilkan pada kromatogram hasil analisis sampel campuran. Dari hasil
analisis larutan standar, dihasilkan bentuk kromatogram berbahu (shoulder)
dengan sedikit tailing. Hal ini disebabkan oleh terlalu banyak pengotor yang
ikutserta dalam proses analisis dengan KCKT.
Selanjutnya dilakuan analisis sampel campuran parasetamol.Waktu retensi
yang dihasilkan pada peak 1 adalah 1.72 menit dengan luas area di bawah kurva
3.232 (mAU*min) dan peak 2 adalah 3.73 (menit) dengan luas area dibawah
kurva 15.231 (mAU*min).Bentuk kromatogram yang dihasilkan adalah bentuk
berbahu (shoulder) dengan sedikit tailing.Kemudian dibandingkan waktu retensi
standar dengan waktu retensi sampel.Dilihat dari kedekatan nilai (waktu retensi),
diputuskan bahwa peak 1 merupakan parasetamol dan peak 2 merupakan
kofein.Dilihat dari perbandingan waktu retensi standard dan sampel, terjadi
perubahan yang cukup signifikan.Perubahan ini mungkin terjadi karena terjadi
reaksi antara komponen sampel dengan campuran eluen yang didukung dengan
kondisi sistem saat analisis.Reaksi tersebut mungkin menghasilkan produk yang
secara struktur kimia berbeda dengan senyawa sampel yang selanjutnya
berimplikasi pada perubahan waktu retensi.Selain itu ketidakstabilan
temperature kolom meningkatkan viskositas eluent serta kelarutan senyawa
dalam sampel.Perubahan viskositas eluent serta kelarutan senyawa sampel
mendukung perubahan waktu retensi pada setiap kali analisis.
Selain melakukan uji kualitatif terhadap sampel, dilakukan pula uji
kuantitatif terhadap kadar komponen dalam sampel campuran. Penghitungan
kadar dapat dilakukan dengan membandingkan luas area dibawah kurva pada
komponen sampel terhadap luas area kurva pada standar, dikali dengan
konsentrasi standar. Dengan cara tersebut, diperoleh kadar parasetamol pada
sampel campuran sebesar 13,122 ppm dan kofein sebesar 16,252. Untuk
memastikan tingkat kepercayaan analisis, perlu dilakukan uji validasi terhadap
data hasil analisis.

KUANTITATIF
A. Pembuatan seri standar
Larutan induk 1000 ppm
1. Konsentrasi 4 ppm
M1 X V1 = M2 X V2
100 ppm X V1 = 4 ppm X 5 mL
V1 = 0,2 mL = 200 L
2. Konsentrasi 6 ppm
M1 X V1 = M2 X V2
100 ppm X V1 = 6 ppm X 5 mL
V1 = 0,3 mL = 300 L
3. Konsentrasi 8 ppm

M1 X V1 = M2 X V2
100 ppm X V1 = 8 ppm X 5 mL
V1 = 0,4 mL = 400 L
4. Konsentrasi 10 ppm
M1 X V1 = M2 X V2
100 ppm X V1 = 10 ppm X 5 mL
V1 = 0,5 mL = 500 L
5. Konsentrasi 12 ppm
M1 X V1 = M2 X V2
100 ppm X V1 = 12 ppm X 5 mL
V1 = 0,6 mL = 600 L
Hasil Kromatogram
1. Optimasi
Volume injection

: 10

Run time
: 7 menit
Panjang gelombang
: 215 nm
Dtektor
: Uv-Vis
Jenis kolom
: Silika C18
Jenis pelarut
: - Kalium dihidrogen fosfat 90%
Methanol 4%
Asetonitril 6%
-

2. Uji Kualitatif (Data terlampir)


a. Parasetamol
Ret.
Time
(min)
1.63

Heig
ht
(MAU
)
27.94
2

Area
MAU*min

Rel.Area
%

Type

2.463

66.69

BMB

Heig
ht
(MAU
)
46.73
1

Area
MAU*min

Rel.Area
%

Type

9.372

74.91

BM

Heig
ht
(MAU
)
37.60
2
47.75
1

Area
MAU*min

Rel.Area
%

Type

3.232

15.89

15.231

74.89

MB

b. Kafein
Ret.
Time
(min)
4.34
c. Campuran
Ret.
Time
(min)
1.72
3.73

2. Uji Kuantitatif kadar Sampel yang beredar (Data Terlampir)

a. Persamaan linier Parasetamol dan Kafein


Stand
ar
1
2
3
4
5

Konsentra
si (ppm)
PC Kafei
T
n
10

12

14

10

16

12

18

14

Luas Area
(mAU*min)
PCT
Kafei
n
10.48 3.592
7
14.23 8.531
1
21.17 6.520
0
23.61 12.34
3
4
29.7 13.3
63
09

Plates
PCT
256
8
198
6
242
9
269
6
234
7

Kafei
n
3681
2405
4386
4450
415
3

Asym
PCT
2,9
7
3,1
0
3,3
0
3,4
4
3,3
3

Resolusi

Kafei
n
2,41

PCT
9,12

Cafeii
n
-

3,31

9.58

1,44

3,33

10,5
0
9,74

2,50

9,84

b. Penetapan kadar parasetamol (10 ppm) dalam Panadol


Diketahui : kadar pada etiket 500 mg
Luas area mAU*min = y = 90,208
Persamaan regresi untuk parasetamol y = 2,3967x
13,701
90.208 = 2,3967x 13,701

Konsentrasi sebelum pengenceran


pengenceran

= 43,355 ppm X faktor

= 43,355 ppm x
= 21677,5 ppm

c. Penetapan kadar kafein (10 ppm) dalam Panadol


Diketahui : kadar pada etiket 65 mg
Luas area mAU*min = y = 10,055
Persamaan regresi untuk kafein y = 1,1624 x
2,7643
10,055 = 1,1624 x 2,7643

Konsentrasi sebelum pengenceran


pengenceran

= 11.0283 ppm X faktor

= 11.0283 ppm x

= 716,8395 ppm

d. Penetapan kadar parasetamol (14 ppm) dalam Bodrex


Diketahui : kadar pada etiket 600 mg
Luas area mAU*min = y = 25,14
Persamaan regresi untuk parasetamol y = 2,3967x
13,701
25,142 = 2396,7x - 13701

Konsentrasi sebelum pengenceran


pengenceran

= 16,2069 ppm X faktor

= 16,2069 ppm x
= 6945,814 ppm

e. Penetapan kadar kafein (10 ppm) dalam Bodrex


Diketahui : kadar pada etiket 50 mg
Luas area mAU*min = y = 7,635
Persamaan regresi untuk kafein y = 1,1624 x
2,7643
7,635 = 1,1624 x 2,7643

Konsentrasi sebelum pengenceran


pengenceran

= 8,9464 ppm X faktor

= 8,9464 ppm x
= 447.32 ppm

Pembahasan

Pada praktikum kali ini, dilakukananalisis kuantitatif kadar paracetamol dan coffein
pada sampel obat yang beredar yaitu Panadol dan Bodrex dengan instrument analisis
HPLC. Sebelum masuk tahap pengujian terhadap kadar paracetamol dan coffein, dilakukan
optimasi instrument analisis yang digunakan. HPLC/KCKT dioptimasi melalui studi
literature analisis sampel campuran paracetamol dan coffein. Berdasarkan hasil studi,

ditentukan bahwa fase gerak yang digunakan adalah campuran KH 2PO4, metanol, dan
asetonitril dengan perbandingan 90 ml: 6 ml : 4 ml. Sedangkan Okta Desil Silan (C18)
digunakan sebagai fase diam.Detektor yang digunakan berupa detektor UV-Vis dengan
pertimbangan bahwa senyawa yang dianalisis memiliki gugus kromofor. Panjang gelombang
yang digunakan adalah 215 nm, suhu 27.30C-27.50C, dan volume alir 0,7 ml/menit.
Penggunaan campuran eluen atau fase gerak yang sedemikian rupa merupakan hasil
dari hasil uji peneliti lain terhadap campuran parasetamol dengan kofein. Dapar fosfat
(KH2PO4) pH 4,5 digunakan karena kedua senyawa tersebut stabil dalam kondisi yang sedikit
asam. Campuran metanol dengan asetontril akan mengkondisikan sistem eluen bersifat semi
polar, hal tersebut terkait sifat kepolaran senyawa yang dianalisis. Parasetamol dan kofein
bersifat semi polar karena mengandung gugus yang memiliki elektron bebas (sehingga
bersifat polar), sekaligus memiliki struktur siklik yang bersifat nonpolar. Fase diam yang
berupa okta desil silan (C18) bersifat nonpolar. Kombinasi dari sistem eluent dan adsorban
(fase diam) akan menimbulkan proses tarik menarik solute pada sampel diantara keduanya
sehubungan dengan kemiripan dari sifat kepolaran solute dengan eluent dan adsorben.
Hasilnya berupa waktu retensi yang bersifat khas dari senyawa tertentu dalam solute terhadap
sistem KCKT yang digunakan.
Setelah instrument analisis dioptimasi, dilakukan praperlakuan terhadap sampel.
Kedua jenis sampel digerus dalam lumpang yang berbeda, selanjutnya di larutkan dalam fase
gerak sampai 100 mL. Selanjutnya disaring dengan penyaring mikro untuk meminimalisasi
terbawanya esksipien yang tidak larut. Diprediksi bahwa kadar dalam larutan uji masih
terlalu tinggi untuk dilakukan analisis kadarnya dengan HPLC/KCKT, dan sehingga
diperlukan pengenceran. Prediksi kadar dilakukan dengan melihat komposisi sediaan yang
tertera pada brosur. Rata-rata, kedua sediaan tersebut mengandung 500 mg parasetamol dan
50 mg kafein. Pengenceran dilakukan dengan menambah sejumlah larutan fase gerak pada
sejumlah sampel uji. Karena kafein memiliki kadar yang paling kecil, maka pengenceran
dilakukan dengan bertolak pada kadar kaffein pada sediaan.
Sebelum dilakukan pengujan terhadap sampel, dibuat larutan standar dari komponen
sampel tersebut. Metode analisis ini menggunakan kruva standar yang berisi campuran
parasetamol dan kaffein dalam rentang tertentu. Digunakan larutan standar yang berisi
campuran senyawa komponen sampel karena kemungkinan pergeseran waktu retensi dapat
terjadi jika komponen standar dibuat dalam masig-masing larutan. Medium pelarut yang

digunakan untuk pembuatan standar adalah fase greak yang digunakan. Untuk
meminimalisasi keikutsertaan pengotor saat analisis, standar disaring terlebih dahulu dengan
penyaring mikro. Selanjutnya standar dianalisis menggunakan KCKT dengan sistem
instrument yang telah dipersiapkan sebelumnya, untuk menentukan waktu retensi masingmasing senyawa. Waktu retensi akan menjadi acuan untuk menentukan identitas peak yang
dihasilkan pada kromatogram hasil analisis sampel campuran. Dari hasil analisis larutan
standar, dihasilkan bentuk kromatogram berbahu (shoulder) dengan sedikit tailing. Hal ini
disebabkan oleh terlalu banyak pengotor yang ikutserta dalam proses analisis dengan KCKT.
Dengan memplot luas area dibawah kurva pada masing-masing larutan standar sebagai y, dan
konsentrasi yang dibuat sebagai x, didapatkan persamaan regresi linier untuk parasetamol y =
2.3967x - 13.701 dengan nilai R = 0.99217 dan koffein y = 1.1624x - 2.7643 dengan nilai R =

0.909945. Dapat dilihat dari nilai R bahwa kurva regresi linier untuk kaffein tidak terlalu
linier.
Kemudian dilakukan pengujian terhadap kedua larutan sampel pada HPLC/KCKT.
Dari hasil pengujian, didapatkan luas area permukaan masing-masing komponen larutan uji.
Dengan mensubstitusi luas area permukaan sebagai y pada masing-masing persamaan linier,
maka didapat konsentrasi komponen tertentu dalam larutan. Lalu masing-masing kadar yang
diperoleh dikalikan faktor pengenceran dan volume pengenceran awal untuk mengetahui
jumlah masing-masing komponen. Diketahui dari larutan uji Panadol terdapat paracetamol
2167.75 mg dan koffein 71,683 mg, dan pada bodrex mengandung parasetamol 694,58 mg
dan kaffein 44,732 mg. Setiap komponen hasil uji memiliki jumlah berbeda dengan yang
tertera pada etiket. Hal ini mungkin terjadi karena masih terdapat pengotor yang ikut terbaca
pada HPLC/KCKT.
Untuk menguji kevalidan hasil analisis, maka dilakukan perhitungan terhadap %
recovery. Dari hasil perhitungan, didapatkan % recovery PCT 2,219% dan kaffein
10,863%.Karena % recovery lebih dari 2%, maka disimpulkan bahwa hasil percobaan tidak
valid.

Kesimpulan dan Saran

Kesimpulan
Waktu retensi parasetamol pada sistem KCKT menurut percobaan kali ini
adalah 1,63 menit dengan luas area di bawah kurva 2,463 mAU*menit,
sedangkan waktu retensi kofein adalah 4,34 menit dengan luas area di bawah
kurva 9,372 mAU*menit. Sementara itu waktu retensi yang dihasilkan pada
sampel campuran adalah peak 1 adalah 1.72 menit dengan luas area di bawah
kurva 3.232 (mAU*min) dan peak 2 adalah 3.73 (menit) dengan luas area
dibawah kurva 15.231 (mAU*min), dengan bentuk kromatogram yang dihasilkan

adalah bentuk berbahu (shoulder) dengan sedikit tailing. Menurut kami peak 1
merupakan parasetamol dan peak 2 merupakan kofein. Sedangkan untuk uji
kuantitatifnya, kadar parasetamol pada sampel campuran didapat sebesar
13,122 ppm dan kofein sebesar 16,252 ppm. Pada percobaan kali ini masih
terdapat perbedaan waktu retensi standard yang diperoleh dengan waktu retensi
sampel, hal ini kemungkinan terjadi karena adanya reaksi antara komponen
sampel dengan campuran eluen yang didukung dengan kondisi sistem saat
dilakukan analisis, selain itu ketidakstabilan temperature kolom juga dapat
mempengaruhi waktu retensi, dan begitupula halnya dengan terjadinya human
error.

Saran
Lakukanlah pengoptimalan instrumen terlebih dahulu sebelum melakukan
percobaan, dan lakukanlah percobaan secara hati-hati dan teliti untuk
menghindari terjadinya human error.

Daftar Pustaka

Meyer, F.R., 2004, Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4thEd., John Wiley &

Sons, New York.


Kealey, D and Haines, P.J., 2002, Instant Notes: Analytical Chemistry, BIOS Scientific
Publishers Limited, New York.

Sani Ali, Audu. et all 2012. Analysis of Different Brands


of Paracetamol 500mg Tablets Used In Maiduguri,. Using Ultra Violet
Spectrophotometric and High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Methods. Nigeria ; IRJP


Tjay, T.H. 2000. Obat-obat Penting. Edisi kelima. Cetakan Pertama.

Jakarta ; PT. Elex Media Computindo


Anonim, 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta ; Departemen
Kesehatan Republik Indonesia