Anda di halaman 1dari 105

KROMATOGRAFI

Sri Teguh Rahayu, M. Farm., Apt

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.[1] Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati

kolom yang merupakan fase diam.[1] Molekul yang memiliki ikatan

yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah.[2] Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.[2]

Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat dianalisis dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk analisis lebih lanjut.[2] Beberapa alat-alat analitik dapat

digabungkan dengan metode pemisahan untuk analisis secara on-

line (on-line analysis) seperti: penggabungan kromatografi gas (gas chromatography) dan kromatografi cair (liquid chromatography) dengan mass spectrometry (GC-MS dan LC-MS), Fourier-transform

infrared spectroscopy (GC-FTIR), dan diode-array UV-VIS (HPLC-

UV-VIS).

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen

distribusi dari komponen-komponen campuran

tersebut diantara dua fase, campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair)

dan fase yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase

gerak (cair atau gas).

Kromatografi merupakan teknik pemisahan senyawa campuran berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi, karena adanya perbedaan koefisien distribusi masing- masing senyawa di antara dua fase yang saling bersinggungan dan tidak saling campur, yang disebut sebagai fase gerak (mobile phase) yang berupa zat cair atau zat gas, dan fase diam (stationary phase) yang

berupa zat cair atau zat padat

Teknik kromatografi digunakan pada hampir setiap metode analisis sampel kompleks karena kemampuan pemisahannya, kecepatannya, dan penggunaan jumlah sampel yang sedikit.

Metode kromatografi secara umum dapat dibedakan berdasarkan fase gerak dan fase diam yang digunakan.

Berdasarkan fase gerak kromatografi :

a. kromatografi gas (GC = gas chromatography) dan

b. kromatografi cair (LC = liquid chromatography).

Berdasarkan fase diam dapat digunakan sebagai dasar

klasifikasi selanjutnya :

a. Fase diam berupa padatan yang bersifat sebagai adsorben, maka mekanisme pemisahan berdasarkan

kekuatan interaksi fisik permukaan (adsorpsi) di antara

kedua fase. Bila fase geraknya gas disebut kromatografi gas padat (GSC = gas solid chromatography), dan bila fase geraknya cair disebut kromatografi cair padat (LSC =

liquid solid chromatography).

b. Fase diam berupa cairan yang disalutkan pada

penyangga padatan, maka mekanisme pemisahan berdasarkan partisi komponen sampel di antara dua cairan yang tidak saling campur. Bila fase geraknya gas disebut kromatografi gas cair (GLC = gas liquid chromatography), dan bila fase geraknya cair disebut kromatografi cair cair (LLC = liquid liquid chromatography).

Dengan demikian, kromatografi cair-cair

disebut juga sebagai kromatografi partisi

dan kromatografi cair padat disebut juga sebagai kromatografi penjerapan /

adsorpsi.

Berdasarkan kepolaran relatif fase diam

terhadap fase gerak, maka kromatografi

dibedakan menjadi kromatografi fase normal (normal phase) dan fase terbalik

(reversed phase).

Pada kromatografi fase normal digunakan fase diam polar dan fase gerak nonpolar, sedangkan pada kromatografi fase terbalik, fase diam relatif nonpolar dibanding fase gerak

Berdasarkan instrumen yang digunakan,

kromatografi dibedakan menjadi kromatografi

kolom dan kromatografi planar

Apabila fase diam dipadatkan di dalam pipa gelas

atau pipa logam, kemudian fase gerak gas atau

cair dialirkan melalui fase diam tersebut berdasarkan gravitasi ataupun dengan tekanan,

maka cara ini disebut sebagai kromatografi kolom

Apabila fase diam berupa kertas berpori (kromatografi kertas) ataupun padatan halus

yang diratakan pada plat gelas atau plat

aluminium (kromatografi lapis tipis), kemudian fase gerak cair akan bergerak karena

pengaruh daya kapilaritas (metode

ascendens) atau gravitasi (metode descendes), maka cara ini disebut sebagai

kromatografi planar.

Pengisian Kolom

fase diam homogen

fase diam ukuran sama

fase diam bentuk seragam

bebas gelembung udara

• fase diam bentuk seragam • bebas gelembung udara Fase diam Pasir Kapas / glass wool

Fase diam

diam bentuk seragam • bebas gelembung udara Fase diam Pasir Kapas / glass wool Tehnis :
diam bentuk seragam • bebas gelembung udara Fase diam Pasir Kapas / glass wool Tehnis :
diam bentuk seragam • bebas gelembung udara Fase diam Pasir Kapas / glass wool Tehnis :
diam bentuk seragam • bebas gelembung udara Fase diam Pasir Kapas / glass wool Tehnis :

Pasir

Kapas / glass

wool

Tehnis : fase diam + pelarut → bubur (fase gerak)

Kolom kromatografi sederhana

Kolom kromatografi sederhana
Kolom kromatografi sederhana
Kolom kromatografi sederhana

Isolasi hasil fraksi dengan KLT Preparatif

CHCl 3 : MeOH : H 2 O = 6,5 :2,5:0,4
CHCl 3 : MeOH : H 2 O = 6,5 :2,5:0,4
dengan KLT Preparatif CHCl 3 : MeOH : H 2 O = 6,5 :2,5:0,4 Isolat yang
dengan KLT Preparatif CHCl 3 : MeOH : H 2 O = 6,5 :2,5:0,4 Isolat yang

Isolat yang diambil

Profil KLT preparatif di bawah UV 254 nm fase diam silika dan fase gerak = kloroform: metanol: air = 6,5: 2,5: 0,4

Apabila solut masuk ke dalam suatu sistem kromatografi, maka akan segera terdistribusi di antara fase diam dan fase gerak. Bila aliran fase gerak dihentikan, maka akan terjadi kesetimbangan di antara kedua fase. Distribusi molekul-molekul solut di antara kedua fase ditentukan oleh tetapan kesetimbangan

yang disebut koefisien partisi atau konstanta distribusi

(K), yang merupakan harga perbandingan konsentrasi solut pada tiap fase:

harga perbandingan konsentrasi solut pada tiap fase: • Cs adalah konsentrasi solut dalam fase diam (stationary

Cs adalah konsentrasi solut dalam fase diam (stationary

phase), dan Cm adalah konsentrasi solut dalam fase

gerak (mobile phase).

HPLC?

Awalnya dikenal sebagai High-Pressure

Liquid Chromatography

sekarang lebih dikenal dengan nama High Performance Liquid Chromatography

HPLC merupakan salah satu metode

kromatografi cair yang fase geraknya dialirkan secara cepat dengan bantuan tekanan, dan hasilnya dideteksi secara

instrumen

HPLC PRINCIPLE

HPLC PRINCIPLE

Stationary Phases

Polar (“Normal” Phase):

Silica, alumina

Non-Polar (“Reversed Phase”)

ODS Silica gel

C18, C8

The Mobile Phase

Normal chromatography Hexane ; dichloromethane; isopropanol; methanol

Hexane ; dichloromethane; isopropanol; methanol Increasing strength • Reverse phase chromatography water

Increasing strength

Reverse phase chromatography water ; methanol; acetonitrile; tetrahydrofuran (THF)

strength • Reverse phase chromatography water ; methanol; acetonitrile; tetrahydrofuran (THF) Increasing strength

Increasing strength

Components of HPLC

1.

Solvent Reservoir

2.

Pumps

3.

Sample Injection System

4.

Columns

5.

Detectors

6.

Data Processing

7.

Waste

Solvent Reservoir

Mobile phase

isocratic elution - single solvent separation teachnique

gradient elution - 2 or more solvents, varied during separation

To carry sample into the column

Pumps

Untuk menghasilkan tekanan yang akan mendorong pelarut ke dalam

sample.

kemampuan pompa mendorong pelarut untuk menghasilkan tenakan

sampai 4000 psi dan pada aliran

sampai 10 ml/min

Tekanan ≥ 1000 psi (4000 – 6000psi) ≥ 1000 psi (4000 – 6000psi)

Kec. Alir 1-3ml/menitTekanan ≥ 1000 psi (4000 – 6000psi) Bahan harus resisten secara kimiawi Ex : dari teflon

Bahan harus resisten secara kimiawi Ex : dari teflon & stainless steelTekanan ≥ 1000 psi (4000 – 6000psi) Kec. Alir 1-3ml/menit Tidak ada pulsa getaran Kontinyu

Tidak ada pulsa getaran– 6000psi) Kec. Alir 1-3ml/menit Bahan harus resisten secara kimiawi Ex : dari teflon & stainless

KontinyuKec. Alir 1-3ml/menit Bahan harus resisten secara kimiawi Ex : dari teflon & stainless steel Tidak

Sistem penginjek Sample

sample valve

Syringe/injector

Syringe :

manual

Autoinjector

A fixed-volume loop of between 1 200 l (20 l is often used as standard)

Columns

straight, 15 to 150 cm in length; 2 to 3 mm i.d. packing - silica gel, alumina, Celite

HPLC Detectors

UV/Vis

Refractive index

Fluorescence

Evaporative light scattering (ELSD)

MS

Diode Array Detector (DAD)

Data Processing

menggunakan software khusus yang dihubungkan dengan HPLC

Informasi yang diperoleh dari mesin HPLC

ditampilkan dalam bentuk kromatogram

Kromatogram menjelaskan tentang data kualitatif (waktu retensi) dan data kuantitatif (AUC)

Separations

29

Separation in based upon differential

migration between the stationary and mobile phases.

Stationary Phase - the phase which remains fixed in the column, e.g. C18,

Silica

Mobile Phase - carries the sample through the stationary phase as it moves through the column.

Injector Mixer Pumps Column Solvents
Injector
Mixer
Pumps
Column
Solvents
moves through the column. Injector Mixer Pumps Column Solvents Detector Waste High Performance Liquid Chromatograph
Detector Waste
Detector
Waste

High Performance Liquid Chromatograph

Separations

30

Injector Chromatogram Mixer mAU Pumps time Start Injection Column Detector Solvents
Injector
Chromatogram
Mixer
mAU
Pumps
time
Start Injection
Column
Detector
Solvents

High Performance Liquid Chromatograph

arations

31

Injector Chromatogram Mixer mAU Pumps time Start Injection Column Detector Solvents
Injector
Chromatogram
Mixer
mAU
Pumps
time
Start Injection
Column
Detector
Solvents

Separations

Pumps

Mixer

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 32 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Solvents

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 32 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Injector

Column

32

mAU

Chromatogram time Start Injection
Chromatogram
time
Start Injection
Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 32 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Detector

Separations

Pumps

Mixer

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 33 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Solvents

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 33 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Injector

Column

33

mAU

Chromatogram time Start Injection
Chromatogram
time
Start Injection
Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 33 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Detector

Separations

Pumps

Mixer

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 3 4 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Solvents

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 3 4 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Injector

Column

34

mAU

Chromatogram time Start Injection
Chromatogram
time
Start Injection
Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 3 4 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Detector

Separations

Pumps

Mixer

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 3 5 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Solvents

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 3 5 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Injector

Column

35

mAU

Chromatogram time Start Injection
Chromatogram
time
Start Injection
Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 3 5 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Detector

Separations

Pumps

Mixer

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 36 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Solvents

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 36 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Injector

Column

36

mAU

Chromatogram time Start Injection
Chromatogram
time
Start Injection
Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 36 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Detector

Separations

Pumps

Mixer

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 3 7 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Solvents

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 3 7 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Injector

Column

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 3 7 mAU Chromatogram time Start Injection Detector
Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 3 7 mAU Chromatogram time Start Injection Detector
Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 3 7 mAU Chromatogram time Start Injection Detector
Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 3 7 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

37

mAU

Chromatogram time Start Injection
Chromatogram
time
Start Injection
Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 3 7 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Detector

Separations

Pumps

Mixer

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 3 8 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Solvents

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 3 8 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Injector

Column

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 3 8 mAU Chromatogram time Start Injection Detector
Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 3 8 mAU Chromatogram time Start Injection Detector
Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 3 8 mAU Chromatogram time Start Injection Detector
Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 3 8 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

38

mAU

Chromatogram time Start Injection
Chromatogram
time
Start Injection
Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 3 8 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Detector

Separations

Pumps

Mixer

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 39 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Solvents

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 39 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Injector

Column

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 39 mAU Chromatogram time Start Injection Detector
Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 39 mAU Chromatogram time Start Injection Detector
Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 39 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

39

mAU

Chromatogram time Start Injection
Chromatogram
time
Start Injection
Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 39 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Detector

Separations

40

Injector Chromatogram Mixer mAU Pumps time Start Injection Column Detector Solvents
Injector
Chromatogram
Mixer
mAU
Pumps
time
Start Injection
Column
Detector
Solvents

Separations

Pumps

Mixer

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 41 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Solvents

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 41 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Injector

Column

41

mAU

Chromatogram time Start Injection
Chromatogram
time
Start Injection
Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 41 mAU Chromatogram time Start Injection Detector

Detector

Separations

Pumps

Mixer

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 42 mAU Chromatogram Start Injection Detector time

Solvents

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 42 mAU Chromatogram Start Injection Detector time

Injector

Column

42

mAU

Chromatogram

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 42 mAU Chromatogram Start Injection Detector time
Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 42 mAU Chromatogram Start Injection Detector time
Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 42 mAU Chromatogram Start Injection Detector time
Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 42 mAU Chromatogram Start Injection Detector time
Start Injection Detector
Start Injection
Detector

time

Separations

Pumps

Mixer

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 43 mAU Chromatogram Start Injection Detector time

Solvents

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 43 mAU Chromatogram Start Injection Detector time

Injector

Column

43

mAU

Chromatogram

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 43 mAU Chromatogram Start Injection Detector time
Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 43 mAU Chromatogram Start Injection Detector time
Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 43 mAU Chromatogram Start Injection Detector time
Start Injection Detector
Start Injection
Detector

time

Separations

Pumps

Mixer

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 44 mAU Chromatogram Start Injection Detector time

Solvents

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 44 mAU Chromatogram Start Injection Detector time

Injector

Column

44

mAU

Chromatogram

Separations Pumps Mixer Solvents Injector Column 44 mAU Chromatogram Start Injection Detector time
Start Injection Detector
Start Injection
Detector

time

45

The Chromatogram

45 The Chromatogram t o - elution time of unretained peak t R - retention time

t o - elution time of unretained peak t R - retention time - determines sample identity

t R

t R t o
t R
t o

Injection

time

mAU

Area or height is proportional

to the quantity of analyte.

HPLC Chromatograms

Peak A Peak B 0 1 2 3 4 5 6 Time (minutes) Absorbance 
Peak A
Peak B
0
1
2
3
4
5
6
Time
(minutes)
Absorbance 

R t = 3.0 min.

R t = 5.2 min.

faster moving slower moving

less retained

more retained

Approximation of peak area by

triangulation

7

7 base height

base

height

Area = base x height

2

Performace coloumn

Kolom merupakan jantung kromatografi. Keberhasilan atau kegagalan analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat.

Tujuan utama kromatografi adalah memisahkan senyawa

campuran dalam waktu yang relatif cepat dan wajar, menjadi puncak atau pita, ketika senyawa bergerak

melalui kolom.

Ukuran kinerja kolom dapat dilihat dari kemampuan kolom dalam memisahkan senyawa.

Kolom yang efisien mencegah pelebaran puncak atau

menghasilkan puncak yang sangat sempit.

Parameter yang paling banyak digunakan

untuk mengukur keefisienan kolom adalah

faktor resolusi (R), bilangan lempeng teoritik (N) dan HETP (High Equivalent to Theoretical

Plate).

Faktor resolusi adalah ukuran pemisahan dari

2 puncak. Daya pisah , Rs, antara 2 puncak

dapat diukur secara kuantitatif dengan persamaan di samping. Harga tR1 dan tR2

adalah waktu retensi senyawa, sedangkan

harga w1 dan w2 adalah lebar alas puncak

 t    t  2  t R 2 R 1 R
t
 
t
2  t
R
2
R
1
R s 
1/ 2

w
 w
w
 w
1
2
1
2

Daya pisah 2 puncak dikatakan baik

apabila memiliki harga Rs minimal 1,5.

Pada teori lempeng, kolom kromatografi

digambarkan sebagai suatu seri lapisan tipis horisontal yang disebut lempeng teoritik (theoritical

plates), dimana pada setiap lempeng akan terjadi

keseimbangan solut antara fase diam dan fase gerak. Gerakan solut dan fase gerak digambarkan

sebagai transfer berurutan dari lempeng satu ke

lempeng berikutnya. Pemisahan akan terjadi lebih baik jika terjadi keseimbangan berkali-kali dalam jumlah yang tinggi. Hal tersebut dapat tercapai jika bilangan lempeng teoritik juga tinggi

bilangan lempeng teoritik (N) dapat

digunakan sebagai ukuran efisiensi kolom. Persamaan tersebut menyatakan

hubungan waktu retensi senyawa (tR) dan lebar alas puncak (w) atau lebar puncak

pada setengah tinggi puncak (wh) dengan

bilangan lempeng teoritik (N).

Bilangan lempeng teoritik berbanding lurus

dengan panjang kolom (L). Karena panjang kolom bermacam-macam, maka

diperlukan ukuran keefisienan kolom yang

tidak tergantung pada panjang kolom

Teori Lempeng (Plate Theory)

Martin & Synge (1941)

Efisiensi kolom

Apabila jumlah kesetimbangan makin besar

efisiensi >> menambah jumlah lempeng (N)

tebal lempeng teoritik H

N & H menyatakan efisiensi

Secara matematis : N = L / H Kelemahan teori :

tidak mampu mengidentifikasi variabel-variabel yang

mempengaruhi pelebaran pita kromatogram

HETP atau H merupakan ukuran keefisienan

kolom yang lebih disukai karena memungkinkan perbandingan antara kolom yang panjangnya

berlainan, yang dapat diukur dengan persamaan

berikut

berlainan, yang dapat diukur dengan persamaan berikut Terlihat bahwa apabila H kecil maka N besar, sehingga

Terlihat bahwa apabila H kecil maka N besar,

sehingga jumlah terjadinya kesetimbangan di

dalam kolom akan semakin banyak. Dengan demikian pemisahan di dalam kolom akan lebih

efisien

57

HPLC Analysis Parameters

57 HPLC Analysis Parameters Mobile Phases Flow Rate Composition Injection Volume Column Oven Temperature Wavelength Time

Mobile Phases

Flow Rate Composition

Injection Volume

Column Oven Temperature

Wavelength Time Constant

Fig. 4. Sample injector.

Fig. 4. Sample injector.

Fig. 4. Sample injector.
Fig.7. Membrane filtration device.

Fig.7. Membrane

filtration device.

Fig. 8. filter assembly.
Fig. 8. filter assembly.
Fig. 8. filter assembly.
Fig. 8. filter assembly.
Fig. 8. filter assembly.
Fig. 8. filter assembly.
Fig. 8. filter assembly.

Fig. 8. filter assembly.

Fig. 9. Sample filtering.

Fig. 9. Sample filtering.

Fig. 10. Sample injection and recorded peaks.
Fig. 10. Sample injection and recorded peaks.
Fig. 10. Sample injection and recorded peaks.
Fig. 10. Sample injection and recorded peaks.

Fig. 10. Sample injection and recorded peaks.

Injektor Automatik

Injektor Automatik

Application of HPLC

1. Pharmaceuticals industry

To control the drug stability

Quantity of drug determination from pharmaceutical dosage forms, ex. Paracetamol determination in panadol tablet

Quantity of drug determination from biological

fluids, ex: blood glucose level

2. Analysis of natural contamination

- Phenol & Mercury from sea water

3. Forensic test

- Determination of steroid in blood, urine & sweat.

- Detection of psychotropic drug in plasma

Application of HPLC

4. Clinical test

- Monitoring of hepatic chirosis patient through aquaporin 2 in the urine.

5. Food and essence manufacture

- sweetener analysis in the fruit juice

- preservative analysis in sausage.

The factors which influence the HPLC

performance

1. Internal diameter of column

- the smaller in diameter, the higher in sensitivity

2. Pump pressure

- the higher in pressure, the higher in separation

3. Sample size

4. The polarity sample, solvent and column

5. Temperature

- the higher in temperature, the higher in

separation

advantages

1. Needs a small sample with a high

accuracy and precis

2. Non-destructed sample during operation compared to GC.

Disadvantages

Need a skill to run the instruments Solvents consuming

HPLC CHROMATOGRAM

HPLC CHROMATOGRAM

Predict the order of elution from first to last of the following morphinane compounds from an ODS column in an acetonitrile/buffer mixture pH 8 (10 : 90).

first to last of the following morphinane compounds from an ODS column in an acetonitrile/buffer mixture

Retention Time

The retention time of a solute is taken as the elapsed time between the time of injection of a solute and the time of elution of the peak maximum of that solute.

DETEKTOR KCKT/HPLC : UV-VIS,

FLUORESCENCE

HPLC Detectors

suatu campuran dari sejumlah komponen dapat

dipisahkan dengan KCKT , bagaimana mengetahuinya?

Diperlukan detektor KCKT yang bersifat :

Sensitif (signalnya tinggi, noise rendah)

Tidak dipengaruhi oleh fase geraknya Harus mampu bekerja dilingkungan fase cair

Detector HPLC

detektor HPLC yang umum digunakan :

Refractive Index

UV-Visible Fluorescence

Conductivity (for ion chromatography)

Mass Spectrometry

Refractive Index Detector

“Legacy” bulk property detector Almost universal, rugged Low sensitivity (high ppm), no gradient programs possible

bulk property detector • Almost universal, rugged • Low sensitivity (high ppm), no gradient programs possible
bulk property detector • Almost universal, rugged • Low sensitivity (high ppm), no gradient programs possible

UV-Visible Detector

Most common detection method along with mass spectrometry

Detects solute analytes by their absorbance of

light at various wavelengths

More sensitive than refractive index, depends on specific analyte and wavelength

Less sensitive than mass spec, compound must absorb in the UV-Vis, mobile phase cutoff

Molecules and Light

Why is our universe coloured?

Absorbance - compounds absorb light of specific wavelengths and reflect or transmit all others

Emission - compounds emit light after converted to a higher energy state (ex: fluorescence, phosphorescence)

Molecular Orbital Theory

Molecular orbitals exist at different energy levels; bonding

orbitals (sigma/pi), non-bonding orbitals and anti-bonding orbitals

Molecular absorption occurs when photonic energy causes promotion of an electron to a higher energy orbital, different types of transitions possible

Molecular Orbital Theory

σ (sigma) orbital has symmetry about the bonding axes, lowest energy

π (pi) only one orbital plane passes through

both nuclei involved

n (non-bonding) orbital involved is not involved in bonding, usually a lone pair, higher in energy

σ * , π * (anti-bonding) nodal planes exist between nuclei, high in energy, usually unpopulated in

stable molecules

Molecular Orbital Theory

Molecular Orbital Theory Absorption occurs when light of a specific wavelength causes the electronic transition

Absorption occurs when light of a specific wavelength causes the electronic transition

Molecular Orbital Theory

HOMO = highest occupied molecular orbital (σ, π, n)

LUMO = lowest unoccupied molecular orbital (π* , σ * )

Most transitions we will be concerned with are from HOMO to LUMO

The orbital types of HOMO/LUMO partially determine the energy required to make the transition

Formaldehyde UV-Vis

Possible Transitions for Formaldehyde π π * at 182 nm n π * at 290 nm

But do we see sharp peaks at those wavelengths? Why are electronic transitions broad?

Answer: Vibrational transitions combined with

condensed phase and solvent effects broaden

UV-Vis peaks

Absorption Intensities

π π * at 182 nm (ε = 10,000 L M -1 cm -1 )

n π * at 290 nm (ε = 12 L M -1 cm -1 )

In formaldehyde, π π * has strong absorption

n π * has very weak absorptions

ε = Molar absorptivity Beer’s Law: A = ε c l

Hence, UV-Vis can be used to quantify

chromatography peaks linearly

After Absorption

After Absorption

Stokes Shift

Stokes Shift Remember: Emission spectra are redshifted relative to absorption (excitation) spectra

Remember: Emission spectra are redshifted relative to absorption (excitation) spectra

Aromatic Rings

Benzene rings absorb “nominally” at about 254 nm but this can change depending on auxochromes Absorption bands are redshifted by:

Electron donating groups (OH, NH 2 ) redshift π π * transitions

Extended conjugation (NO 2 , C=O) which create n π * transitions at longer wavelengths

Auxochromes

Auxochromes H OH NH NO 2 2 254 nm; ε = 200 270 nm; ε =
Auxochromes H OH NH NO 2 2 254 nm; ε = 200 270 nm; ε =

H

OH

Auxochromes H OH NH NO 2 2 254 nm; ε = 200 270 nm; ε =
Auxochromes H OH NH NO 2 2 254 nm; ε = 200 270 nm; ε =

NH

NO

2

2

254

nm; ε = 200

270

nm; ε = 1450

280

nm; ε = 1450

269

nm; ε = 7800 (π π * )

330

nm; ε = 125 (n π * )

Halogens

Halogens redshift UV-Vis spectra in the order F << Cl < Br < I because of polarizability

1: 10 Br 2: 9 Br 3: 8 Br 4: 7 Br 5: 6 Br 6: 5 Br 7: 4 Br 8: Sunlight

Br < I because of polarizability 1 : 1 0 B r 2: 9 Br 3:

Wavelength Selection

For HPLC-UV, want to observe a chromatogram at the longest reasonable wavelength, why?

Signal:noise is usually better at longer wavelengths due to reduction in noise from mobile phase and impurities

Ex: DNPH derivitization of carbonyls

Wavelength Selection

O 2 N

O

Wavelength Selection O 2 N O NO 2 H N N Acetone λ M A X
NO 2
NO 2

H

N

Wavelength Selection O 2 N O NO 2 H N N Acetone λ M A X
Wavelength Selection O 2 N O NO 2 H N N Acetone λ M A X

N

Acetone

λ MAX = 190 nm

DNPH-Acetone

λ MAX = 360 nm

Solvent Cutoffs

Acetonitrile

190

nm

Methanol

205

nm

Water

200

nm

Chloroform

245

nm

THF

215

nm

Ethyl acetate

254

nm

Toluene

284

nm

Acetone

330

nm

Pyridine

330

nm

Chromatograms

Top = 220 nm Bottom = 280 nm

CBN

CBD

OH O
OH
O
OH HO
OH
HO

Chromatograms

Chromatograms λ = 245 nm

λ = 245 nm

HPLC-UV-Vis

Generally, UV-Vis HPLC detector not too different from a standalone UV-Vis (flow cell instead of a cuvette) Variable wavelength detector vs. Diode array detector

from a standalone UV-Vis (flow cell instead of a cuvette) • Variable wavelength detector vs. Diode
from a standalone UV-Vis (flow cell instead of a cuvette) • Variable wavelength detector vs. Diode

HPLC-UV-Vis

Variable wavelength detector - monochromator

PMT
PMT

HPLC-UV-Vis

Diode array detector - polychromator

HPLC-UV-Vis • Diode array detector - polychromator

HPLC-UV-Vis

Variable Wavelength detector

More sensitive due to photomultiplier tube or amplification circuitry Requires more method development

Diode array detector

Less sensitive due to photodiodes only

Very easy to develop a method

Fluorescence

Example: Highlighter Pens absorb UV and blue light and emit yellow-green

Fluorescence • Example: Highlighter Pens absorb UV and blue light and emit yellow-green O O
O O
O
O

Fluorescence Detectors

Fluorescence Detectors

Fluorescence Detectors

Greater sensitivity and selectivity over UV-Vis but the analyte must fluoresce!

λ flu > λ abs

What makes a good fluorophore?

High absorbance, aromatic

Fused rings, electron donating groups

Quantum yield (Φ)

Fluorescence Detectors

Need to select an excitation and an emission wavelength

• Need to select an excitation and an emission wavelength

Chromatogram

Chromatogram Top: UV-Vis Bottom: Fluorescence Hence, fluorescence is more selective and sensitive due to noise reductions

Top: UV-Vis

Bottom: Fluorescence

Hence, fluorescence is more selective and sensitive due to noise reductions

Kesimpulan

Refractive Index Detector

“Legacy” detector, insensitive, no gradients in mobile phase possible

UV-Vis Detector

Detects absorption of chromophoric analytes based on molecular structure

Variable wavelength vs. Diode array detector

Fluorescence Detector

Most sensitive and selective detector

Kurva kalibrasi Nilai Nilai sebenarnya (ng/mL) Area terukur X y (ng/mL) 0,00 0,0000 0,00 0,00
Kurva kalibrasi
Nilai
Nilai sebenarnya
(ng/mL)
Area
terukur
X
y
(ng/mL)
0,00
0,0000
0,00
0,00
0,0000
20,50
0,0249
23,03
20,50
0,0249
51,19
0,0704
51,52
51,19
0,0704
102,39
0,1498
101,11
102,39
0,1498
204,98
0,3021
196,34
204,98
0,3021
511,94
0,7713
489,54
511,94
0,7713
1023,89
1,5683
987,68
1023,89
1,5683
2559,72
3,9766
2492,86
2559,72
3,9766
0,7713 489,54 511,94 0,7713 1023,89 1,5683 987,68 1023,89 1,5683 2559,72 3,9766 2492,86 2559,72 3,9766
     

Nilai terukur

 

Nilai

         

sebenarnya

AREA

Nilai terukur

Rata-rata

CV

(ng/mL)

(ng/mL)

terukur

SD

(%)

% Diff

(ng/mL)

 

0,0241

22,57

     

10,13

0,0232

21,97

7,19

20,50

0,0253

23,28

22,96

0,68

2,95

13,59

0,0254

23,39

14,11

0,0258

23,61

15,17

 

0,0157

17,31

     

-15,55

0,0159

17,46

-14,84

10,25

0,0104

13,98

16,50

6,78

41,12

-31,81

0,0300

26,26

28,09

0,0000

7,50

-63,41

% diff = akurasi % CV = presisi