Anda di halaman 1dari 17

Validasi Metode dengan HPLC

KELOMPOK C6
Nadia Tria Nurchasanah K100120056
Rizki Amalia Safitri K100120064
Eka Febriyanti K100120066
Korektor :

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH
SURAKARTA
2014

ABSTRAK
Dilakukan validasi metode analisis penetapan kadar parasetamol
dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi. Parameter yang digunakan
pada percobaan ini adalah linieritas, ripitabilitas, presisi antara, akurasi dan
keseragaman kandungan. Parasetamol ditetapkan dengan metode high
performance liquid cromatografy karena untuk memisahkan komponen
berdasarkan dua fase yaitu fase gerak dan fase diam dengan metode kolom.
Hasil validasi memiliki harga tidak diterima karena tidak memenuhi syarat
keberterimaan. Linieritas r = 0,979<0,98 ; ripitabilitas RSD 43,51%b/b>2% ;
presisi antara RSD 19,23%b/b > 2%; Akurasi RSD penambahan zat aktif
80%= 0,959% <1%; %recovery 200,37 % ; penambahan zat aktif 100%=
1,107%>1% ; %recovery 204,45%; penambahan zat aktif 120% = 1,794%>1% ;
%recovery 339,75%; keseragaman kandungan RSD > 6 dan kadar antara 85%115% tidak diterima.
ABSTRACT
Validated analytical methods paracetamol assay with highperformance liquid chromatography method. The parameters used in this
experiment is linearity, ripitabilitas, the precision, accuracy and uniformity
of content. Paracetamol determined by the method of high performance
liquid cromatografy due to separate components based on two phases,
namely the mobile phase and stationary phase column with the method.
The results of the validation has not accepted the price because it does not
meet the acceptance requirements. Linearity r = 0.619 <0.98; ripitabilitas
RSD 43.51% w / w> 2%; precision between RSD 19.23% w / w> 2%;
Accuracy of RSD addition of active substance 80% = 0.959% <1%; %
200.37% recovery; addition of the active substance 100% = 1.107%> 1%;
% 204.45% recovery; addition of the active substance 120% = 1.794%>
1%; % 339.75% recovery; content uniformity RSD> 6 and levels between
85% -115% is rejected.

I.

Pendahuluan

a) Fisiko kimia parasetamol

Pemerian

: hablur atau serbuk hablur putih, tidak berbau, rasa

Kelarutan

: larut dalam 70 bagian air, dalam 7 bagian etanol

pahit.

(95%) P, dalam 13

bagian aseton P,

dalam 40 bagian

gliserol P, dan dalam 9 propilenglikol P, larut dalam larutan


alkali hidroksida.
Khasiat

: analgetikum dan antipiretikum.

BM

: 151,16

Persyaratan kadar

: mengandung tidk kurang dari 98 % dan tidak

lebih dari 101,0 %


C8H9NO2

dihitung

terhadap

zat

yang

telah

dikeringkan.
Penyimpanan

: dalam wadah tertutup baik.


(Depkes RI, 1979)

b) Metode-metode

analisis

yang

bisa

digunakan

untuk

menetapkan parasetamol
Spektrofotometri UV
1
Mencari harga E1 cm dalam HCl, didapatkan harga 668 pada 245 nm.

Kemudian menimbang 100 mg parasetamol dan melarutkanya dalam HCl


0,1 N ad 100 mL. Selanjutnya menentukan maksimal dengan cara
mengambil 100 L larutan stok parasetamol kemudian Menambahkan HCl

0,1 N sebanyak 10,0 mL dalam labu takar lalu memasukkanya ke dalam


kuvet. Membaca absorbansinya pada spektrofotometri UV range 200400nm. Kemudian membuat kurva baku larutan standart dengan cara
membuat seri volume pengambilan larutan stok 250L, 400L, 500L,
800L, 1000L. Lalu memasukkanya ke dalam labu takar dan ditambahkan
HCl 0,1 N ad 10,0 mL. Setelah itu dimasukkan ke dalam kuvet dan dibaca
absorbasinya sesuai max pada spektrofotometri UV. Dibuat persamaan
regresi liniernya. Dilakukan pengukuran absorbansi sampel dengan cara
menimbang seksama kurang lebih 100mg parasetamol, lalu memasukkanya
ke dalam labu takar dan ditambahkan HCl 0,1 N ad 10 mL dan dibaca
absorbansinya. Menghitung kadar sampel dengan cara memasukkan hasil
absorbansi dalam persamaan kurva baku sebagai Y. kemudian didapatkan x
(kadar).
(Auterhoff dan Kovar, 2002)

Nitrimetri
Pembakuan larutan natrium nitrit dilakukan dengan cara menimbang

173 mg asam sulfanilat lalu melarutkanya ke dalam 30 mL akuades.


Menambahkan 20 tetes larutan ammonia 25 % sampai larut dan 15 mL HCl
1N, KBr 1 gram. Kemudian dititrasi dengan larutan NaNO 2 0,1 M, titrasi
akhir ditunjukkan dengan perubahan warna dari ungu ke biru terang.
Penentuan kadar parasetamol dalam tablet ditentukan dengan cara
menimbang 600 mg sampel parasetamol yang telah dihaluskan dan
melarutkanya dalam 20 mL larutan HCl dalam air (1:2). Kemudian direfluks
campuran selama 30 menit dan didinginkan. Setelah itu ditambahkan 5
gram KBr, 5 tetes tropeolin-OO, 3 tetes metilen blue. Lalu dititrasi dengan
larutan NaNO2 0,1 N. titik akhir titrasi ditunjukkan dengan perubahan warna
dari ungu ke biru terang.
(Prima, Aulia, Triana, 2013)
Spektrofotometri UV-vis
Penetapan kadar parasetamol
menimbang

100

mg

tablet

pada

parasetamol

tablet
yang

dilakukan
telah

dengan

dihaluskan.

Menambahkan akuades ad 100 mL dalam labu takar lalu diambil 500 L.


Kemudian ditambahkan 0,5 mL HCl 6N; 0,4 mL NaNO 2 dan didiamkan

selama 5 menit, lalu ditambahkan 1 mL asam sulfamat. Setelah itu


ditambahkan 2,5 mL NaOH 15% dan ditambah akuades ad 10 mL. diukur
absorbansinya pada 430 nm dan dihitung kadar sampel dengan cara
memasukkan hasil absorbansi dalam persamaan kurva baku sebagai Y.
c) Dasar Teori
KCKT atau HPLC dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun
1970-an. Saat ini, KCKT merupakan tekhnik pemisahan yang diterima secara luas
untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah
bidang antara lain: farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industry-industri
makanan. Beberapa perkembangan KCKT terbaru antara lain: miniaturisasi system
KCKT, penggunaan KCKT untuk analisis asam-asam nukleat, analisis protein, analisis
karbohidrat, dan analisis senyawa- senyawa kiral.
(Rohman, 2007)

Asetaminofen atau yang biasa disebut parasetamol, mempunyai efek


farmakologi sebagai antipiretik dan analgetik sama dengan asetosal,
meskipun secara kimia tidak berkaitan. Tidak seperti asetosal, asetaminofen
tidak mempunyai daya kerja antiradang dan tidak menimbulkan iritasi dan
pendarahan lambung. Sebagai obat antipiretika, dapat digunakan baik
asetosal, salsilamid, maupun asetaminofen. Diantara ketiga obat tersebut,
asetaminofen mempunyai efek samping yang paling ringan dan aman untuk
anak-anak. Untuk anak-anak di bawah umur 2 tahun sebaiknya digunakan
asetaminofen, kecuali ada pertimbangan khusus lainya dari dokter. Dari
penelitian pada anak-anak dapat diketahui bahwa kombinasi asetosal
dengan asetaminofen bekerja lebih efektif terhadap demam daripada jika
diberikan sendiri-sendiri.
1996)
II.
Prosedur Resmi
A. Preparasi Sampel

(Sartono,

Timbang

semua

tablet

kemudian

gerus

dan

ambil

100mg.

Melarutkannya ke dalam methanol:air (20:80) ad 10 mL dan disaring.


Kemudian dilakukan pengenceran 10x (diambil 50 L ad 5 mL).
B. Pembakuan Larutan Baku
Menimbang seksama 2500 mg parasetamol. Melarutkanya dalam
methanol air (20:80) ad 100 mL kemudian disaring.
C. Pembuatan Kurva Baku
Membuat seri konsentrasi dengan pengambilan larutan baku (0,0025;
0,0050; 0,0075; 0,001; 0,0125). Menambahkan pelarut ad 5mL kemudian
disaring. Mengambil hasil saringan 20L menggunakan syringe dari masingmasing konsentrasi larutan baku dan menyuntikkan ke dalam kolom.
Membuat kurva baku dengan cara memplotkan luas puncak kromatogram Vs
kadar (%b/v). dari persamaan kurva baku, dibuat persamaan regresi
liniernya.
D. Penetapan Kadar
Menimbang serbuk parasetamol 100 mg. Melarutkannya ke dalam
methanol:air (20:80) ad 10 mL dan disaring hingga tidak ada partikelnya.
Melakukan pengenceran 100x dengan cara mengambil 50 L larutan sampel
ad 5 mL pelarut. Kemudian diinjeksikan ke dalam kolom sebesar 20 L dan
dihitung kadarnya dengan melihat nilai luas areanya.

III.
Cara kerja Skematis
a. Preparasi Sampel

d
h
L
,
t
b
m
5
(
x
0
1
c
e
p
u
k
l
D
g
n
r
a
s
i
6
4
:
o
)

0
,j2
L
5
h
V
c
o
v
k
m
p
d
ln
s
g
e
tr
a
u
ib
D
1
;7
/)y
(%
Pembuatan Larutan Baku

D
itm
b
a
n
g
d
e
n
g
a
n
se
k
sa
m
a
2
5
0
m
gD
im
a
su
ka
n
k
e
d
a
lm
la
b
u
ta
kr1
0
m
L
,d
ita
m
b
a
h
p
e
la
ru
ta
d
1
0
m
L(m
e
ta
n
o
l:a
ir,4
0
:6
0
)D
id
a
p
tk
a
n
k
a
d
rla
ru
ta
n
b
a
k
u
,jik
a
d
a
p
a
rtik
e
ld
ila
k
u
a
n
p
e
n
y
a
rin
g
a
n
p
a
rc
e
ta
m
o
l

Pembuatan Kurva Baku

1
b
m
h
g
L

,
0
2
e
j
D
r
s
u
l
n
k
t
p
a
d
i
c
)
6
4
(
:
C
P
H
o
y
4
1
,
f
z
T
p
0
2
b
P
H
m
j
s
l
k
y
v
o
c
e
r
%
a
d
S
R
g
n
u
t
h
i
D
8
5
:
C
L
Penetapan Kadar

b. Akurasi

;9
3
=
%
7
5
)1
8
:(4
-o
L
,
0
2
w
y
h
ltD
g
d
b
v
u
k
n
m
s
e
rp
a
ic
6
1
x
L

0
2
b
v
e
m
s
,
p
y
k
7
r
d
S
R
a
l
g
n
u
t
h
i
D

)
6
4
;
:
(
o
%
<
j

c. Linieritas

d. Ripitabilitas

e. Presisi Antara

J7
c
C
:P
-L
%
5
8
y
1
o
T
D
S
R
g
h
H
b
0
2
,lu
n
m
s
p
rjd
te
a
ik
6
<

p
g
1
r
L

0
2
b
D
h
d
,
m
l
o
e
a
k
t
n
u
s
i
x
7
:
y
S
R

f. Keseragaman Kandungan

IV.

Hasil dan Pembahasan

a. Pembuatan dan pembakuan larutan baku


Konsentrasi

RT

Peak Area

0,0025

2,750

3141460,34

0,0050

2,748

5191635,57

0,0075

2,755

3261337,09

0,0100

2,748

6675768,80

0,0125

2,755

11300848,8

A = 3306390,9

B = 457512122,2

r = 0,619799368

y=45751212,2 x +3306390,9

b. Penetapan kadar parasetamol


Peak area

= 2062165,21

RT

= 2,762

fp=

1244225,7=45751212,2( x )

( x )=2,719546958 x 103

5 mL
=100 x
50 L

kadar =( x ) fp

y=Bx+ A

2,719546958 x 103 x 100=0,2

2062165,21=45751212,2(x )+3306390,9

c. Ripitabilitas
Percobaan

Peak Area

Kadar (% b/b)

mg / tab

3575117,61

0,765

4,532

7157928,88

0,807

4,781

5425703,76

0,461

2,731

10574117,40

1,57

9,302

6423023,23

0,674

3,993

6386208,83

0,667

3,951

6642238,10

0,731

4,331

0,81

70,47

SD

0,35

6,55

RSD

43,2>2%

43,51>2%

Dari hasil percobaan pada parameter ripitabilitas, kadar tidak memenuhi syarat
keberterimaan karena harga RSD > 2%, sehingga harga tersebut tidak diterima. Penetapan kadar
ini dilakukan dengan keterulangan penetapan kadar sebanyak 7 kali. Parameter ini untuk melihat
tingkat kedekatan hasil uji pada hari yang sama, sampel yang sama, analisis yang sama atau pada
kondisi kerja yang normal.
d. Presisi Antara

Percobaan

Peak Area

Kadar (% b/b)

mg / tab

3575117,61

0,6717

339,61

7157928,88

0,4438

324,61

5425703,76

0,8312

420,25

10574117,40

0,8113

410,19

6423023,23

0,7342

371,21

6386208,83

0,6257

316,35

6642238,10

0,7818

392,27

0,699

353,46

SD

0,135

67,98

RSD

19,31>2%

19,23 >2%

Pada hari lain dilakukan penetapan kadar sama seperti ripitabilitas. Hasilnya dirata-rata
dan tetap tidak memenuhi syarat keberterimaan yaitu nilai RSD>2%. Suatu hasil dikatakan
presisi jika dalam suatu seri pengukuran mempunyai selisih yang sangat kecil antara satu nilai
dengan nilai yang lainnya.
e. Akurasi
Orientasi
Peak Area

Tanpa penambahan

Sampel + ZA 80%

Sampel + ZA 100%

Sampel + ZA 120%

3315940,91

Kadar
percobaan
2,09

10

103

10

0,959

200,37

1,107

204,45

1,794

339,75

8,97

7410711,2
6

0,418

5,53

5838858,9
2

recovery

4,79

5500484,5
3

Kadar
(% b/v)

103

Replikasi 1
Peak Area

Tanpa penambahan

3378006,82

Sampel + ZA 80%

5440444,35

Sampel + ZA 100%

6514157,67

Kadar
percobaan

1,56

Kadar
(% b/v)

recovery

0,0312

0,9328

333,63

1,402

406,76

1,783

432,54

10

4,66 10

3
7,01 10

8,913
Sampel + ZA 120%

4104320,35

10

Replikasi 2
Peak Area

Kadar

Kadar
(% b/v)

percobaan

recovery

2,26
Tanpa penambahan

4339827,42

10

0,452

1,562

411,11

1,470

302,08

1,766

324,44

Kadar
(% b/v)

%
recovery

1,3776

1,41

12

1,571

57,39

1,786

100,84

7,81
Sampel + ZA 80%

6880652,61

103
7,35

Sampel + ZA 100%

Sampel + ZA 120%

6670320,85

103
8,83

7,347551,0

103

Replikasi 3
Peak Area

Kadar
percobaan

6,89
Tanpa penambahan

6457662,31

103
7,05

Sampel + ZA 80%

6520342,93

10

7,86
Sampel + ZA 100%

6901232,73

103
8,93

Sampel + ZA 120%

Sampel + ZA 80%
Sampel + ZA 100%
Sampel + ZA 120%

7392616,83

10

SD

RSD

252,25
255,41
285,94

211,64
179,29
169,17

83,91
70,19
169,03

Pada parameter akurasi ini didapatkan nilai RSD dan persen perolehan kembali yang
tidak memenuhi syarat keberterimaan yaitu nilai RSD<1% sedangkan angka perolehan kembali
antara 98-102%. Akurasi untuk melihat ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai
terukur (hasil analisis) dengan nilai yang diterima baik nilai konvensi, nilai sebenarnya, atau nilai
rujukan pada hasil diatas tidak dapat diterima.
f.

Keseragaman Kandungan
Peak Area

RT

Tablet 1
Tablet 2
Tablet 3
Tablet 4
Tablet 5
Tablet 6
Tablet 7
Tablet 8
Tablet 9

6691004,31
63961185,87
5715732,28
6511398,10

4,110
4,133
4,128
4,133

60677694,39
5997937.61
5550877.78
6099511.28
6143328.00

Tablet 10

5914446.45

4,115
4,312
4,118
4,128
4,130
4,112

Kadar
(% b/v)
0,194
0,1625
0,0878
0,175

0,126
0.1188
0.0697
0.13
0.134
0.109

37.99

SD
RSD

11.29
29.71

Kadar
(% b/b)
48,892
40,77
22,038

43,83
31.63
29.78
17,477
35,565
33,60
27,304

mg/tab

% klaim

290,38
242
130,89
260,3

58,077
48,4
26,17
52,06

188
176
103
193
199

37.6
35.2
20.6
38.6
39.8
32.4

162

Parameter keseragaman kandungan dilakukan dengan menggunakan metode analisis yang


sesuai, dengan menentukan kadar zat aktif satu per satu dari 10 tablet (atau sediaan lainnya) yang
dipilih secara acak. Dari hasil diatas untuk 10 tablet yang di analisis ada step 1 memenuhi syarat
keberterimaan yaitu nilai RSD>6%. Sehingga dianjutkan pada step 2 karena belum memenuhi
syarat sesuai USP.

Perbandingan hasil dengan jurnal

Validation System

Linearity

Recovery experiment

Dari hasil praktikum dari berbagai parameter yang divalidasi dilakukan perbandingan hasil
dengan jurnal. Dilakukan perbandingan dengan jurnal yang mempunyai metode yang sama
dengan yang kita praktikkan yaitu high performane liquid cromatography.
Dari jurnal 1 didapatkan hasil dari analisis pertama parameter presisi menunjukkan hasil
RSD atau CV menunjukkan hasil 2,56% yang menunjuk hasil diterima karena nilai tersebut
memenuhi syarat keberterimaan. Dari hasil linieritasnya didapatkan hasil r = 0,999.
.
Pada penetapan kadar yang kita lakukan dari hasil parameter linieritas, akurasi,
ripitabilitas, dan presisi antara tidak memenuhi syarat keberterimaa. Untuk keseragaman bobot
memenuhi syarat keberterimaa. Sedangkan pada jurnal semua hasil parameter uji memenuhi
syarat keberterimaan. Faktor-faktor yang mempengaruhi hasil yang berbeda tersebut adalah
kondisi percobaan, kemurnian reagen, kestabilan reagen, kondisi saat preparasi maupun sat
titrasi, dan ketelitian saat pembacaan volume pada buret maupun pembacaan potensial.
V.

Kesimpulan dan Saran

Kesimpulan
Didapatkan hasil yang tidak sesuai dengan nilai keberterimaan, tetapi pada jurnal sesuai
dengan nilai keberterimaan dari setiap parameter yang divalidasi. Disebabkan kondisi percobaan,
kemurnian reagen, kestabilan reagen, dan kondisi saat preparasi maupun saat memasukkan
sampel ke dalam HPLC.

Saran
Perlu dilakukan validasi ulang dan penelitian lebih lanjut untuk mendapatkan metode
yang baik dalam penetapan kadar parasetamol.
VI.

Daftar Pustaka
Anonim, 1979, Farmakope Indonesia, Edisi III, Depkes RI, Jakarta
Auterhoff, H., Karl-Artur Kovar, 2002, Identifizierung von Arzneistoffen, diterjemahkan
oleh N. C. Sugiarso, Identifikasi Obat, ITB, Bandung.
Gandjar, I.G. dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,
Yogyakarta.
Prima, Aulia, Triana, 2013, Penetapan Kadar Senyawa Obat dengan
Metoda Nitrimetri,1-4
R. Chandra, K. Dutt Sharma, 2013, Quantitative Determination Of
Paracetamol And Caffeine From Formulated Tablets By Reversed
Phase-Hplc Separation Technique, International Journal of
Chromatographic Science, 32, 33.
Sartono., 1996, Apa yang Kamu Ketahui Tentang Obat-obat Bebas dan
Terbatas, Edisi II, PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta