v.

Un resumen del artculo asignado, haciendo nfasis en la aplicacin que se dio a la

tcnica molecular estudiada, indicando cuales son los principales resultados obtenidos
TaqMan PCR para la deteccin de Vibrio cholerae O1, O139, no O1 y no O139 en
cultivos puros, ostras crudas, y agua de mar sinttica
Vibrio cholerae es un patgeno transmitidas por el agua que provoca trastornos
gastrointestinales, con una amplia gama de manifestaciones clnicas, incluyendo vmitos y
diarrea como agua de arroz . Esta enfermedad se asocia por el consumo de ostras crudas,
agua de mar y otros mariscos. Las zonas costeras con aguas salobres y regiones estuarinas
son nichos para muchas especies de Vibrio, incluyendo cepas de toxignico O1 V. cholerae.
Las cepas de clera epidmico son endmicas en varias regiones, incluyendo la costa del
golfo de Estados Unidos y Australia, las Pruebas de diagnstico tradicional para Vibrio no
siempre es fiable, ya que esta bacteria puede entrar en un estado viable pero no cultivable.
Esto puede explicar el fracaso de las tcnicas de cultivo tradicionales para aislar este
organismo a partir de muestras de agua y alimentos contaminados implicados en brotes de
origen alimentario. Los investigadores han desarrollado tcnicas de PCR y sondas de ADN
para la deteccin de especies patgenas de Vibrio, pero son no cuantitativos en su
deteccin de V. clulas cholerae La presencia de productos de PCR tambin debe ser
verificada mediante procedimientos posteriores tales como electroforesis en gel y sur de la
hibridacin.
En este trabajo se describe el desarrollo y evaluacin de un sistema de imprimacin y
sonda que es rpida, sensible y cuantitativo para V. clulas cholerae en cultivos puros,
agua de mar y ostras crudas. Los cebadores y la sonda se dirigen hacia el especfico no
clsica Hly Un gen de V. cholerae O1, O139, no-O1 y no-O139. Este conjunto de
cebadores-sonda puede utilizarse en la cuantificacin de V. cholerae en la presencia de
otras especies de Vibrio contaminantes. Un sistema de imprimacin TaqMan y la sonda
que es una herramienta de diagnstico rpido para la presencia de V. cholerae en ostras y
agua de mar eliminara la necesidad de aislamiento y caracterizacin por mtodos
microbiolgicos clsicos.
La sonda TaqMan y el cebador conjunto desarrollado en este estudio se puede utilizar
como una herramienta de diagnstico rpido para la presencia de V. cholerae en las ostras
y el agua de mar sin aislamiento previo y caracterizacin de las bacterias mediante
mtodos microbiolgicos tradicionales. El ensayo TaqMan utiliza la actividad 5'exonucleasa de la ADN polimerasa de Thermus aquaticus para hidrolizar una sonda
TaqMan interno marcado con un colorante fluorescente informador (FAM-6carbooxyfluorescein) y un colorante extintor (TAMRA-6-carboxi-N, N, N ', N' tetrametilrodamina). La sonda est diseada para hibridar con la secuencia de ADN entre
los cebadores de PCR. Durante la amplificacin por PCR, la escisin de la sonda TaqMan
separa el colorante indicador y el extintor de colorante, lo que resulta en un aumento de la
fluorescencia. En contraste, cuando la sonda est intacta, la proximidad del colorante
informador al colorante extintor en el bloqueo de la fluorescencia reportero. TaqMan PCR
elimina la necesidad de verificacin de los productos PCR posterior que es requerida por
otras amplificaciones por PCR, reduciendo as la cantidad de tiempo necesario para el
anlisis de la muestra. Y en otros ensayos TaqMan PCR tambin son deseables para el
anlisis rpido de los alimentos que se consumen en bruto sin transformar. Mtodos
rpidos que pueden abordar rpidamente la presencia de Vibrio en los productos frescos y
crudos como ostras sera beneficioso en la eliminacin de la liberacin de los productos
contaminados en el mercado, lo que podra dar lugar a brotes de origen alimentario
potenciales.

En el presente estudio, un sistema TaqMan PCR fue construido y aplicado para detectar y
cuantificar especficamente V. cepas cholerae. Sin embargo, la necesidad de una sonda

especfica que se dirige a toda V.especies cholerae seran valiosos debido a la variacin
entre los distintos V. serotipos cholerae. Por ejemplo, los genes ctx se expresan en algunos
de los serotipos de V. cholerae O1 / O139 y algunas cepas de no-O1 / O139, pero en
absoluto en otras cepas no-O1 / O139 ( 10 , 27 , 47 ). Por lo tanto, parece que los genes de
virulencia(ctx, zot, y ace) seran inadecuados para el diseo de cebadores y sondas para la
deteccin de V. cepascholerae. La regin de la secuencia de la no clsica Hly Una regin
(70 pb) en V. cholerae es especfico para este organismo y no otras especies de Vibrio o
otros gneros bacterianos. La regin de destino de 70 pb en la no clsica Hly Una regin se
compar con las secuencias ms recientemente publicada en el Centro Nacional para la
base de datos de Informacin Biotecnolgica (BLAST N, P, BLAST y BLAST X), y no hay
secuencias de protenas homlogas se encontraron dentro de esta regin , con la excepcin
de la subunidad estructural de los pili de E. longus coli, que tena menos de 38% de
homologa. Esta regin de la Un gen Hly no se incluy en el diseo de los cebadores y la
sonda. La especificidad de los cebadores y la sonda construidos se prob tanto por
bsquedas de homologa de bases de datos de protenas y nucletidos y mediante el cribado
de una serie de V.cholerae cepas aisladas de pacientes, ostras, mariscos, y el agua de varias
partes del mundo. No hay falsos positivos se registraron entre las 61 especies de bacterias
pertenecientes a otros gneros, y sin falsos positivos se registraron entre las otras cepas de
Vibrio probados, lo que demuestra la alta especificidad del conjunto diseado imprimacinsonda para V. cepas cholerae (Tablas (Tables11 y 2y2 ).
Debido PCR opera con una eficiencia constante, es muy adecuado para mediciones
cuantitativas. Los lmites de deteccin del ensayo de PCR se estimaron en
aproximadamente 10 CFU ml -1 en agua de mar sinttica y de 6 a 8 UFC ml

-1

en las

ostras. Estos lmites reportados de deteccin son similares a los de otros informes obtenidos
con

un

ensayo

TaqMan

PCR

para

la

deteccin

de

punto

final

( 5 , 9 , 30 , 31 , 45 ). Para Listeria monocytogenes, Bassler et al. ( 5 ) y Nogva et al. ( 30 )

obtuvieron niveles de deteccin de aproximadamente 50 CFU ml -1 y 6 UFC ml1,

respectivamente. Chen et al. ( 9 ) y Vishnubhatla et al. ( 45 ) mostr un lmite de

deteccin tan bajo como 2 UFC ml-1 de un cultivo puro de Salmonella enterica serovar
Typhimurium y 9,4 UFC ml-1 de Yersinia enterocolitica en carne molida de cerdo pinchos,
respectivamente.
Nuestros datos indican una buena correlacin entre los recuentos de UFC y el ensayo
TaqMan para V. choleraeincuba en agua de mar sinttica a 5 C (Fig. (Figura 2B2 B y la
Tabla Tabla 5).5 ). Estos resultados estn de acuerdo con los experimentos anteriores en los
que las clulas de Vibrio (es decir, las clulas VBNC) fueron recuperados de mariscos
refrigerados por incubacin en S a 5 C ( 10 , 27 , 47 ). Despus de 7 das, hubo una
reduccin del 7-log en los recuentos viables directos y recuentos de placas
de V. cholerae O1 y O139 (Tabla (Tabla 5).5 ). Estos datos indican que chapado tradicional
puede

resultar

en

subestimacin

del

nmero

de V. potencialmente

infecciosocholerae clulas presentes en las muestras almacenadas en refrigeracin. En

contraste, las clulas VBNC son detectables mediante el uso de la TaqMan PCR
(Tabla (Tabla 55 ).

Tambin es importante conocer la historia del producto alimenticio antes del anlisis. Los
productos tales como ostras crudas almacenadas en hielo pueden contener un gran nmero
de celdas fras inducidos por el estrs VBNC Vibrio. La historia del producto alimenticio es
especialmente importante si el producto se trat de calor o se someti a un proceso que
podra causar la muerte celular del organismo objetivo. Nogva et al. ( 30 ) encontraron que
el uso de DNasa en la muestra antes del aislamiento del ADN parece reducir la cantidad de
cido nucleico aislado de bacterias muertas. En este estudio, parece que el aspecto de la
vida frente a las clulas muertas era importante, porque las clulas de Vibrio aisladas a
partir de ostras con pas parecen contener tanto las clulas viables y muertas. El
tratamiento con ADNasa antes de ADN aislamiento result en una reduccin de 1-log en los
recuentos de clulas y, posteriormente, result en la eliminacin de ADN de las clulas
muertas de Vibrio (Tabla (Tabla44 ).
El uso de la PCR TaqMan es un mtodo sensible y cuantitativo que es til para estimar el
nmero

de

clulas

de

un

patgeno

especfico

en

un

producto

alimenticio

( 5 , 9 , 30 , 31 , 45 ). La principal ventaja de la PCR TaqMan es que es muy rpido y es un

mtodo valioso para el cribado de un gran nmero de muestras. Mtodos de cultivo
tradicionales requieren enriquecimientos que consumen mucho tiempo y procedimientos de
trabajo intensivo que requieren varios das. Sin embargo, la PCR TaqMan desarrollado en
este estudio requiere slo 3 h. Otros sistemas moleculares para la identificacin
de V. cholerae en los alimentos y el agua, tales como huellas dactilares PCR y
ribotipificacin

( 1 , 41 )

la

deteccin

de

genes

de

virulencia

por

PCR

( 6 , 8 , 28 , 36 , 44 , 46 ; Arya, Letter), requieren pasos adicionales de verificacin que

aumentan el tiempo de anlisis . El valor real de la PCR TaqMan es la posibilidad de un
rpido anlisis de numerosas muestras libres de patgenos, permitiendo de esta manera la
capacidad de los laboratorios de la pantalla rpidamente los productos antes de ser
liberados para el consumo humano. Muestras de alimentos putativos positivos tambin se
pueden identificar con rapidez y sac para su posterior anlisis.
La evolucin futura.
El uso de la tecnologa TaqMan para la cuantificacin de V. cholerae en otros alimentos y
muestras de agua del medio ambiente debe ser factible. Se est trabajando en el desarrollo
de ensayos TaqMan para V. vulnificus y V. parahaemolyticus. Una vez que se desarrollan
estos ensayos de nucleasa, debe ser un procedimiento simple para la deteccin de las tres
especies mediante el uso de una tcnica de enriquecimiento y una muestra de ADN extrado
de clulas bacterianas en la muestra de alimento.