Lutz, 2005; Xin et al., 2002). Aunque la mayora de los estudios de levadura
lipasas se ocupan de las especies antes mencionadas, hay algunas levaduras
productoras de lipasa emergentes que representan una esperanza para la
innovacin biotecnolgica en esta rea (Ciafardini et al, 2006;. Fernndez et al,
2006;. Kim y Hou, 2006).
Un enfoque til para la obtencin de nuevos biocatalizadores es el aislamiento
de microorganismos a partir de fuentes naturales, seguido por ensayos de
cribado funcionales en la bsqueda de la capacidad enzimtica deseada y la
seleccin de los mejores productores (Schfer et al., 2007). Hasta la dcada de
1980, slo el 2% de los microorganismos del mundo haba sido probado como
fuentes de enzimas. Ms recientemente, varios miles de muestras microbianas
aisladas de suelo se ensayaron para la produccin de lipasas, revelando que el
20% eran productores de lipasas, incluyendo hongos y levaduras filamentosos
(Cardenas et al., 2001; Schfer et al., 2007). El objetivo del presente estudio
fue la bioprospeccin de las levaduras productoras de lipasa de un sustrato
natural inexplorado con miras a la consecucin de una lipasa para aplicaciones
industriales. El hbitat filoplano fue elegida para el aislamiento de
microorganismos debido a que la cutcula de la hoja se compone
principalmente de los componentes lipdicos; Por lo tanto, es un sustrato
apropiado para la deteccin de microorganismos productores de lipasa en la
bsqueda de novedades en este mbito.
Metodologa
Seleccin de las levaduras productoras de lipasa utilizando Tween 20
como el sustrato de crecimiento
Levaduras y levaduras como cepas fueron aisladas de la filoplano de Hibiscus
rosa-sinensis (Parque Farroupilha, Porto Alegre, RS, Brasil) mediante hoja de
impresin en placas de agar YEPG con la siguiente composicin (g / l): extracto
de levadura 5,0, peptona 10.0, glucosa 20,0 y 20,0 agar. Despus de la
incubacin a 22-25 C durante 3-5 das, se aislaron colonias representativas de
cada tipo morfolgico y purificado en un medio de agar YEPG. Las cepas se
mantuvieron en medio GYMP (g / l): glucosa 20,0, extracto de levadura 5,0,
extracto de malta 20.0, fosfato de sodio monobsico 2,0 y 20,0 agar, cubierto
con una capa de aceite mineral estril, y se mantiene a 4 C. Las levaduras
fueron fenotpicamente caracterizadas por pruebas morfolgicas y fisiolgicas
estndar (Yarrow, 1998), y la identificacin se realiz segn Barnett et al.
(2000) y al programa informtico YEASTCOMPARE (Ciriello C y Lachance MA,
derechos de autor? 1999-2001). La Identificacin de la cepa Pseudozyma
hubeiensis HB85A fue confirmada por secuenciacin de la regin D1 / D2 del
26S rDNA, de acuerdo con Kurtzman y Robnett (1998). La Seleccin de
productores de lipasa se realiz en tubos que contienen levadura y 0,5% de
Tween 20 (Von Tigerstrom y Stelmaschuk, 1989). Los microorganismos aislados
previamente haban sido cultivadas en placas de agar YEPG a 22-25 C por 2
das, y se inocula en agua destilada durante 24 horas con el fin de agotar sus
recursos endgenos nutricionales. El crecimiento en los tubos de ensayo de
Tween 20 durante un mximo de 7 das indic la presencia de la actividad
durante 30 min a pH 8,0 , con respecto a un control sin enzima. Para inicializar
la reaccin, se aadi a 0,9 ml de la solucin de sustrato que contiene 3 mg de
pNPP disuelto en 1 ml de isopropanol y 9 ml de la siguiente solucin 0,1 ml del
cultivo sobrenadante libre de clulas: 50 mM Tris-HCl pH 8,0, ms 40 mg de
Triton X-100 y 10 mg de goma rabe (Silva et al., 2005). Una unidad de lipasa
(U) se defini como la cantidad de enzima que libera 1 lmol p-nitrofenol por
minuto, en las condiciones de ensayo descritas anteriormente. La curva de
calibracin se prepar usando p-nitrofenol como estndar. Los valores se
expresan como la media la desviacin estndar por triplicado para cada
punto. La actividad de proteasa se determin midiendo el aumento en la
absorbancia a 400 nm en un espectrofotmetro visible (Ultrospec 2000)
causada por la hidrlisis de la azocasena a 50C durante 1 h. Las alcuotas de
0,1 ml de la solucin de azocasena (20 g / l) y 0,2 ml de tampn de fosfato de
sodio mM 50 (pH 7,9) se mezclaron con 0,1 ml de los sobrenadantes de cultivo
libre de clulas (Silva et al., 2005). Despus de la incubacin durante 15 min a
50 C, se aadieron 0,8 ml de cido tricloroactico al 20% con el fin de detener
la reaccin. Despus de la centrifugacin (5 min / 10.000 rpm), la absorbancia
del sobrenadante se ley a 400 nm en un espectrofotmetro visible. Una
unidad de proteasa (U) se define como la variacin de la absorbancia en las
condiciones de ensayo descritas anteriormente. Los valores se expresan como
la media la desviacin estndar por triplicado para cada punto. La
determinacin de protenas se realiz segn Bradford (1976) utilizando
albmina de suero bovino como estndar. Los valores se expresan como la
media la desviacin estndar por triplicado para cada punto.
Caracterizacin de la lipasa
La caracterizacin de Lipasa se realiz utilizando como fuente de enzima los
sobrenadantes de cultivo a partir del cultivo del biorreactor. Las Condiciones
para la evaluacin de la actividad de la lipasa fueron los mismos como se
describi anteriormente, a menos que se indique lo contrario. El sustrato
palmitato de p-nitrofenilo (pNPP) se utiliz para la mayora de determinaciones
de la actividad lipasa en este trabajo. Los Ensayos de actividad se realizaron
tambin con otros steres de p-nitrofenol (PNP), a saber, acetato de pnitrofenilo (ya pirimifos metil), butirato de p-nitrofenilo (PNPB) y miristato de pnitrofenilo (PNPM).
Una unidad de lipasa (U) se defini como la cantidad de enzima que libera 1
lmol pnitrophenol por min a 37C y pH 8,0. El pH ptimo se determin usando
pNPP como sustrato en soluciones tampn de valores de pH que oscila desde
3,0 hasta 9,0 (50 mM de citrato-fosfato de pH 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 y 7,0; Tris-HCl
50 mM pH 8,0 y 9,0). La temperatura ptima para la actividad de la lipasa se
determin usando pNPP como sustrato a diferentes temperaturas (30-70 C) con
tampn de citrato-fosfato 50 mM a pH 7,0. La estabilidad de la temperatura de
la lipasa se determin mediante la incubacin de 0,1 ml de los sobrenadantes
de cultivo de 20, 40 min y 1 h a los 30, 40, 50 y 60 C en ausencia de un
sustrato.
La
actividad
residual
se
midi
mediante
el
ensayo
espectrofotomtrico a 50 C y pH 7,0. Los valores se expresan como la media
la desviacin estndar por triplicado para cada punto. Para probar el efecto de
los detergentes y otros productos qumicos sobre la actividad de la lipasa, los
sobrenadantes de cultivo (0,1 ml) se incubaron durante 1 h a 40 C en presencia
de 1% (v / v) de los detergentes (Triton X-100, Tween 80, Tween 20 y SDS) y 20
mM de BaCl2, CaCl2, MgCl2, KCl y EDTA. La actividad residual se midi
mediante el ensayo espectrofotomtrico a 50 C y pH 7,0. Los valores se
expresan como la media la desviacin estndar por triplicado para cada
punto. Para probar la estabilidad de la lipasa en presencia de disolventes
orgnicos, los sobrenadantes de cultivo (0,1 ml) se incubaron en 0,1 ml de
acetona, metanol, etanol, 2-propanol, n-butanol, iso-octano y hexano a
diferentes concentraciones (20%, 50% y 80%) durante 1 hora a 40 C. para el
control, 0,1 ml de sobrenadante de cultivo se incub con agua destilada
durante 1 hora a 40 C. la actividad residual se midi mediante el ensayo
espectrofotomtrico usando 0,1 ml de la mezcla de incubacin a 50 C y pH 7,0.
Los valores se expresan como la media la desviacin estndar por triplicado
para cada punto.
Anlisis estadstico
Todos los experimentos se realizaron por triplicado y el anlisis estadstico se
realiz mediante el programa SPSS 13.0. El anlisis de varianza se llev a cabo
utilizando el procedimiento ANOVA por el procedimiento de comparacin
mltiple de Tukey para determinar las diferencias significativas entre las
medias.
Resultados y discusin
Un total de 84 de la levadura y levadura como colonias aisladas del filoplano de
H. rosa-sinensis fueron elegidos y purificados al azar. Las cepas identificadas
con el nombre de la especie y el sufijo '' -como "significan que difieren
ligeramente de la descripcin estndar de la especie. Algunos linajes se
identificaron slo en el nivel de gnero. La Proyeccin sobre Tween 20 de
cultivo lquido nos permiti seleccionar 29 aislamientos que tuvieron un buen
crecimiento en este sustrato (Tabla 1). Estos 29 aislamientos fueron
adicionamente seleccionados para la produccin de lipasa con grasa bovina; y,
entre ellos, los diez mejores secretores de lipasa se rastrearon adicionalmente
utilizando aceite de soja como fuente de carbono (Tabla 2). Estos sustratos
fueron elegidos porque son materias primas de bajo costo para la produccin
de enzimas. Los mejores productores de lipasa en grasa y aceite de soja bovina
fueron P. HB85A cepa hubeiensis (610 U / l en grasa bovina y 386 U / l en el
aceite de soja), cepa Debaryomyces occidentalis similar HB83 (306 U / l en
grasa bovina y 352 U / l en el aceite de soja) y Cryptococcus sp. La cepa HB80
(293 U / l en grasa bovina y 350 U / l en el aceite de soja). S. cepa salmonicolor
como HB75, Cryptococcus sp. 2 HB87 y el fermentador de levadura negro HB49
no present actividad lipoltica en el aceite de soja, aunque su actividad en la
grasa bovina era bueno.
Las lipasas son en su mayora enzimas inducibles y sus inductores, tales como
aceites, son necesarios para la produccin de enzimas (Sharma et al., 2001).
Para la fermentacin por lotes a escala planta piloto, el aceite de soja fue
elegido como la fuente de carbono. La levadura seleccionada para la
fermentacin a escala de planta piloto fue la cepa P. hubeiensis HB85A porque
tena la mejor actividad de la lipasa tanto en la grasa bovina como el aceite de
soja. la Identificacin de la cepa P. hubeiensis HB85A fue confirmada por
secuenciacin de la regin D1 / D2 del 26S rDNA (nmero de acceso de
GenBank DQ123912). Se observ crecimiento de la levadura durante todos los
perodos de fermentacin con un pH constante (Fig. 1A). Hubo un pico en la
actividad de la lipasa (1.232 U / l) a 18 h de tiempo de fermentacin, seguido
de una breve descenso que se mantuvo constante hasta 22 h, mientras que el
pico en la actividad especfica estaba en 16-18 h, con 4.8 102 U de lipasa / lg
de protena total (Fig. 1B). Esto corresponde a la fase de crecimiento
exponencial media. Por lo tanto, como varios otros microorganismos, como C.
rugosa (Valero et al., 1991) y Aspergillus terreus (Gulati et al., 2000), la
produccin de lipasa por la cepa de P. hubeiensis HB85A era un fenmeno de
crecimiento asociada. En contraste con esto, la produccin de lipasa por las
bacterias Pseudomonas aeruginosa (CHARTRAIN et al., 1993) no fue un
crecimiento asociado, ya que la lipasa se indujo slo en la fase exponencial
tarda y alcanz un pico en la fase estacionaria tarda.
Comparando el proceso de fermentacin por lotes en el biorreactor 14 l (aceite
de soja, 28 C y la agitacin tasa de 200 rpm) a los estudios anteriores en
matraces Erlenmeyer en las mismas condiciones, la produccin de lipasa se
mejor 386 a 1.232 U / l en el reactor y, ms importante, la duracin del
proceso de produccin se redujo significativamente 48 a 18 h. Tambin se
observ Este comportamiento durante la produccin de lipasa por A. terreus en
un 10 l de fermentacin por lotes (Gulati et al., 2000) con una actividad de la
lipasa 10% mayor en el reactor que en matraces de agitacin, y una
disminucin significativa en la duracin de la fermentacin, 96-54 h. Gulati et
al. (2000) sugirieron que tanto el aumento de la produccin de lipasa, as como
la reduccin en el tiempo de fermentacin se debieron a mayores tasas de
transferencia de oxgeno causada por el aumento de la agitacin. Por lo tanto,
la mejora en la tasa de produccin de lipasa por P. HB85A hubeiensis en el
reactor fue probablemente debido a la cantidad de oxgeno inyectado
continuamente a travs del sistema, mientras que slo el oxgeno difunde en el
matraz Erlenmeyer. Este argumento est de acuerdo con las investigaciones
realizadas por Domnguez et al. (2005) y Li et al. (2005), quien inform que la
produccin de la enzima lipoltica por Thermus thermophilus HB27 y
Acinetobacter radioresistens slo se produjo cuando el aire se suministr
continuamente al biorreactor. Otras consecuencias del sistema de agitacin
que podra explicar el aumento en la produccin de lipasa fueron el mayor
contacto de los componentes del medio con microorganismos y la mejor
dispersin de aceite en el medio. Estos parmetros hacen posible una
produccin de mayor y ms rpido de lipasa.
Es posible que otras protenas pueden influir en la actividad de la lipasa
durante la fermentacin, especialmente proteasas. Los lotes se evaluaron
tambin por el contenido de proteasa en el medio (Fig. 1B). Las proteasas