ANLISIS BACTERIOLGICO DE AGUAS RESIDUALES RIVERA DEL RIO

TOROCOCHA
EJECUTORES:
CALLA PAMPA, Tania, CONDORI CHAMBI, Eliana, GUTIRREZ SALAS Edith Nlida. MOLINA COAQUIRA Yelka, TORRES VEGA,
Alex Fabricio, TORRES MAMANI, Marco, VIZCARRA HUANCAPAZA, Agustn

RESUMEN:
La prctica tuvo como escenario el laboratorio de la
Universidad Andina Nstor Cceres Velsquez Juliaca,
cuyo objetivo general es Determinar la presencia de
microorganismos aerobios o coliformes totales y fecales en
aguas residuales muestra tomada en el punto N 3 (Buzn de
Desage) a riveras del Rio Torococha, para llevar a cabo este
anlisis empleamos las tcnicas del nmero ms probable
(NMP) o tubos mltiples de fermentacin y las respectivas
normas establecidas, del cual obtuvimos como resultado la no
existencia de coliformes totales y fecales en el punto de la
muestra tomada.
Empleando para ello los siguientes materiales: Matraz
Erlenmeyer de 250 ml, Pipetas de 5 ml, Bureta de 100 ml,
tubos de ensayo, tubos durjan. El trabajo fue desarrollado en
4 fases, iniciando con la esterilizacin de los materiales y los
equipos a emplear, aplicando para ello las normas de
bioseguridad tomamos la toma de muestra en el punto N 03
(Buzn de Desage) ubicada a la rivera del Rio Torococha,
para luego realizar los respectivos anlisis bacteriolgicos en
3
pruebas:
Pruebas
Presuntiva,
confirmativa,
complementaria, esta ultima no la realizamos debido a que
en las 2 fases anteriores obtuvimos como resultado la no
presencia de coliformes.

PALABRAS CLAVE: Microorganismos,

agua,
coliformes totales, coliformes termotolerantes,
bioseguridad,

I)

ABSTRACT
The practice took place at the laboratory of the Universidad
Andina "Nestor Caceres Velasquez" - Juliaca, whose overall
objective is to determine the presence of aerobic
microorganisms and total and fecal coliforms in wastewater
sample taken at point No. 3 (Box Drain) to banks of the Rio
Torococha to carry out this analysis we use the techniques of
most Probable Number (MPN) or multiple tube fermentation
and the respective standards, which we obtained as a result
of the absence of total and fecal coliforms at the point of the
sample taken.
Employing the following materials: 250 ml Erlenmeyer
flask, 5 ml pipettes, 100 ml burette, test tubes, pipes Durjan.
The work was developed in 4 phases, starting with the
sterilization of materials and equipment to be used, applying
the standards of biosecurity take the sample at point No. 03
(Box Drain) located on the banks of the Rio Torococha, then
perform the respective bacteriological analysis in 3 tests:
presumptive, confirmatory, complementary, the latter did not
perform because in the previous 2 phases obtained as a result
the non-presence of coliforms.

KEY WORDS:
organisms, water, total coliforms, thermotolerant,
lactose broth and lauryl sulfate broth.

INTRODUCCIN

La contaminacin existente en el Rio Torococha la misma que esta ubicada en la ciudad de Juliaca,
que en sus inicios pues era un rio lleno de vida y no como lo vemos actualmente un rio muerto, totalmente
contaminando con residuos solidos, orgnicos y otros, lo cual causa un gran problema social, ya que genera
malestares a la poblacin juliaquea, ms que todo a los moradores o vecinos que viven en sus riveras.
Creemos que esos pobladores se han acostumbrado a vivir y son parte de esta contaminacin, esto lo
decimos por que durante el trabajo de campo observamos que estos usan las riveras del rio como letrina as
como tambin desechan sus residuos solidos en ella, esta problemtica pues pareciera no importar a nadie ya
que ni las autoridades toman cartas sobre el asunto. Sabemos tambin que la disposicin no controlada de
estos residuos puede crear problemas tales como contaminacin de aguas subterrneas, contaminacin
atmosfrica y diversas enfermedades.
En los ltimos aos se han desarrollado nuevas tcnicas basadas en la utilizacin de medios de
cultivo que eleva la sensibilidad y la rapidez de deteccin de los microrganismos en agua. La deteccin y
cuantificacin de coliformes totales y E. coli como microrganismos indicadores de contaminacin fecal tiene
gran importancia en el control microbiolgico de la calidad sanitaria de las aguas. Es anlisis bacteriolgico de
las aguas es llevado a cabo por el mtodo del numero ms probable o tubos mltiples de fermentacin, todo
ello basado en la capacidad que tiene los microrganismos coliformes de producir cido y gas a partir de la
1

lactosa, empleando para la deteccin directa de estos microrganismos medios de cultivo, los cuales
contienen sustratos que son utilizados por enzimas especificas del grupo coliformes y E.coli respectivamente.
Este mtodo es altamente especfico y senible, adems de brindar la posibilidad de ofrecer los resultados en
solo 24h. Por ello el presente trabajo tiene como objetivo determinar la presencia de microrganismos aerobios
o coliformes totales y fecales en aguas residuales en el punto N 3 (Buzn de Desage) en rivera del rio
torococha mediante la tcnica de tubos mltiples de fermentacin utilizando como medio de cultivo (Caldo
lauril sulfato, Caldo Bilis Verde Brillante y caldo EC) en aguas contaminadas.
Los coliformes son una familia de bacterias que se encuentran comnmente en las plantas, el suelo y
los animales, incluyendo a los humanos. El grupo de bacterias coliformes incluye a las aerbicas y a las
anaerbicas facultativas, bacilos Gram negativos no esporulados que fermentan la lactosa con formacin de
gas despus de 48hr de incubacin a 37C. La presencia de bacterias coliformes en el suministro de agua es
un indicio de que el suministro de agua puede estar contaminado con aguas negras u otro tipo de desechos
en descomposicin.
Generalmente, las bacterias coliformes se encuentran en mayor abundancia en la capa superficial del agua o
en los sedimentos del fondo. Los coliformes fecales, que se encuentran en los intestinos de los humanos y
otros animales de sangre caliente, son un tipo de bacterias coliformes. Se pueden hacer pruebas
especficamente para coliformes fecales o para el total de bacterias coliformes que incluye todos los tipos de
bacterias coliformes y que puede indicar contaminacin fecal. Los niveles recomendados de bacterias
coliformes fecales segn las normas establecidas por los Estndares de Calidad Ambiental son:
o Agua Potable: menos de 0 colonias por 100 ml de la muestra de agua
o Natacin: menos de 200 colonias por 100 ml de la muestra de agua
o Navegar/Pescar: menos de 1,000 colonias por 100 ml de la muestra de agua

II)

OBJETIVOS
Objetivo General
Determinar la presencia de microrganismos aerobios o coliformes totales y fecales en aguas
residuales en el punto N 3 (Buzn de Desage) a rivera del rio torococha, mediante el mtodo
del nmero ms probable o tubos mltiples de fermentacin.
Objetivos Especficos.
Determinar la cantidad de microrganismos coliformes totales, fecales y Escherichia coli
presentes en el agua residual del punto N 3 (Buzn de Desage) a rivera del rio
Torococha a travs del mtodo del numero ms probable o tubos mltiples de
fermentacin.
Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes
fecales.
Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua mediante la bsqueda de
microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli.
Organizar e interpretar los resultados.

III) MATERIALES:
EQUIPOS:
Autoclave
Horno
Balanza
MATERIALES:

Matraz
Pipeta
Tubos de ensayo
Pipetas bacteriolgicas para distribuir 10 ml, con tapn de algodn. Las pipetas
pueden ser graduadas en volmenes iguales a una dcima de su volumen total.
Frascos de vidrio de 250 ml con tapn de rosca.
Tubos de cultivo 20 x 200 mm y de 16 x 160 mm con tapones metlicos o de rosca.
Campanas de fermentacin (tubos de Durham).
Pipetas bacteriolgicas graduadas de 10 y 1 ml.
Gradillas
Asa de platino

REACTIVOS:

IV)

Caldo lauril sulfato

Caldo verde bilis brillante
Caldo EC
Agar Mc

METODOLOGA
1. EQUIPO DE SEGURIDAD PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO
As como se deben de contar con normas de seguridad e higiene en un laboratorio, de igual manera
se debe de contar con un equipo de seguridad para el trabajo, a continuacin mencionamos algunos
elementos indispensables para la seguridad en el laboratorio:
Mandil manga larga, con botones o broches de presin. Se recomienda que sea
blanca.
Barbijo, protector facial transparente de 20 cm. de largo.
Guantes de ltex para manejar cidos dbiles y cetonas.
Guantes de PVC para manejar cidos y bases dbiles.
Gorras
2. MATERIALES MICROBIOLGICOS Y SU ESTERILIZACIN
Fundamento
Se define como esterilizacin al proceso que se lleva a cabo para la eliminacin o muerte de todos
los microrganismos que contiene un objeto o sustancia, y que se encuentran acondicionados de tal
forma que no pueden contaminarse nuevamente, para llevar a cabo esta accin existen distintos
procesos o mtodos; a continuacin se mencionamos el mtodo empleado por el grupo.

Al aplicar a un determinado material vapor de agua a una presin de 15 lb (121C) por un tiempo de
15 minutos, se produce la destruccin total de los
microrganismos viables presentes en el mismo.
Esterilizacin por vapor
La esterilizacin por vapor a presin se lleva a cabo en una
autoclave. Estos equipos emplean vapor de agua saturado, a
una presin de 15 libras lo que esterilizacin usualmente es de
15 minutos a 121C, sin embargo, en algunas oportunidades,
dadas las caractersticas del material, es necesario variar el
tiempo de esterilizacin.
Foto 1. Auto clave, con materiales a esterilizar

Equipo:
Autoclave
Materiales a esterilizar:

Matraces Erlenmeyer
Tubos de ensayo
Pipetas
Placas petri de vidrio
Campanas durham
Bureta
Frascos para toma de muestra

Foto2. Material esterilizado

SUSTANCIAS:
Caldo nutritivo lauril sulfato
Composicin:
Cloruro de sodio (5g). Lauril sulfato de sodio (0.10g). Fosfato dipotsico (2.75g).
4Metilumbeliferil--D-glucornido (0.05g). Fosfato monopotsico (2.75g). Lactosa (5g). Peptona de
casena (20g). pH 6.8 0.2

 Caldo nutritivo verde brillante bilis

Bilis de buey deshidratada (20g). Peptona especial (10g). Lactosa (10g). L-Triptfano (1g).
4-Metilumbeliferil--D-glucornido (0.1g). Verde brillante (0.0133g). pH 7.2 0.2

Caldo nutritivo EC
Cloruro de sodio (5g). 4-Metilumbeliferil--D-glucornido (0.05g). Fosfato dipotsico (2.75g).
Peptona biotriptasa (20g). Fosfato monopotsico. (2.75g). Lactosa. (5g). Sales biliares (1.5g). pH 6.9
0.2

Medio Agar de Mac Conkey

Composicin: Peptona de casena (17g), peptona de carne (3g), lactosa (10g), mezcla de
sales biliares(1.5g), NaCl (5g), rojo neutro (0.03g), cristal violeta (0.001g), agar-agar (13.5g).
*pH (37C) = 7.1 0.1
Procedimiento y resultados:
Caldo nutritivo lauril sulfato
Rehidratar 35.65 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar
agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante 1 minuto para disolverlo por completo.
Distribuir en tubos de ensayo con campana de Durham, en volumen de 10 ml para muestras de 1 ml o
menos. Esterilizar en autoclave a 121C (15 lbs de presin) durante 15 minutos. Conservar antes de
utilizar, verificar que en la campana no existan burbujas de aire
Caldo nutritivo verde brillante bilis
Rehidratar 41.1 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar
agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante 1 minuto para disolverlo por completo.
Distribuir en tubos de ensayo con campana de Durham. Esterilizar en autoclave a 121C (15 lbs de
presin) durante 15 minutos. Conservar antes de utilizar, verificar que en la campana no existan burbujas
de aire
Caldo nutritivo EC
Rehidratar 37 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar
agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante 1 minuto para disolverlo por completo.
Distribuir en tubos de ensayo o frascos con campana de Durham. Esterilizar en autoclave a 121C (15 lbs
de presin) durante 15 minutos. Conservar antes de utilizar, verificar que en la campana no existan
burbujas de aire
5

 Medio Agar de Mac Conkey

Rehidratar 50.1 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar
agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante 1 minuto para disolverlo por completo.
Esterilizar en autoclave a 121C (15 lbs de presin) durante 15 minutos. Enfriar aproximadamente a
45C. Vaciar en cajas de Petri estriles.
3. TCNICAS Y MTODOS DE TOMA DE MUESTRA
Se debe de tomar en cuenta que los resultados de los anlisis dependen en gran medida de
la buena toma de muestras, esta puede ser manual, es decir tomada por una persona o automtica,
tomada por una maquina programada. Las tcnicas de muestreo varan dependiendo del lugar de
donde se va a extraer la muestra:
Cuando se toma una muestra de un pozo se debe de enjuagar el envase con el agua del
pozo 3 veces y se debe de dejar un espacio entre la muestra y la tapa del envase.
En pozos, se prende la bomba se deja trabajar, se apaga y se toma la muestra. En ros, se
toma la muestra de la parte media de estos, lo mismo se realiza en el caso de lagos y
lagunas.
De la llave, (de tuberas) se deja caer el agua unos segundos y se toma la muestra.
PARA ANLISIS MICROBIOLGICO
Deben ser Frascos de vidrio con tapn esmerilado, frascos estriles desechables o bolsas estriles
con cierre hermtico y capacidad de 125 o 250mL.
ROTULADO
Para la identificacin de las muestras deben etiquetarse los frascos y envases con la siguiente
informacin:
Nmero de control para identificar la muestra, independientemente del nmero de registro
del laboratorio.
Fecha y hora de muestreo.
REGISTRO
Para el control de la muestra debe llevarse un registro en formato establecido previamente con los
datos anotados en la etiqueta del frasco o envase, as como la siguiente informacin:

Identificacin del punto o sitio de muestreo.

Temperatura del agua.
pH.
Cloro residual libre.
Tipo de anlisis a efectuar.
En su caso, reactivo empleado para la preservacin.
Nombre de la persona que realiz el muestreo.

Los sellos de los envases deben de ser de plstico o adheribles. El muestreador debe de contar con
una bitcora, que contenga los datos de las etiquetas.

Cuando se reciben las muestras en el laboratorio, estas deben de ser registradas, indicando el tipo
de anlisis que se va a llevar a cabo, y se designa el lugar de almacenamiento, ya sea en un
refrigerador a 4C o en un almacn.

Foto: Punto n 3 buzn de desage toma de muestra

Foto. Muestra del agua residual - rotulada

4. METODOLOGA PARA EL PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

A continuacin indicamos las tcnicas bacteriolgicas que se utilizaron en la determinacin de
coliformes totales y fecales en las muestras de aguas residuales tomadas en el punto n 3 buzn de
desage
FUNDAMENTO:
La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del Nmero ms Probable
(NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con
produccin de cido y gas al incubarlos a 35C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que
contenga sales biliares. Esta determinacin consta de tres fases, la fase presuntiva, fase confirmativa
y la fase complementaria.
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato el cual permite la
recuperacin de los microorganismos daados que se encuentren presentes en la muestra y que
sean capaces de utilizar a la lactosa como nutriente. Durante la fase confirmativa se emplea como
medio de cultivo caldo verde brillante bilis y el caldo EC el cual es selectivo y solo permite el
desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar las sales biliares.
La determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir
de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para
fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 C por un
periodo de 24 a 48 h.
Finalmente, la bsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los
cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey) y
posteriormente realizando tincin de gram.
MTODO DEL NMERO MS PROBABLE O TUBOS MLTIPLES:
El mtodo se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 37C durante
24 a 48 horas, resultando una produccin de cidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de
fermentacin.

PROCEDIMIENTO;

10ml

10ml

10ml

10ml

10ml

10ml

10ml

MUESTRA

90 ml de h2o
destilada

1ml

1ml

10-1

10-2

1ml

10-3

1ml

1ml

1ml

10-4

10-5

10-6

1ml

10-7

Caldo verde brillante

bilis al horno por 24
horas a 37C
10-1

10-2

Caldo EC en bao
mara por 24 horas a
44,5 C

10-1

10-2

 Prueba Presuntiva:
1. Con los materiales esterilizados y la respectiva
toma de muestra con las precauciones
correspondientes, procedemos a realizar la
primera fase del anlisis bacteriolgico.

4. Finalmente se coloco en la incubadora de

marca Digisystem Laboratory a o 37 C por el
tiempo de 48 horas.

Foto2. Material esterilizado

Prueba Confirmativa:
Foto. Material esterilizado listo para el cultivo
con el caldo lauril sulfato

2. Para preparar las diluciones se esterilizo 8

matraces con 90 ml de agua destilada y 10-7
tubos con el caldo Lauril sulfato como medio de
cultivo, procedimos al cultivo con la muestra del
agua problema

Foto2. Preparando con el medio de cultivo lauril sulfato

3. Seguidamente se procedi a preparar 21 tubos

con 9 ml de agua destilada esterilizada y
aadindole 1 ml de la muestra a cada tubo
etiquetndolo con (10-1) y (10-2) y as
sucesivamente hasta (10-7), cada tubo contiene
tubos durhan invertidos.

Foto2. Tubos

Caldo verde brillante bilis

1. Se observo las muestras de la prueba
presuntiva, de los cuales uno de los tubos (10-1)
se muestra de color lechoso, se presume la
presencia de coliformes.

Foto:

2. En 6 tubos con 9 ml de medio de cultivo caldo

verde brillante bilis con los respectivos tubos
durham invertidos, procedimos a tomar la
muestra de los resultados de la fase presuntiva
esto se realizo con el aza de colli esterilizado el
en mechero

Foto2. Material esterilizado

3. Finalmente se coloco en la incubadora de

Digisystem Laboratory a 37C por el tiempo
de 24 horas obteniendo del cual negativos
en todos.

2. Finalmente se llevo a bao mara a una T 44,5C

por el tiempo de 24 horas obteniendo como
resultado negativo en todos.

Foto2. Material esterilizado

Foto2. Material esterilizado

Caldo EC
1. En 6 tubos con 9 ml de medio de cultivo caldo EC
con los respectivos tubos durham invertidos,
procedimos a tomar la muestra de los resultados
de la fase presuntiva esto se realizo con el aza de
colli esterilizado el en mechero.

Foto2. Material esterilizado

V)

RESULTADOS

Los resultados que obtuvimos negativos tanto en la determinacin de coliformes totales como fecales:
Prueba presuntiva:
En el primer grupo de 3 tubos 10-1 aparecido un viraje del color debido a la produccin de cido y en la
campana Durhan puede apreciarse con gas en su interior, pero en el resto del grupo todos negativos.
Los resultados son positivos en 1 de los 7 primeros grupos de tubos; con estos datos vamos a las tablas
del nmero ms probable (NMP) y tenemos: 4 M.P.N. por cada mL de agua problema. Como sta
prueba ha sido positiva, realizaremos las pruebas confirmativas, de haber resultado negativas las
primeras, damos por terminado el anlisis.

10

Prueba confirmativa:
La siembra en los 7 tubos de ensayo con verde brillante bilis. Tras la incubacin a 37 C y con el caldo
EC en bao mara por 48 horas a una temperatura de 44,5C, en estas pruebas los resultados obtenidos
fue negativo
No se present formacin de colonias en nuestra muestra por lo tanto:
<10UFC/g. Estimada
VI) DISCUSIONES

VII) CONCLUSIONES

En esta prctica concluimos que

Aprendimos a determinar los coliformes totales, fecales y Escherichia coli por el mtodo del
nmero ms probable.

De haber encontrado muestras de E. coli, nos hubiera indicado la presencia de

contaminacin fecal,

Se evalu muestras de agua residual mediante la bsqueda de microorganismos

coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli.

Se diferenciaron los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes

fecales.

VIII) BIBLIOGRAFA

ROMERO ROJAS, J. 2009.Calidad del Agua. 3era edicin. Editorial Escuela Colombiana de
Ingeniera. Colombia 485 p.
http://www.revistaciencias.com/publicaciones/EpZyyEpuAZFmLJrXEl.php
http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/Tecnic-Basicas-Coliformes-en-placa_6528.pdf
http:// tierra.rediris.es/hidrored/ebooks/ripda/.../capitulo20. Fecha de bsqueda 15.07.2012
http:// www.saludyriesgos.com/-/Coliformes+totales. Fecha de bsqueda 15.07.2012
http:// es.wikipedia.org/wiki/Coliforme. Fecha de bsqueda 15.07.2012
http:// avdiaz.files.wordpress.com/2010/02/presentacion-clase-4.pdf Fecha de bsqueda 15.07.2012
http:// www.mcd.com.mx/pdfs/caldo_lactosado.pdf Fecha de bsqueda 15.07.2012

11