PRCTICA N 1
EXTRACCIN, PURIFICACIN Y CUANTIFICACIN DE
ADN GENMICO HUMANO
PROFESOR MSC. BLGO. JOS LLONTOP NUEZ
I.
COMPETENCIAS.
1. Explica y comprende los pasos de extraccin y purificacin de ADN
genmico humano usando un kit comercial.
2. Realiza la cuantificacin de ADN genmico humano por mtodos
espectrofotomtricos.
3. Comprende la importancia de la aplicacin de la tcnica de extraccin,
purificacin y cuantificacin de ADN genmico humano en Gentica
Mdica.
II.
INTRODUCCIN
El aislamiento del ADN es un paso esencial en el laboratorio, aunque existen muchos
mtodos para realizar la extraccin, el procedimiento debe ser diseado para el
organismo del cual se va a obtener el ADN, debido a que la estructura y composicin
de los organismos varan. La caracterstica comn de los mtodos de extraccin es
que primero se debe destruir la clula y luego el ADN es separado de los otros
componentes tales como protenas, lpidos y carbohidratos. La mayora de los
protocolos tambin incluyen una digestin con RNAasa para degradar el ARN. El
mtodo ms simple para liberar los cidos nucleicos exige solamente un paso de lisis.
Hay una variedad de mtodos para la liberacin de los cidos nucleicos, por ejemplo,
en el caso de microorganismos, hervir con agua o buffer PCR, uso de detergentes con
o sin calor, ciclos de calentamiento y enfriamiento, SDS-proteinasa K, usos de
enzimas, sonicacin y calor2.
Despus de liberar el ADN con cualquier mtodo, es esencial que se remueva
cualquier sustancia que pueda causar la inhibicin de la amplificacin por PCR
usando un procedimiento de purificacin confiable, reproducible y sensible. El
mtodo ms convencional es la extraccin de las protenas con fenol-cloroformo,
precipitacin del ADN con etanol, y concentracin del ADN con isopropanol o
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Materiales y equipos
3.1.1. Materiales:
A. Biolgico:
B. Reactivos:
Etanol puro.
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3.2.
Microcentrfuga 10000g.
Centrfuga universal.
Vrtex.
1 Marcador indeleble.
Gorras de bioseguridad.
Papel absorbente.
Procedimientos.
3.2.1. Extraccin de la muestra de sangre.
Lisis Celular
1) Colocar el Bao mara a 55C.
2) Aadir, a un tubo de microcentrfuga estril, 200 l de
muestra de sangre fresca o congelada (si el volumen de
muestra es menos de 200 l ajustar el volumen de
muestra a 200 l usando PBS 1X).
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Binding DNA
1) Remover una columna Spin PureLink del paquete del kit.
2) Aadir el lisado (~ 640 l) obtenido a la columna Spin.
3) Centrifugar la columna a 10000xg por 1 minuto a
temperatura ambiente.
4) Descartar el tubo de coleccin y colocar la columna Spin
en un tubo de coleccin PureLink disponible en el kit.
Washing DNA
1)
2)
3)
Eluting DNA
1) Colocar la columna en un tubo de microcentrfuga de 1.5
ml.
2)
3)
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temperatura ambiente.
4)
5)
6)
Storing DNA
1)
2)
3)
3.2.2
Cuantificacin de ADN
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y poner READ.
La lectura tardar
aproximadamente 20 seg.
- Remover el estndar N 1.
- Insertar el tubo que contiene el estndar N 2 en el
fluormetro, cerrar la tapa y poner READ.
- Remover estndar N 2.
Si presionamos NO (ltima calibracin)
- El screen de la muestra ser automticamente visualizado.
-
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Manejo de Residuos
3.2.4
Referencias Bibliogrficas
1. Life Technology Corporation User Guide PureLink Genomic
DNA Kits, USA, 2012. Disponible en:
http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/pur
elink_genomic_man.pdf.
2. Luque, J. y A. Herrez. Texto Ilustrado de Biologa Molecular
e Ingeniera Gentica: Conceptos, Tcnicas y Aplicaciones
en Ciencias de la Salud. Edit. Elsevier Science, Universidad
de Alcal, Madrid- Espaa, 2002.
3. Buckingham, L. and M. Flaws. Molecular Diagnostic:
Fundamentals, Methods and Clinical Applications. Edit.
F.A. Davis Company, USA. 2007.
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FUNDAMENTACIN
METODOS DE EXTRACCIN
Para extraer los cidos nucleicos del material biolgico es preciso provocar una lisis
celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los cidos nucleicos de los restos de
clulas. El procedimiento de lisis idneo suele consistir en un equilibrio de tcnicas y ha de
ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo (un tejido, por
ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el cido nucleico diana. Entre los
procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes:
Rotura mecnica (trituracin, lisis hipotnica, etc.);
Tratamiento qumico (detergentes, agentes caotrpicos, reduccin con tioles, etc.);
Digestin enzimtica (Proteinasa K, etc.).
Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al mismo
tiempo. Por ejemplo, una misma solucin puede contener detergentes que solubilicen las
membranas celulares y sales caotrpicas fuertes que inactiven las enzimas intracelulares.
Tras la lisis celular y la inactivacin de las nucleasas, los restos de clulas se eliminan
fcilmente por filtracin o precipitacin.
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METODOS DE PURIFICACIN
Los mtodos empleados para purificar los cidos nucleicos de extractos celulares suelen ser
combinaciones de dos o ms tcnicas de las siguientes:
Extraccin/precipitacin.
Cromatografa;
Centrifugacin;
A menudo se efecta una extraccin con disolventes para eliminar los contaminantes de
los cidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse una combinacin de fenol y cloroformo
con objeto de eliminar las protenas. Para concentrar los cidos nucleicos suele realizarse
una precipitacin con isopropanol o etanol. Si la cantidad de cido nucleico diana es
escasa, puede aadirse a la mezcla un portador inerte (como el glucgeno) para favorecer
la precipitacin. Tambin puede realizarse una precipitacin selectiva con concentraciones
salinas elevadas (precipitacin salina) o una precipitacin de las protenas mediante
cambios del pH.
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