PEWARNAAN GRAM

LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI 1

BAB 1
PENDAHULUAN
1.1. LATAR BELAKANG
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram positif dan gram negative, berdasarkan
sifat kimia dan fisika dinding sel mereka, metode ini diberi nama berdasarkan penemunya,
ilmuwan denmark hans Christian gram 1853-1938 yang mengembangkan teknik ini pada
tahun 1884 untuk membedakan pneumokokus dan bakteri klebsiella pneumoniae.
Dalam melakukan pewarnaan gram diperlukan empat macam pewarn

aan dengan

fungsi yang berbeda yaitu :

Pewarnaan primer,(dapat memberikan warna pada semua jenis bakteri)

Pengikat (memperkuat ikatan kompleks antara pewarna dengan komponen dinding bakteri

Penghilang warna (melarutkan sisa zat warna dan kompleks zat warna dengan lipid pada
dinding bakteri)

Pewarnaan pengganti (memberikan warna pada dinding bakteri yang kehilangan pewarna
primernya.
Pada dasarnya bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu (tongkat), kokus dan spirilum. Bakteri
yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil
pembagianya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi
monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus
(bentuknya mirip buah anggur). Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu setenggah
melengkung dan tidak melengkung. Stapylococcus aureus adalah bakteri gram positif yang
berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentuk seperti buah anggur.Beberapa
karakteristik yang dimiliki staphylococcus Aureuss diantaranya hemolytic pada darah agar,
catalase-oxidase-positif dan negative, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat
dan lingkungan NaCI pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim
coagulase. Selain itu, biasanya Stapylococcus aureus merupaka pathogen seperti bisul, styes

dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru, radang kelenjar dada, radang urat darah
serata menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepaskan enterotoxins menjadi
makanan sehingga menjadi toksik dengan melepaskan superantigens kedalam aliran darah.
E.coli merupakan bakteri berbentuk batang dengan panjang sekitar 2 mikrometer dan
diameter 0,5 mikrometer. Volume sel E.coli berkisar 0.6-0,7 mikrometer kubik. Bakteri ini
termasuk umumnya hidup pada rentang 20-40 derajat C, optimum pada 37 derajat. Kita
mungkin banyak yang tidak tahu jika diusus besar manusia terkandung sejumlah E.colli yang
berfungsi membusukkan sisa makanan.
Pseudomonas auruginosa adalah aerob obligat yang tumbuh dengan mudah pada
banyak jenis media pembiakan, karena memiliki kebutuhan nutrisi yang sederhana. Medium
paling sederhana untuk pertumbuhannya terdiri dari asetat (untuk karbon) dan ammonium
sulfat (untuk nitrogen). Metabilisme bersifat respirator tetapi dapat tumbuh tanpa O2 bila
tersedia NO3 sebagai akseptor electron kadang-kadang berbau manis seperti anggur yang
dihasilkan aminoasetofenon. Beberapa strain menghemolisis darah. bakteri ini pada dasarnya
merugikan bagi pertanian, Bakteri ini juga memiliki karakteristik antara lain berwarna hijau
kebiru-biruan serta berbentuk batang.
1.2. MAKSUD DAN TUJUAN
MAKSUD
Maksud dari praktikum ini adalah agar mahasiswa :
1. Mengetahui prosedur kerja pewarnaan gram
2. Mengetahui bentuk-bentuk (morfologi) bakteri
3. Mengetahi sifat bakteri berdasarkan pewarnaan gram
TUJUAN
1. Membuat sediaan untuk pewarnaan gram
2. Melakukan proses pewarnaan gram
3. Mengamati morfologi dan sifat bakteri yang terdapat pada sediaan berdasarkan pewarnaan
gram

BAB II
TINJAUN PUSTAKA
Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorbsi
atau pun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk

mewarnai mikroorganisme karena zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga
kontras mikroorganisme dengan lingkungannya ditingkatkan.
Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan diferensial yang bayak digunakan dalam
laboratorium mikrobiologi guna pencarian dan identifiknsi bakteri. Pewarnaan gram
memilahkan bakteri menjadi kelompok Gram positif dam Gram negatif. Bakteri Gram positif
berwarna ungu karena bakteri tersebut mengikat kompleks zat warna kristal ungu-iodium,
sedangkan bakteri Gram negntif berwnrna merah karena mengikat zat warna sekunder yang
berwarna merah. Perbedaan hasil dalam pewarnaan ini disebabkan perbedaan struktur
dinding sel bakteri dan perbedaan kandungan asam ribonukleat antnara bakteri Gram positif
dan Gram negatif.
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokos, dan spirilum. Bakteri
yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil
pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi
monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplokokus, sampai sthapylococcus
(bentukknya mirip buah anggur). Khusus pada spiral hanya di bagi dua yaitu setengah
melengkung dan tidak melengkung. Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan
gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri
gram negative ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah
(textbook, 2008). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya
dapat di identifikasi dengan mudah, selain itu, ada endospora adalah organism yang dibentuk
dalam kondisi yang stress karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap
berlanjut dilingkungan sampai kondisi menjadi baik (ncbi, 2008).
Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan
kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negative sehingga diperlukan
adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalanya mekanisme pewarnaan gram.
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting
dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri
yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan
yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna
safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark
Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk

membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumonia. Dengan metode

pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif
(berwarna ungu/biru) dan bakteri Gram negatif (berwarna merah).
Perbedaan dua kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel menahan
(mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi oleh alkohol. Bakteri
gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet
dan pada tahap akhir pengecatan tidak terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami
dekolorisasi oleh alkohol dan pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh
safranin.
Menurut Pelzar et al (2005), macam-macam pewarnaan antara lain pewarnaan
sederhana yaitu dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis yang
sudah di fiksasi. Pewarnaan differentsial yaitu prosedur pewarnaan yang menampilkan
perbedaan diantara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba dari pewarnaan gram
adalah teknik pewarnaan differensial digunakan untuk bakteri.
Menurut Pratiwi (2009), stain merupakan gram-gram yang tersusun atas ion positif dan
negative, yang salah satunya berwarna dan disebut kromofor (chromofor). Pewarnaan pada
dasarnya adalah prosdur mewarnai mikroorganisme dengan menggunakan zat warna yang
dapat menonjolkan strktur tertentu dari mikroorganisme yang ingin kita amati. Bakteri gram
positif akan mempertahankan zat warna krisktal violet dan karenanya akan tampak bewarna
ungu tua dibawah mikroskop. Adapun bakteri gram negates akan kehilangan zat Kristal violet
setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat
warna air tochsin atau safranin akan tampak merah. Perbedaan warna ini disebabkan olh
perbedaan struktur kimiawi dinding selnya.(wapedia,2010)
Adakala suatu perlu diwarnai dua kali setelah zat warna yang pertama (ungu) terserap,
maka sediaan dicuci dengan alkohol, kemudian ditumpangi dengan zat warna yang berlainan,
yaitu dngan zat warna merah. Jika sediaan itu kemudian kita cuci dengan air lau dengan
alkohol maka dua kemungkinan dapat terjadi. Pertama, zat tambahan terhapus, sehingga yang
tampak ialah zat warna asli (ungu). Dalam hal ini sediaan (bakteri) kita sebut gram positif.
Kedua zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli tidak tampak. Dalam hal
ini sediaan (bakteri) jika kita katakana gram negatif (Dwioseputro, 1984)

Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

1) Zat warna utama (violet kristal)
Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.
2) Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk
3)

melunturkan zat warna utama.

Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang
telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi 2 kelompok, salah satu
di antaranya, bakteri gram positif yang mempertahankan zat warna ungu Kristal dan
karenanya tampak ungu tua. Kelompok yang lain, bakteri gram negatif, kehilangan ungu
Kristal ketika dicucci dengan alkohol dan waktu diberi pewarna tandingan dengan warna
merah safranin, tampak bewarna merah (Zubaidah,2006).
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil
ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji
pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu,
yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.
Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka.
Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu
muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah
didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung
protein dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding
selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan
terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin
masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif
sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol,
pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna
safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi

suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan
bakteri Gram negatif yaitu:
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

Dinding
selnya
mengandung
lemak
lebih
banyak

(11-22%),

peptidoglikan terdapat didalam

lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak
mengandung asam tekoat.
Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
Peka terhadap streptomisin
Toksin yang dibentuk Endotoksin
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai

lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung
asam tekoat.

Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
Tidak peka terhadap streptomisin
BAB III
ALAT BAHAN DAN METODE KERJA
III.1 ALAT

1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)

Objek glass
Pipet tetes
Bunsen + korek api
Ose
Botol semprot
Bak pewarnaan
Mikroskop
III.2 BAHAN

1)
2)
3)
4)
5)
6)

CGV (Carbol Gentian Violet)

Lugol
Air Fuchsin
Oil emercy
NaCl 0,1 %
Aquades
III.3 SAMPEL
Biakan bakteri
III.4 METODE KERJA

1)

Sediakan objek glass yang bebas dari lemak dengan jalan dilewatkan diatas api

2)

Bunsen/spiritus 2-3 kali

Pijarkan ose dan ambil bakteri dari media, diletakkan diatas objek glass yan telah ditetesi
NaCl, di ratakan dengan putaran satu arah (melingkar/searah jarum jam)

3) Sediaan dikeringkan di udara

4) Setelah kering kemudian di fiksasi dengan jalan di lewatkan di atas lampu spiritus 2-3 kali
5) Sediaan siap untuk diwarnai
6) Sediaan kemudian diletakkan diatas bak pewarnaan
7) Sediaan di cat dengan CGV selama 2 menit
8) Bilas dengan air mengalir
9) Zat warna diganti dengan larutan lugol selama 45 detik
10) Bilas dengan air mengalir
11) Zat warna diganti dengan alkohol 96%
12) Bilas dengan air mengalir
13) Kemudian di cat lagi dengan safranin selama 1 menit
14) Bilas lagi dengan air mengalir
15) Keringkan dan lakukan pemeriksaan di bawah mikroskop dengan pembesaran 100x. Sebelum
melakukan pemeriksaan tambahkan oil emercy pada preparat tadi.

BAB IV
HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN
IV.1 HASIL PENGAMATAN

Ket. Gambar: Ditemukan bakteri gram positif basil dan coccus

IV.2 PEMBAHASAN
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat
kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya,
ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada
tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu
bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat
tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh
karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak
mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan
asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia.
Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak)
di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel
terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode
pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.

Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

Zat warna utama (C.Gention Violet)

Lugol(zat Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama
memperkuat reaksi

Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan
untuk melunturkan zat warna utama.

Zat warna kedua / cat penutup (air fuksin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel
yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alcohol.
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil

ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna
metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada
uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu,
yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.
Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu

1. Pemberian cat warna utama (C.Gention Violet) berwarna ungu.
2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan Lugo
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna air fuksin
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding
selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma
organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram
negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif
memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan
bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu
determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram
positif dan bakteri Gram negatif yaitu:
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat

didalam

lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak
mengandung asam tekoat.

Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.

Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat

Peka terhadap streptomisin

Toksin yang dibentuk Endotoksin

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.

Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang
sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan.
Mengandung asam tekoat.

Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut

Tidak peka terhadap streptomisin

Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
V.1 KESIMPULAN
Berdasarkan pengamatan yang di bawah mikroskop, maka dapat disimpulkan bahwa
pada sampel tersebut ditemukan bakteri berbentuk coccus dengan latar belakang hitam.
V.2 SARAN
Adapun sehubungan dengan praktikum ini, khususnya ditujukan bagi mahasiswa
yaitu:
1.

Diharapkan bagi seluruh mahasiswa agar selama kegiatan praktikum ini berlangsung,

Mahasiswa harus menggunakan APD (Alat Pelindung Diri).

2. Diharapkan pula bagi semua mahasiswa, bahwa selama kegiatan praktikum ini berlangsung,
agar semua mahasiswa bersungguh-sungguh dalam melakukan praktikum.

DAFTAR PUSTAKA
Suriawira,U.1985. Mikrobiologi dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.
Volk, W.A. dan Margareth. F. W.1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga.
Presscott. Lansing M. John P. Harley, Donald A klein.1993. Microbiology 2nd Edition USA :
WMC Brown Publisher.