REALIZADO POR: JINEL MENDOZA C.

I: 17180160

III. EXAMEN. GENETICA BACTERIANA E INTRODUCCION AL DNA

RECOMBINANTE

1.- Establezca un cuadro comparativo donde se sealen las caracteristicas generales y

puntuales que describen el funcionamiento de los vectores de clonacion bacs, yacs y
fagemidos y cosmidos. no olvide sealar bajo que tcnica pueden ser transferidos estos
vectores a un organismo.
VECTORES DE CLONACION
Hospedado
r

FAGEMIDOS
general dna
manipulation
invitro
mutagenesis

Cosmidos

BACs
Bacterial
Artificial

E. coli

E.coli

E. coli

Estructur
a

Caracteristicas

contienen su origen en el fago f1 de

replicacion para la produccion de DN
monocatenario.

La
protena II del fago reconoce la "regin
plasmidos
intergnica" (origen de replicacin de fago
filamentoso) insertada en el plsmido, corta
la hebra (+) y la replica en "crculo-rodante".
El ADN monohebra se recubre de protenas y
sale por extrusin (es un parsito celular, no
un fago ltico) de la clula.
Es una seccion circular de ADN y el
mecanismo de insercin del ADN es igual.
Secuencias plasmdicas de replicacin y de
genes de resistencia a antibiticos.
Su DNA, que contiene DNA insertado, se
empaqueta en la cpside proteica de lambda
Plasmidos
para formar partculas fgicas infectivas.
Generalmente contienen marcadores
genticos que permiten su seleccin en los
dos sistemas husped.
SV40 ori en clulas de mamferos.
ColE1 ori para la replicacin del ADN de
doble cadena.
f1 ori para la replicacin del ADN de doble
cadena sencilla en procariotas.1
Plsmidos enormes
1990s
Basado en el F factor ocurre naturalmente.
circulares Estable, 1-2 copias por celula

TallaInserto

De 10 a
20 kb

30 45
kb

100-300

Chromosomes
YACs
Yeast Artificial
Chromosomes

Kb
Levaduras

Plasmidos

- Se transfiere a Saccharomyces cerevisiae

donde se replica y segrega como un
cromosoma linear normal de levadura.
-50-100 veces mas volumen que E. coli
usualmente inestables. Tienden a rearreglos y
delecciones.

2501000 Kb

Transferencia de DNA a eucariotas.

Tanto las clulas animales como las vegetales pueden incorporar DNA del medio ambiente, proceso
denominado transfeccin. Adems, los vectores, incluyendo los YAC, pueden utilizarse para
transferir DNA a clulas eucariticas.
Clulas vegetales.
En los ltimos aos, se ha conseguido clonar utilizando plantas superiores como husped y
plsmidos bacterianos. La bacteria infecciosa Agrobacterium tumifaciens, presente en el suelo,
produce tumores (denominados agalla de la corona) en muchas especies de plantas. La infeccin de
las clulas normales por esta bacteria las transforma en clulas tumorales, y en las plantas
dicotiledneas del tipo de la uva y las plantas decorativas se desarrollan tumoraciones en forma de
agallas. Normalmente, el tumor se localiza cerca de la unin de la raz con el tallo de la planta. El
tumor se origina debido a que los genes de la bacteria se insertan en el genoma de las clulas de la
planta. Slo son patgenas las cepas de A. tumefaciens que contienen un plsmido conjugativo de
gran tamao, denominado plsmido Ti.
Cuando estas bacterias infectan clulas vegetales, un segmento del plsmido Ti, conocido
como T-DNA, se transfiere al DNA cromosmico de la clula vegetal husped. La regin T-DNA
contiene genes que codifican la sntesis de hormonas del crecimiento de la planta (una auxina y una
citoquinina) y de un derivado de aminocidos denominado opina, que son necesarias para el
crecimiento de la bacteria infecciosa. Se pueden insertar genes exgenos en el segmento T-DNA de
Ti, y la bacteria infecciosa puede transferir el Ti alterado a la clula vegetal. El DNA exgeno se
inserta en el genoma de la planta cuando el T-DNA se integra en el cromosoma de la clula
husped. El crecimiento de esta clula genticamente alterada puede inducirse en un medio de
cultivo, formando una masa celular denominada callo. Manipulando el medio de cultivo, puede
inducirse la formacin de races y de brotes en el callo, y que ste se desarrolle eventualmente como
plantas adultas que contengan el gen exgeno.
Cuando se identific la naturaleza molecular de la tumoracin en forma de agallas, se hizo
evidente que el plsmido Ti y su T-DNA tenan un gran potencial como vector para la insercin de
DNA recombinante en los cromosomas de plantas. En uno de los primeros experimentos, se aadi
el gen que codifica la alcohol deshidrogenasa de las levaduras a la regin T-DNA del plsmido Ti.
La infeccin subsiguiente de clulas de plantas cultivadas condujo a la transferencia del gen de la
levadura. Desde entonces, se han realizado numerosas modificaciones en el plsmido Ti con objeto
de mejorar sus caractersticas como vector. Habitualmente se aade uno o ms genes de resistencia
a antibiticos, y se elimina el T-DNA no esencial, incluidos los genes que codifican el desarrollo del
tumor. Se mantienen los genes necesarios para la infeccin de la clula vegetal por el plsmido.

Tambin se ha insertado el T-DNA en el plsmido pBR322 de E.coli y en otros plsmidos para

producir vectores de clonacin capaces de desplazarse entre bacterias y plantas.
El gen o los genes de inters se empalman en la regin T-DNA entre las repeticiones directas.
A continuacin, se devuelve el plsmido a A.tumefaciens, se infectan con la bacteria clulas en
cultivo de la planta, y se seleccionan los transformantes en funcin de su resistencia a antibiticos
(u otro rasgo codificado por el T-DNA). Finalmente, se generan plantas completas a partir de las
clulas del cultivo. Este mecanismo ha permitido desarrollar diversas plantas resistentes a
herbicidas. Por desgracia, A.tumefaciens no produce la tumoracin en forma de agallas en plantas
monocotiledneas del tipo del maz, el trigo y otros granos; slo se ha utilizado para modificar
plantas tales como la patata, el tomate, el apio, la lechuga y la alfalfa. Sin embargo, existen datos
Tecnologa del DNA Recombinante que indican que el T-DNA se transfiere a plantas
monocotiledneas y se expresa en ellas, aunque no produce tumores. Este descubrimiento, asociado
al desarrollo de nuevos procedimientos de insercin del DNA en clulas vegetales, bien podra
conducir a la aplicacin de las tcnicas del DNA recombinante en numerosas e importantes plantas
de cultivo.
Utilizacin del vector plasmdico Ti para producir plantas transgnicas. A la izquierda,
formacin de un vector de clonacin y su utilizacin en la transformacin. A la derecha, una planta
del tabaco, Nicotiana tabacum, convertida en bioluminiscente mediante transfeccin con un vector
plasmdico Ti especial que contiene el gen que codifica la luciferasa de la lucirnaga. Cuando se
riega la planta con una solucin de luciferina, el sustrato de la enzima luciferasa, la planta emite luz.
Clulas de mamfero.
Los YACs pueden utilizarse para incrementar enormemente la eficiencia de la transferencia
de genes a la lnea germinal de ratn. La transferencia de genes depende de la introduccin de
secuencias de DNA en el ncleo de una clula de ratn adecuada, como una clula huevo fecundada
o una clula madre embrionaria, seguido de la integracin del DNA en un sitio del cromosoma.
Experimentos iniciales de transgnesis en ratn no funcionaron debido a la longitud
relativamente corta de DNA que puede introducirse utilizando vectores de clonacin plasmdicos.
En muchos casos, los genes de mamfero eran ms largos que la capacidad de clonacin del vector,
y en otros casos, en los que se pudo transferir el gen, no se produjo su expresin o sta era
inadecuada debido a que no se haban transferido las secuencias reguladoras adyacentes o distantes.
Los YACs pueden transferirse a ratn de diversas maneras. La primera implica la
microinyeccin de DNA de YACs purificado en el proncleo de un zigoto de ratn. Los zigotos se
transfieren entonces al tero de madres adoptivas para que se desarrollen normalmente. Otras
tcnicas utilizan clulas madres embrionarias de ratn (clulas ES, del ingls embrionic stem cell)
como huspedes. Uno de estos mtodos fusiona una clula de levadura que contiene un YAC con
una clula ES, transfirindose el YAC a la clula ES, junto con todo o una parte del genoma de
levadura. Las clulas ES transgnicas se transfieren entonces a embriones de ratn en el estadio de
blastocisto, donde participaran en la formacin de los tejidos del adulto, incluyendo los que
formarn la lnea germinal. La capacidad de transferir segmentos largos de DNA a ratones tiene
aplicaciones en muchas reas de investigacin.

Se han desarrollado vectores para la transferencia de genes funcionales a clulas de

mamfero utilizando retrovirus de ave y de ratn. El genoma de estos retrovirus es un RNA de
cadena sencilla que, mediante la retrotranscriptasa, se transcribe en un DNA de doble cadena. Este
DNA se integra en el genoma del husped y pasa a las clulas hija como parte de su propio
cromosoma. El genoma del retrovirus debe disearse para eliminar algunos genes vricos, creando
vectores que aceptan DNA exgeno, incluyendo genes estructurales humanos. Estos vectores se
estn utilizando en el tratamiento de enfermedades genticas mediante terapia gnica. El desarrollo
de las tcnicas para producir millones de copias de segmentos de DNA por clonacin ha abierto el
camino a investigaciones sobre la estructura y la funcin del DNA en vegetales y en animales.
2. Luego de conocer los tres eventos geneticos que evidencian la transferencia del material
genetico entre bacterias, establezca un cuadro comparativo que recoja todas las
caracteristicas de estas; sin olvidar las diferencias implicadas cuando se tratan de bacterias
gram o gram-.
TRANSFORMACION

TRANSDUCCION

CONJUGACION

El proceso de transformacin En la transduccin son los Pronceso deonde el ADN es

cambia el genotipo de la bacteria
virus
transferido de una celula a otra casi sin
de manera permanente.
bacteriofagos los que llevan una excepcin, es mediado por plasmidos, F
El ADN capaz de transformar, a de fragmento de ADN de la bacteria , R y otros.
ser de cadena doble.
donadora hasta el citoplasma de Los plasmidos transmisibles pueden
Para cada evento basta la la receptora.
ser de dos tipos : plasmidos conjugados
interaccion de una sola molecula
Los bacterifagos son
y plasmidos movilizables
de ADN con la receptora. El virus que se reproducen en el Rango de hospedadores a colonizar:
numero de molculas de ADN interior de las bacterias. Para bacterias Gram - y Gram +
que puede tomar una misma infectarlas inyectan su ADN en el (transposones conjugarivos, secrecin
celula es limitado, y presenta una citoplasma dejando fuera la de feromonas sexuales).
cinetica de saturacin.
cpside del fago. Despus Factor F: capacidad para realizar
No todas las clulas de un mismo paralizan la replicacin de la
distintos
procesos,
capaz
de
cultivo son transformables en bacteria, cuyo ADN comienza a
autorreplicarse, de manera que se
cualquier momento del ciclo de degradarse, replican el ADN del
transmite a la descendencia.
crecimiento. La competencia es virus y traducen la informacin
- Posee un gen que codifica la
el
estado
fisiolgico precisa para sintetizar nuevas
protena pilica la cual permite
caracterstico que permite captar cpsides que se ensamblan
producir pili. Cuando pili contacta
ADN del medio exterior. Este rodeando a las copias de ADN
con otra bacteria se forma un tubo
estado de competencia es fgico. Para liberar los nuevos
por el que puede pasar material
diferente para cada especie de bacterifagos lisan la bacteria
gentico.
bacteriana capaz de experimentar infectada.
se puede transferir el factor F de
transformacin, y dentro de cada A veces, durante estos ciclos
la donante a la receptora.
especie esta influido por una lticos se introduce por error en
Clulas Hfr. El plasmido F est
serie de parmetros como: una cpside de bacteriofago ADN
integrado en el cromosoma de la
densidad celular, temperatura, de la bacteria infectada. Estas
bacteria donadora.
pH, nutrientes.

 En Streptococcus pneumoniae la
competencia afecta al 100% de
las clulas en fase exponencial.
En cambio en Bacillus subtilis
solamente una minora (1-20%)
de clulas se hacen competentes,
y solo durante la fase
estacionaria.
- Las bacterias Gram positivas
son inespecficos respecto de la
captacin de ADN exgeno: no
distinguen entre ADN homlogo
(de la misma especie) o ADN
heterlogo (de otras especies).
Sin embargo, aunque fsicamente
puede entrar ADN heterlogo,
ste se recombina posteriormente
con el endogenote slo en el caso
de presentar con l un grado de
homologa suficientemente alto.
nicamente
se
recombinan
molculas de ADN de la misma
especie (o en algunos casos, de
especies muy cercanas).
- Una diferencia caracterstica
de los sistemas en Gram
negativas con respecto a los de
Gram positivas es que el estado
de competencia no depende de
seal activadora segregada al
medio. En las especies del
gnero Neisseria las clulas se
mantienen competentes durante
todo el ciclo de crecimiento, cosa
excepcional dentro de los
sistemas
naturales
de
transformacin. Adems, la
transformacin slo se da en las
cepas
fimbriadas
de
Neisseria (poseedoras de pelos o
fimbrias, o sea, fenotipo Fim+).

partculas pueden iniciar la

infeccin de otra bacteria y le
inyectan de forma automtica el
ADN que portan. Como en estos
casos no es inyectado el genoma
completo del virus, la bacteria no
muere y puede recombinar el
fragmento adquirido.
Cualquier gen de la bacteria
donadora tiene igual probabilidad
de
ser
transducido
y
porteriormente recombinado a
travs del proceso descrito que se
denomina
transduccin
generalizada

durante la conjugacin, la
bacteria
dona a la receptora su cromosoma. En
la celula receptora se puede producir
recombinacin entre el ADN entrante y
el propio de la bacteria.
- La celula receptora se combierte
en Hfr si se consigue transmitir todo el
cromosoma de la donadora.
a diferencia de Gram negativas, se han
encontrado pocos sistemas
conjugativos en Gram positivas.
Existen ejemplos de plsmidos
autotransmisibles en especies
de Streptococcus, Enterococcus,
Bacillus,Clostridium y Streptomyces,
y todos ellos son bastante diferentes
de lo estudiado en Gram negativas.
Por ejemplo, en ninguno de estos hay
implicacin de pelos sexuales.
Algunos de estos plsmidos (p. ej.,
pAM1) promueven una conjugacin
poco eficiente en lquidos, pero muy
eficiente cuando las cepas donadoras y
receptoras se mezlan sobre la
superficie de un filtro de tipo
Millipore.

3.- Explique con detalles el fundamento de la tecnica de amplificacion de dna denominada

reaccion en cadena de la polimeraza (pcr) y mencione su uso en el campo de la investigacion,
biomedicina, biotecnologia, etc.
La PCR es un mtodo in vitro de sntesis de DNA con el que un segmento particular de este
es especficamente amplificado al ser delimitado por un par de cebadores o iniciadores que lo
flanquean. Su copiado se logra en forma exponencial a travs de repetidos ciclos de diferentes
periodos y temperaturas de incubacin en presencia de una enzima ADN polimerasa termoestable.
Asi se obtienen en cuestin de horas millones de copias de la secuencia deseada de ADN.
Para realizar la PCR se necesita:
Mezclar en un tubo el ADN que contiene la secuencia a amplificar
Ambos cebadores que se alinearn a las cadenas simples del ADN.
La mezcla de los cuatro desoxirribonuclesidos trifosfata dos (dNTPs) en cantidades
suficientes.
El tampn de reaccin para la polimerasa
Agua ultra pura para completar el volumen final de reaccin (que normalmente oscila entre
20 y 100l).
La enzima ADN polimerasa termoestable. La reaccin consta, por lo regular, de una treintena de
ciclos repetitivos conformados cada uno de tres pasos:
1. El primero consiste en la ruptura de los puentes de hidrgeno del ADN para
desnaturalizarlo, para lo que se incuba a una temperatura de alrededor de 95C, por un
minuto. Este paso expone las bases nitrogenadas del ADN blanco.
2. En el segundo ocurre la hibridacin de las cadenas desnaturalizadas del ADN blanco con
los denominados cebadores o iniciadores (ADN sinttico de hebra sencilla), a una
temperatura que facilita el apareamiento de las bases nitrogenadas complementarias de
ambas clases de ADNs. Esta temperatura depende de la temperatura de fusin (Tm) de los
iniciadores, la cual puede calcularse mediante una frmula (ver ms adelante), pero
generalmente oscila entre 50 y 60C.3.
3. El tercer paso se efecta a 72C, temperatura a la que la polimerasa extiende la longitud de
los cebadores, aadiendo los diferentes nucletidos libres en el orden que le va dictando la
secuencia de nucletidos de la cadena que acta como molde.
Las etapas de un ciclo de reaccin
Tres son los pasos a seguir y a repetir por cada ciclo de la PCR. A estos comunmente se les
refiere como desnaturalizacion, alineamiento y extension. Si detrabajar con ADN genomico se trata,
regularmente se agrega una etapa previa de desnaturalizacion a 94C, para relajar las posibles
estructuras secundarias y de otros tipos. Despues de concluida esta, se repiten los diferentes ciclos
en los que tanto la temperatura como el tiempo seran especificos del producto a amplificar y del
origen del acido nucleico que servira, de plantilla o molde a copiar por la polimerasa utilizada.

Desnaturalizacion
El sustrato de la enzima de la PCR es el ADN de simple cadena que acta como molde para
la sntesis de su nueva cadena complementaria. Mediante un calentamiento a 94C, el ADN de
doble cadena logra que sus cadenas se separen o desnaturalicen. Si la muestra tiene alto contenido
de G+C, se recomienda aumentar de preferencia el tiempo.
Sin embargo, hay que tener en cuenta que la actividad de la enzima decrece de manera muy
rpida a partir de los 95C (vida media a 92.5C =2h, a 95C = 40 min. y a 97.5C = 5 min.), por lo
que a estas temperaturas o superiores es aconsejable disminuir el tiempo de incubacin. En la
prctica se suele empezar con un periodo de desnaturalizacin prolongado (cinco minutos a 94C),
para asegurarse que la desnaturalizacin se lleve a cabo a lo largo de toda la molcula del ADN.
Alineamiento
La enzima, como todas las ADN polimerasas, necesita del grupo OH- libre en el extremo 3
del iniciador ya apareado al sitio blanco de la amplificacin, a partir de donde iniciar la sntesis.
Este punto constituye el sitio de crecimiento de la cadena complementaria al molde. Mientras que
un cebador (referido como el 5 o sentido) es complementario a la secuencia del extremo 5 de la
regin del ADN molde a amplificar, el otro es al extremo 3 de la misma, pero en la cadena opuesta
(figura 7).
El alineamiento especfico de ambos cebadores se produce a una temperatura determinada
por composicin de bases y oscila entre 40 y 72C. Ambas cadenas originales del ADN sirven
simultneamente como moldes para sintetizar sus respectivas cadenas complementarias nuevas.
Un aumento de temperatura favorece la especificidad, ya que disminuye las uniones
incorrectas de los cebadores con sitios apcrifos del ADN molde.2
Extensin
Con el ADN molde de cadena sencilla, excepto en los sitios donde los iniciadores se
aparean, la polimerasa empieza a copiar la hebra, incorporando desoxirribonucleosidos
monofosfatos en direccin 53(ver figura). Esta etapa debe realizarse a una temperatura alta, que
es la que coincide con la mxima actividad de la polimerasa (72C) para evitar alineamientos
inespecficos de los iniciadores. El tiempo de extensin depende del tamao de la amplificacin,
debiendo estimar 1 minuto para alargar 1000 nucleotidos. Es comn que al finalizar todos los ciclos
se realice un ltimo alargamiento por 5 minutos a 72C, para asegurarse que todos los productos de
amplificacin estn completamente terminados y tengan, por ende, exactamente la misma longitud.
Aplicaciones
Las aplicaciones de la PCR son mltiples, abarcando desde la evolucin hasta la clnica,
pasando por la gentica, la biologa molecular y la biotecnologia; aplicaciones en la agricultura y la
ganadera.
La PCR es especialmente til en la deteccin de enfermedades genticas tales como la
fibrosis qustica, la hemofilia clsica y las distrofias musculares Duchenne/Becker.

Esta tcnica ha tenido un impacto en la medicina forense, campo en el que se est utilizando
en investigacin criminal como parte de la tecnologa de la huella digital del ADN. Gracias a su
aplicacin, es posible excluir o incriminar a sospechosos utilizando muestras extremadamente
pequeas de material biolgico encontrado en la escena del crimen.
En microbiologa, la PCR permite identificar al agente infeccioso independientemente de su
respuesta serolgica, lo que representa una gran ventaja en casos donde los anticuerpos aparecen
luego de un largo perodo de infeccin y a veces en forma impredecible. Tambin en aquellos
numerosos casos donde se quiere distinguir si la presencia de anticuerpos es seal de infeccin
antigua o activa, como ocurre ante el hallazgo de anticuerpos contra el virus de la hepatitis C, y la
necesidad de precisar si el virus este presente o no. Tambin es de gran utilidad en el diagnostico de
enfermedades virales neonatales, donde el diagnostico serolgico de la infeccin es generalmente
enmascarado por la presencia de anticuerpos maternos circulantes.
Otra de sus aplicaciones es en el estudio del complejo mayor de histocompatibilidad que
determina los antgenos conocidos como molculas HLA de clase II, que son las que establecen la
compatibilidad en trasplante de rganos.
La PCR permite estudiar no solo organismos vivos, sino tambin sus restos fsiles,
congelados o momificados. Incluso se puede partir de ADN de especies diferentes, y mediante el
empleo de iniciadores consenso lograr la amplificacin de secuencias gnicas de una especie cuya
secuencia del gen de inters es an desconocida.
Tambin puede servir para medir la expresin de un determinado gen. Para ello se extrae
ARN mensajero, se le practica una retrotranscripcin con la que se obtiene un ADNc, y este se
utiliza como material de partida para la amplificacin. Al partir de ARNm en vez de ADN
genmico, se esta estimando la expresin de un determinado gen que incluso pude llegar a
realizarse de una manera semicuantitativa. 2
4.- Describa que es una genoteca, sus tipos y como se construyen las genoteca.
La genoteca o biblioteca genmica es un banco de genes que almacena una coleccin de
genes clasificados y preparados para su utilizacin en experimentacin que en conjunto representan
una parte o el genoma completo de un organismo. Son de gran importancia para el desarrollo de
estudios biomdicos, microbiologa forense, industria farmacutica, nanotecnologa, agricultura,
entre otras.
Las genotecas suelen construirse utilizando vectores fgicos, que pueden contener grandes
fragmentos cromosmicos. Para preparar una biblioteca en el fago lambda, se corta el DNA de
lambda con una enzima de restriccin para eliminar el grupo gnico central, tal y como se ha
comentado anteriormente. El DNA genmico que se desea clonar se corta con la misma enzima, y
se purifican los fragmentos cortados de tamao ptimo para el empaquetamiento (de 15 a 17kb)
mediante una electroforesis en gel o por centrifugacin. Estos fragmentos de DNA se ligan con los
brazos del cromosoma de lambda para formar la biblioteca.
.
Elaboracin de genoteca

La genoteca puede ser de ADN genmico (ADNg) o ADN complementario (ADNc). La

primera es una coleccin de fragmentos de ADN genmicos clonados en un vector, que en conjunto
representan la totalidad del ADN o genoma de un organismo. A partir de este tipo de genoteca se
podr seleccionar el clon que posea un ADN recombinante especfico y cultivarlo posteriormente
para amplificarlo.
La genoteca de ADNc es el conjunto de clones obtenidos a partir de los ARN mensajeros
(ARNm), por lo que comprendern una seleccin del total de genes de la clula, ya que slo
aquellos genes que estn siendo expresados son transcritos al ARNm. Una vez que la informacin
est disponible en la forma de genoteca de ADNc, los segmentos procesados individualmente
podrn ser aislados y examinados con relativa facilidad. 4
a) Obtencin del ADN y ARNm
Los insertos pueden ser esencialmente de dos tipos: fragmentos de ADNg y ADNc obtenido
a partir del ARNm. El ADN total de la clula, que con frecuencia es requerido como una fuente de
material para obtener genes a ser clonados, puede ser procedente de cultivo de bacterias, clulas de
origen vegetal y animal o procedente de otro tipo de organismo a estudiar.
Las tcnicas de ruptura de las clulas pueden dividirse en metodos fsicos, con los cuales las
clulas se rompen por fuerzas mecnicas y mtodos qumicos, donde la lisis celular es llevada a
cabo por exposicin a agentes qumicos que afectan la integridad de las barreras celulares. La lisis
qumica involucra generalmente un agente que ataca la pared celular, en el caso que la La genoteca
como herramienta de la biotecnologa haya, y otro que destruye la membrana celular. Para la
bacteria Escherichia coli y organismos relacionados, el ablandamiento de la pared celular se lleva a
cabo por lisozimas, etilendiaminotetraactico (EDTA), o una combinacin de ambos. Las lisozimas
digieren compuestos polmeros que son los que le dan rigidez a la pared celular. El EDTA remueve
los iones magnesio que son esenciales para preservar la estructura de las envolturas celulares y
tambin inhibe enzimas celulares que podran degradar el ADN. El debilitamiento de la pared
celular con lisozimas o EDTA es suficiente para causar la ruptura de la clula, pero usualmente un
detergente como el 3-sodio-1-duodecil -2-sulfato (SDS) ayuda en el proceso de lisis al remover las
molculas de lpidos y, por lo tanto, causar la ruptura de las membranas celulares.
Una vez lisada la clula, se remueven los detritus insolubles. Componentes como paredes
celulares digeridas parcialmente pueden ser removidas por centrifugacin, quedando el extracto
celular como un limpio sobrenadante. Para eliminar protenas remanentes se puede usar fenol o una
mezcla de fenol cloroformo en proporcin 1:1. Estos solventes orgnicos precipitan las protenas y
dejan los cidos nucleicos (ADN y ARN) en solucin acuosa. Para eliminar el exceso de ARN de la
solucin acuosa se usa la enzima ribonucleasa. Para concentrar el ADN de la muestra, el mtodo
ms usado es la precipitacin con etanol, en presencia de sal (cationes monovalentes de Na+) y a
una temperatura de 20C o menos. El precipitado puede ser recolectado por centrifugacin y luego
redisuelto en un volumen adecuado de agua. Aunque los pasos bsicos de purificacin del ADN son
los mismos, cualquiera que sea el organismo, algunas modificaciones son consideradas de acuerdo a
las caractersticas de las clulas que se usen (Brown, 1990).

Para su clonacin, los fragmentos de ADN deben tener dimensiones determinadas y

limitadas. El tamao del ADNg, sea procariota o eucariota, es muy superior al mximo posible para
un inserto. Por ello, la clonacin de genes a partir de ADNg requiere el aislamiento previo del ADN
y su ruptura en fragmentos de ta-La genoteca como herramientade la biotecnologa mao adecuado,
mediante el uso de endonucleasas de restriccin.
Para el aislamiento de ARN se puede usar una solucin monofsica de fenol e isotiocianato
de guanidina (Trizol Reagent), basado en el mejoramiento del mtodo de Chomczynski y Sacchi de
1987 (GIBCOTM BRL. 1999). Durante la homogeneizacin y lisis de la muestra, el Trizol
mantiene la integridad del ARN. La adicin de cloroformo seguido de centrifugacin, separa la
solucin en una fase acuosa y una fase orgnica. El ARN permanece exclusivamente en la fase
acuosa y es recuperado por precipitacin con alcohol isoproplico. El ARN aislado con Trizol est
libre de protenas y contaminacin con ADN. A partir del ARN total se asla el ARNm poli (A)
utilizando una resina oligo (dT)
Para la realizacin de genotecas de ADNc, se debe realizar la sntesis de los ADNc a partir de los
ARNm obtenidos.
b) Sntesis del ADNc
La sntesis de los ADNc se logra utilizando un cebador oligo (dT), de 12-18 nucletidos de largo, el
cual se une a la colas poli (A) del extremo 3 de las molculas de ARNm de clulas eucariotas y la
accin de la enzima transcriptasa reversa, la cual sintetiza una cadena complementaria de ADN por
cadena de ARNm existente. En kit comerciales como el elaborado por Stratagene, el primer oligo
(dt) posee un sitio de reconocimiento para la enzima de restriccin Xho I.
Si la doble cadena de ADNc contiene uno o ms sitios de reconocimiento para la enzima de
restriccin que se use, sta pudiera ser clivada y subsecuentemente clonada en dos o ms
fragmentos, haciendo difcil el aislamiento y anlisis de ADNc completos. Para evitar esto, la
primera cadena de ADNc debe ser metilada. De esta forma, los sitios de restriccin dentro de la
molcula de ADNc quedaran protegidos del clivaje.
Una vez que la primera cadena de ADNc ha sido sintetizada, el ARNm, miembro de la molcula
hbrida, es parcialmente degradado por el tratamiento con ribonucleasas H. Los fragmentos
remanentes de ARN sirven como cebadores para la ADN polimerasa I de E. coli, la cual sintetiza
una segunda cadena de ADN, utilizando como molde a la primera, generando molculas de ADNc
con extremos romos. Esta segunda cadena es idntica al ARNm original.
Luego que se ha producido la sntesis de la segunda cadena de ADN, se incorporan adaptadores
EcoRI. La doble cadena de ADNc se incuba con los adaptadores, en presencia de la enzima
bacterifago T4 ADN ligasa, enzima que cataliza la unin de los adaptadores a los extremos romos
de las molculas de ADNc.
En el proceso de unin de los adaptadores a los extremos romos de las molculas de ADNc, es
importante que la reaccin de ligacin se haga en el menor volumen. La concentracin molar de los
adaptadores debe ser de al menos 100 veces ms que la de los terminales de ADNc, para minimizar
la unin de los extremos romos de las molculas de ADNc entre ellos mismos.

Luego, la enzima Xho I acta en su sitio de reconocimiento, produciendo extremos cohesivos. De

esta forma, los fragmentos de ADN de doble cadena resultantes pueden ser ligados al vector en el
sentido Eco RI Xho I y efectuarse la clonacin. Los extremos de las molculas que portan los
adaptadores son fosforilados con la enzima bacteriofago T4 polinucletido kinasa para ser ligados
al vector desfosforilado apropiado, el cual debe haber sido previamente clivado con enzimas de
restriccin que generen extremos cohesivos compatibles con los de los adaptadores.
Finalmente, antes de que el ADNc sea insertado en el vector, los adaptadores que no se unieron y
los productos de bajo peso molecular, creados por la accin de la enzima de restriccin sobre los
adaptadores, deben ser removidos en columnas de cromatografa. Los clones de ADNc obtenidos
son representativos del ARNm presente en la preparacin original.(4)
BIBLIOGRAFIA
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2. Iram Pablo Rodriguez Sanchez, Hugo A, Barrera Saldaa. La reaccin en cadena de la
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5.- Ana Teresa Guilln. La genoteca como herramienta de la ingeniera gentica. INIA. SERIE B N 19. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias, Maracay. Venezuela. 2009
http://www.fundacitezulia.gob.ve/download/La%20genoteca%20como%20herramienta%20de
%20la%20biotecnolog%C3%ADa.pdf