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ANLISE DE

PESQUISA

PROTEOMAS
O despertar da era ps-genmica
rotenas so polmeros de aminocidos resultantes da traduo das
informaes genticas contida no
DNA das clulas. O termo protena
vem do grego proteios e significa a
mais importante. De fato, as protenas compem um conjunto de molculas indispensveis para todos os seres
vivos do planeta. Elas so as biomolculas
mais abundantes e ocorrem em grande
diversidade, podendo agir como enzimas,
anticorpos, hormnios, componentes estruturais, receptores celulares, etc. Devido
a essa diversidade de funes, as protenas
exercem papel fundamental em quase todos os fenmenos biolgicos, como produo de energia, defesa imunolgica, contrao muscular, atividade neuroqumica e
reproduo. Do ponto de vista comercial,
bilhes de dlares so gerados anualmente
por indstrias que trabalham com protenas, como as farmacuticas e alimentcias.
J se discute at o uso de protenas em
eletrnica e computao de maneira rotineira no futuro.

Marcelo Valle de Sousa

Professor Adjunto e Coordenador do CBSP


CBSP - Centro Brasileiro de Servios e Pesquisas em
Proteinas
Laboratrio de Bioqumica e Qumica de Protenas
Departamento de Biologia Celular
Universidade de Braslia
mvsousa@unb.br

Wagner Fontes

Professor Adjunto e Pesquisador do CBSP


CBSP - Centro Brasileiro de Servios e Pesquisas em
Proteinas
Laboratrio de Bioqumica e Qumica de Protenas
Departamento de Biologia Celular
Universidade de Braslia
wagnerf@unb.br

Carlos Andr Ornelas Ricart

Professor Adjunto e Pesquisador do CBSP


CBSP - Centro Brasileiro de Servios e Pesquisas em
Proteinas
Laboratrio de Bioqumica e Qumica de Protenas
Departamento de Biologia Celular
Universidade de Braslia
ricart@unb.br
Fotos cedidas pelos autores

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Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

Genomas e Proteomas
Nos ltimos vinte anos, a Bioqumica
sofreu uma verdadeira revoluo, principalmente devido aos espetaculares avanos na rea de Biologia Molecular, que vem
disponibilizando uma incrvel gama de
informaes moleculares sobre os sistemas
biolgicos. Destaca-se a enorme quantidade de sequncias de DNA fornecida pelos
projetos de sequenciamento total de genomas. Hoje j so conhecidas as sequncias
completas dos genomas de microorganismos como Haemophilus influenza, Mycoplasma genitalium, Escherichia coli e Sacharomyces cerevisiae. Espera-se, para o
comeo do prximo sculo, a sequncia
total do genoma humano.
A partir das sequncias de DNA dos
genes, pode-se deduzir a sequncia de
aminocidos das protenas por eles codifi-

Figura 1-Eletroforese bidimensional.


O gel de IPG incubado com a
soluo contendo a amostra e,
posteriormente, submetido a um
campo eltrico para a focalizao
isoeltrica ou primeira dimenso. As
protenas focalizadas so, ento,
submetidas a uma segunda dimenso,
que as separar de acordo com suas
massas moleculares. Aps colorao,
o perfil bidimensional pode ser
visualizado.
cadas. Essa informao de grande importncia, j que a sequncia de aminocidos
de uma protena (ou estrutura primria) a
caracterstica primordial que define sua
forma e funo. Por outro lado, o sequenciamento de genes revela muito pouco
sobre como as protenas de um organismo
operam individualmente ou em conjunto
para exercer suas funes. Alm disso,
sabe-se que, aps serem sintetizadas, as
protenas podem sofrer importantes modificaes chamadas ps-traducionais, como
glicosilaes e fosforilaes. Tais informaes no podem ser retiradas exclusivamente da sequncia dos genes, havendo
necessidade de estudos diretos das prote-

de drogas, poluio ou mesmo estresse


nervoso. O proteoma , portanto, o resultado da expresso de um conjunto de
genes e das modificaes ps-traducionais
das protenas produzidas em resposta a
condies ambientais definidas.
Mtodos Utilizados

Figura 2-Equipamento de
eletroforese bidimensional.
nas. Do mesmo modo, o estudo do genoma no permite saber que protenas esto
expressas realmente em uma determinada
clula em um dado momento. Dentro desse
contexto, torna-se importante o estudo em
larga escala das protenas por meio de
projetos de anlise de proteomas.
PROTEOMA um termo relativamente
novo, que significa o conjunto de PROTEnas expressas por um genOMA. O genoma
de um organismo, como por exemplo o de
um ser humano, praticamente constante,
independente de qual das diferentes clulas (excetuando-se vulos e espermatozides) est sendo analisada ou de variaes
no meio ambiente. Por outro lado, o proteoma de um neurnio ser bastante diferente do proteoma de um linfcito do mesmo
indivduo, j que as diferenas morfolgicas e funcionais entre as duas clulas so
reflexo do conjunto de protenas produzidas por cada uma. O mesmo tipo de clula
pode apresentar diferentes proteomas em
resposta a estmulos externos como a ao

Figura 3-Espectrmetro de massa do


tipo electrospray triple-quadrupole,
dedicado ao estudo de protenas e
proteomas.

Nos projetos de proteomas, um dos


objetivos primrios separar e visualizar o
mximo de protenas possvel de uma
fonte, permitindo que sejam catalogadas
computacionalmente e estudadas por tcnicas analticas. Atualmente a eletroforese
bidimensional em gel de poliacrilamida o
mtodo mais eficiente de separao simultnea de centenas ou milhares de protenas
(Figuras 1 e 2). Pode-se dizer que a eletroforese bidimensional o corao da
anlise de proteomas. Em qualquer tipo de
separao eletrofortica, molculas que
possuam cargas, migram sob a influncia
de um campo eltrico. A velocidade de
migrao depender de fatores como tamanho, forma e carga eltrica. No caso da
eletroforese bidimensional, as protenas
so submetidas a dois processos (duas
dimenses) consecutivos de separao
baseados em propriedades diferentes das
protenas. Assim, durante a primeira dimenso, denominada focalizao isoeltrica (IEF), as protenas so separadas em um
gel de poliacrilamida que forma um gradiente de pH e migram at atingirem uma
posio estacionria onde possuam carga
lquida zero (ponto isoeltrico).
Na segunda dimenso, as protenas
separadas pela IEF so submetidas a uma
eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida que separa as protenas de acordo com suas massas moleculares. Como os
parmetros usados na primeira dimenso
(ponto isoeltrico) e na segunda dimenso
(massa molecular) so independentes, uma
grande resoluo atingida. Mais de 8.000
protenas podem ser separadas em um
nico gel bidimensional. A eletroforese
bidimensional foi desenvolvida h mais de
20 anos, porm seu uso em anlise de
proteomas esteve limitado at h pouco
tempo devido baixa reprodutibilidade
dos gis obtidos e inexistncia de mtodos sensveis o bastante para identificar as
protenas separadas. O surgimento da tcnica de gradientes imobilizados de pH
(IPG) permitiu uma reprodutibilidade muito maior nos gis bidimensionais, enquanto que avanos recentes nas tcnicas de
microssequenciamento automtico e espectrometria de massa de protenas permitiram que protenas em quantidades da
ordem de fentomoles (10-15 Mol) pudessem
ser identificadas.
A identificao de uma protena muito

facilitada se sua sequncia for conhecida e


estiver depositada em bancos de dados de
sequncias, os quais podem ser acessados
via Internet. A sequncia parcial de aminocidos proveniente de uma mancha da eletroforese bidimensional pode ser usada para
fazer uma busca nos bancos de dados e
identificar a protena. Uma abordagem ainda
mais moderna e sensvel faz uso da espectrometria de massa de protenas.
A espectrometria de massa uma metodologia que permite a determinao da
massa molecular de compostos com altssima preciso. Apenas no incio da dcada de
80, a espectrometria de massa comeou a ser
mais aplicada em determinaes de massas
moleculares de protenas. Com o desenvolvimento de equipamentos cada vez mais
especializados para protenas (Figura 3), a
espectrometria de massa tornou-se ferramenta revolucionria na qumica de protenas moderna. A espectrometria de massa
vem permitindo a identificao de protenas
por uma metodologia denominada peptide
mass fingerprinting (Figura 4). Esta metodologia baseada na digesto da protena a
ser identificada por uma enzima proteoltica
(por exemplo, a tripsina) produzindo fragmentos denominados peptdios. As massas
desses peptdios so ento determinadas
com grande acuidade (0,1-0,5 Da) por espectrometria de massa. As massas obtidas
formam uma espcie de impresso digital
(peptide mass fingerprinting) da protena.
Softwares especiais permitem comparar o
peptide mass fingerprinting da protena
que queremos identificar com os gerados
teoricamente para todas as sequncias de
protenas presentes nos bancos de dados. Se
a sequncia da protena problema estiver no
banco de dados ela ser imediatamente
identificada.
A espectrometria de massa tambm pode
ser usada para sequenciar pequenas regies
dos peptdios. O uso das pequenas sequncias obtidas em conjunto com as informaes de massas moleculares constitui uma
poderosa tcnica de identificao de protenas conhecida como sequence tag.
Os dados de anlise de proteomas so
armazenados na forma de Mapas de Referncia ou Mapas de Proteomas, os quais so
obtidos por scanning dos gis bidimensionais corados e anlise das imagens por
meio de programas especiais. Assim, a posio das manchas e a intensidade dos sinais
so calculadas para quantificao, determinao de ponto isoeltrico e massa molecular. Os Mapas de Proteomas indicam tambm a descrio das protenas j identificadas pelas tcnicas descritas anteriormente.
Uma lista de Mapas de Proteomas est
disponvel na WWW no stio WORLD-2DPAGE
no
endereo
URL:
http://
expasy.hcuge.ch/ch2d/2d-index.html.

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

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classificadas em conjuntos de protenas coestimuladas (stimulons) ou co-reguladas


(regulons). Torna-se, portanto, muito
importante o emprego da anlise de proteomas no estudo do efeito de frmacos
sobre clulas para verificar que protenas
so afetadas alm da protena-alvo. Outra
possibilidade da anlise de proteomas a
comparao de tecidos humanos normais e
doentes. No caso de cncer, vrias protenas marcadoras j foram identificadas por
anlise de proteomas.
Situao no Brasil

Figura 4-Identificao de
protenas por espectrometria de
massa. Uma mancha protica de
um gel bidimensional (1)
cortada e transferida para um
tubo onde sofre digesto
proteoltica (2). Os peptdios
resultantes so separados de sais
e outras micromolculas (3) e
aplicados no espectrmetro de
massa (4). As massas dos
peptdios so usadas para fazer
buscas em bancos de dados por
mtodos computacionais,
resultando na identificao da
protena (5).

Aplicaes Biotecnolgicas
A existncia de Mapas de Proteomas
disponveis na Internet permite que pesquisadores de todo o mundo, trabalhando
em diversos assuntos envolvendo expresso de protenas, tais como efeito de frmacos, condies patolgicas, diferenciao
celular, comparao de variedades da mesma espcie e respostas celulares a estmulos externos diversos, possam identificar
mais facilmente as protenas expressas ou
reprimidas, precisando para isso apenas
obter o perfil bidimensional das protenas
de seu sistema nas mesmas condies dos
Mapas de Referncia disponveis.
Hoje, j se vislumbra uma enorme gama
de aplicaes a partir do conhecimento
detalhado dos proteomas, principalmente
em medicina, agropecuria e biotecnologia. Por exemplo, a comparao de expresso de cepas patognicas e no patognicas de microorganismos pode ajudar no
desenvolvimento de mtodos diagnsticos
e de agentes teraputicos. A anlise de
proteomas acoplada tcnicas de knockout de genes pode demonstrar os efeitos metablicos da protena nocauteada e
verificar se outros genes so co-regulados.
De fato, mais de 1000 protenas j foram

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Projetos de anlise de proteomas esto


sendo considerados altamente estratgicos
neste momento em que se inicia a Era PsGenmica e esto recebendo pesados
apoios de governos de pases como Estados Unidos, Dinamarca, Frana, Alemanha,
Inglaterra, Japo e Austrlia. Centros para
anlise de proteomas foram ou esto sendo
criados nesses pases. Pases emergentes
como Coria do Sul, Taiwan, ndia, frica
do Sul e outros j esto tambm realizando
financiamentos de projetos protemicos.
No Brasil, apesar do prprio conceito
de proteomas ser pouco conhecido pela
comunidade cientfica e rgos financiadores, projetos protemicos comeam a ser
realizados no Laboratrio de Bioqumica e
Qumica de Protenas/Centro Brasileiro de
Servios e Pesquisas em Protenas da Universidade (CBSP/LBQP) da Universidade
de Braslia (UnB). O CBSP/LBQP vem-se
dedicando nos ltimos anos identificao
de protenas por anlise de aminocidos,
sequenciamento automtico e espectrometria de massa, tendo adquirido o knowhow necessrio para trabalhos em proteomas. Atualmente, esto sendo iniciados
projetos de anlise de proteomas do veneno da aranha marrom (Loxoceles), em colaborao com a Dra. Katia Barbaro, do
Instituto Butantan, e da jararaca da Amaznia (Bothrops atrox), em colaborao com
o Dr. Paulo Buhrnhein e o pesquisador
Jorge Luis Lpez Lozano, do Instituto de
Medicina Tropical de Manaus (Figura 5).
Essas pesquisas, cujos financiamentos esto sendo solicitados junto a programas de
apoio cientfico e tecnolgico nacionais,
objetivam a comparao de proteomas de
venenos de populaes com diferentes
toxidades e a identificao de protenas de
interesse biotecnolgico e farmacolgico.
Outro projeto do LBQP/CBSP a anlise de
proteomas de leuccitos humanos aps o
trauma, em colaborao com o Dr. Belchor
Fontes, do Hospital das Clnicas de So
Paulo. Aps o trauma, at mesmo em casos
pouco graves, alguns pacientes desenvolvem falncia mltipla de rgos, chegando
morte quase sempre. Assim, leuccitos de

Figura 5- Aplicao da anlise de


proteomas no estudo comparativo
de venenos. A gravidade dos
acidentes ofdicos causados por
serpentes do gnero Bothrops
atrox das regies de Manaus e da
Fronteira Brasil-Colmbia so
diferentes. O mesmo ocorre com
diferentes espcies de aranhas do
gnero Loxosceles. O estudo
comparativo desses proteomas
pode levar identificao de
protenas de interesse
biotecnolgico e farmacolgico.
pacientes com e sem falncia mltipla de
rgos ps-trauma sero comparados a
nvel de proteomas, com o objetivo de
identificar marcadores moleculares relacionados com essa condio. Diversas outras idias j esto sendo discutidas para
novos projetos. At mesmo coordenadores de projetos genoma nacionais j demonstram grande interesse em interagir
com a equipe do LBQP/CBSP em futuros
trabalhos ps-genmicos.
A anlise de proteomas possui muitas
outras aplicaes alm das citadas neste
artigo e a demanda de trabalhos nessa
rea certamente crescer exponencialmente no Brasil nos prximos anos. O atendimento dessa demanda vai depender muito do apoio continuado a grupos de
pesquisa em protenas e proteomas.
Referncias Bibliogrficas
Westermeier, R. (1997). Electrophoresis in
practice. VCH, Germany.
Roepstorff, P. (1997). Mass spectrometry
in protein studies from genome to function.
Current Opinion in Biotechnology 8: 6-13.
Wilkins, M.R., Williams, K.,L., Appel, R.D.
and Hochstrasser, D. (Eds.) (1997).
Proteome research: new frontiers in
functional genomics. Springer-Verlag,
Germany.