Kromatografi Kolom

I.

Tujuan
I.1. Untuk melakukan dan menjelaskan teknik teknik dasar
kromatografi kolom.
I.2. Dapat menjelaskan prinsip dasar pada kromatografi.
I.3. Dapat melakukan isolasi campurn senyawa sampai pemurniannya
secara kromatografi kolom.

II.

Prinsip
II.1.

Berdasarkan pada perbedaan migrasi dan distribusi

senyawa ion ion tersebut di dalam dua fase yang berbeda, (fase
diam dan fase gerak).
II.2.
Berdasarkan pada affinitas kepolaran analit dengan fase
diam, sedangkan fase gerak selalu memiliki kepolaran yang
berbeda dengan fase diam.
III.

Reaksi -

IV.

Teori Dasar
Tanpa teknik kromatografi, sintesis senyawa murni (atau hampir
murni) akan sangat sukar, dan dalam banyak kasus, hampir tidak
mungkin. Pada umumnya sebelum suatu senyawa diidentifikasi dan
dapat di ukur kadarnya perlu dipisahkan dari matriknya. Oleh karena
itu, pemisahan merupakan langkah penting dalam analisis kualitatif.
Suatu analisis kimia menjadi meragukan jika pengukuran sifat tidak
berhubungan dengan sifat spesifik senyawa terukur. Analisis meliputi
pengambilan cuplikan, pemisahan senyawa pengganggu, isolasi
senyawa yang dimaksudkan, pemekatan terlebih dahulu sebelum
identifikasi dan pengukuran. Terdapat banyak teknik pemisahan tetapi
kromatografi merupakan teknik yang paling banyak di gunakan. Salah
satunya yaitu kromatografi kolom.
Kromatografi kolom bertujuan untuk urifikasi dan isolasi
komponen dari suatu campurannya. Metode pembuatan kolom terbagi
menjadi 2 yaitu untuk metode kering, kolom pertama diisi dengan
kering fase diam bubuk, diikuti dengan pembasahan fase mobile.

Sedangkan, metode basah sevuah bubur disiapkan dari eluent dengan

fase diam bubuk dan kemudian dengan hati hati dituangkan ke dalam
kolom. Lapisan ini biasanya ditutupi dengan lapisan pasir kecil atau
dengan kapas atau wol kaca untuk melindungi bentuk lapisan organik
dari kecepatan baru ditambahkan eluent. Eluent perlahan lahan
melewati kolom untuk memajukan bahan organik.
Kromatografi kolom digolongkan ke dalam kromatografi cair
padat (KCP) kolom terbuk. Kromatografi kolom merupakan teknik
kromatografi yang paling awal yang pertama kali dilakukan oleh
seorang D.T.Navy untuk membedakan komposisi dari suatu minyak
bumi.
Kromatografi kolom adsorpsi termasuk pada cara pemisahan cair
padat. Pemisahan kromatografi kolom adsorpsi didasarkan pada
adsorpsi komponen komponen campuran dengan affinitas berbeda
beda terhadap permukaan fase diam.substrat padat (adsorben)
bertindak sebagai fase diam yang sifatnya tidak arut dalam fase cair.
Fase geraknya adalah cairan (pelarut) yang mengalir membawa
komponen campuran sepanjang kolom.
Pemisahan pada kromatografi

kolom

tergantung

pada

kesteimbangan yang terbentuk pada bidang antar muka di antara

butiran

butiran adsorban dan fase gerak serta kelarutan relatif.

Komponen pada fase gerak, antara molekul molekul kmponen dan

pelarut terjadi adanya suatu kompetisi untuk teradsorpsi pada
permukaan adsorben sehingga menimbulkan suatu proses yang
dinamis.
Pada saat terjadinya adsorpsi komponen dipaksa untuk berpindah
oleh aliran fase gerak yang ditambahkan secara kontinyu. Akibatnya,
hanya komponen yang mempnyai affinitas lebih besar terhadap
adsorben akan secara selektif tertahan. Komponen dengan affinitas
paling kecil akan bergerak lebih cepat untuk mengikuti aliran pelarut.
Pada suatu proses pemisahan kromatografi partisi sangat
miri[ dngan kromatografi kolom adsorpsi. Perbedaan utamanya adalah
terletak pada sifat dari penyerap yang digunakan. Pada kromatografi
kolom partisi penyerapnya berupa materi padatan berpori seperti

kieselguhr, selulosa atau silika gel yang permukaannya dilapisi zat cair
(biasanya air). Dalam hal ini zat padat hanya berperan sebagai
penyangga (penyokong) dan zat cair sebagai fase diamnya.
Dalam kromografi partisi fase geraknya dapat berupa zat cair dn
gas yang mengalir membawa komponen komponen campuran
sepanjang kolom. Jika fase geraknya dari zat cair, akan diperoleh
kromatografi partisi cair cair. Teknik ini banyak digunakan untuk
pemisahan senyawa senywa organik maupun anorganik.
Resin penukar ion adalah suatu bahan padat yang memiliki bagian
(ion positif atau negatif) tertentu yang bisa dilepas dan ditukar dengan
bahan kimia lain dari luar. Berdasarkan jenis ion atau muatan yang
diperlukan resin dapat dibagi menjadi 2 yaitu resin penukar kation
adalah ion positif yang dipertukarkan dan resin penukar anion adalah
ion negatif yang dipertukarkan.
Besarnya nilai kapasitas penukar dari resin penukar ion tergantung
pada jumlah gugus ion yang dapat ditukarkan yang terkandung dalam
setiap gram bahan resin tersebut. Semakin besar jumlah gugus-gugus
tersebut, maka semakin besar pula nilai kapasitas resinnya. Besarnya
nilai kapasitas resin diketahui agar dapat memperkirakan berapa
banyaknya resin yang diperlukan dalam analisa kimia dengan
menggunakan metode kromatografi kolom.
Apabila resin telah mengikat jumlah ion yang sama dengan
kapasitas maksimumnya maka resin tersebut dikatakan telah
exchausted. Dalam keadaan demikian resin dapat dikembalikan ke
keadaan semula dengan jalan menuangkan larutan asam yang agak
pekat ke dalamnya sehingga terjadi reaksi kebalikan dari reaksi
penukaran ion. Resin penukar anion dapat berupa ko-polimer stiren
dan divinil benzen tetapi tidak mengandung gugusan-gugusan amin
yang bersifat basa dengan resin penukar anion terjadi pengubahan
yang jumlahnya ekuivalen
Parameter yang digunakan dalam mengevaluasi kinerja kolom
stelah mengoptimalkan efisiensi pemisahan secraa kromatografi mutu
kromatografi dapat dikendalikan dengan menrepakan uji kesesuaian
sistem tertentu. Salah satu diataranya adalah perhitugan peat teoritis

untuk suatu kolom dan terdapat dua parameter utama lainnya untuk
menilai kinerja.
Pola kecepatan arus elutor pada tiap irisan kolom yang dipilih
harus sama, keseragaman ini dicapai dengan memilih adsorban yang
ukuran butir butirnya sama (diayak) dan dengan cara peryaratan yang
baik. Semakin kecil ukuran butir aadsorban maka semakin cepat
keseimbangan adosorpsi akan dicapai, dan makin besar pula kecepatan
elusi yang dipergunakan.
Apabila kecpatan arus cairan semakin rendah, maka baik akibatnya
bagi tercapainya keseimbangan adsorpsi dan akan semakin baik pula
pada proses pemisahannya. Kecepatan arus yang erlalu rendah dapat
memnimbulkan efek difusi axial dalam fase mobile yang harus
dihindarkan sejauh mungkin.
Sifat adsorben dan pelarut harus memiliki luas permukaan besar
internal. Kecepatan adsorpsi akan semakin bertambah dengan semakin
kecilnya ukuran diameter adsorban. Pemilihan suatu pelarut tergantung
dari sifat kelarutannya, akan tetapi lebih baik untuk memilih suatu
pelarut yang tidak bergantung pada kekuatan elusi sehingga zat zat
elusi yang lebih kuat apat dicoba kekuatan dari zat elusi adalah daya
penyerapan pada penyerap dalam kolom.
Mendeteksi suatu komponen yang dipisahkan melalui krmatografi
kolom yang konvensional tidak dilengkapi detektor, namun dapat
digunakan dengan mengalirkan eluent pada detektor untuk mendeteksi
adanya suatu komponen.
Alat pada kromatografi kolom sederhana, terdiri dari kolom kaca
yang terdapat krannya. Umumnya, panjang kolom minimum 10x
diameter pipa kaca yang digunakan dan labu erlenmeyer sebagai
penampung eluent. Fase diam yang digunakan berupa adsorben yang
tidak larut di dalam fase gerak. Ukuran partikel fase diam harus
seragam. Adanya suatu pengotor pada fase diam dapat menyebabkan
adsorbsi tidak reversible.
Kromatografi cair yang dilakukan di dalam suatu kolom besar
menggunakan metode kromatografi terbaik untuk pemisahan campuran
dengan jumlah yang besar. Kromatografi kolom ini memiliki kelebihan

karena dapat digunaan untuk analisis dan aplikasi perapartive.

Digunakan untuk menentukan jumlah komponen suatu campuran,
digunakan untuk menentukan jumlah komponen sutu campuran,
digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi. Sedangka,
kekurangan pada romatografi kolom dibutuhkan suatu kempuan teknik
dan manual metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama.
Metode pada pemishan kromatografi ini memerluka bahan kimia
yang cukup banyak yang digunakan sebagai fase diam dan fase
gerakbergantung pada suatu ukuran dari kolom gelas tersebut. Hasil
pemisahan kurang jelas artinya kadang kadang sukar mendapatkan
suatu pemisahan secara sempurna karena pita komponen yang satu
bertumpang tindih dengan komponen lainnya.
Keuntungan pemisahan dengan metode kromatografi adalah :
a.
Dapat digunakan untuk sampel atau konstituen yang sangat kecil
b. Cukup selektif terutama untuk senyawa-senyawa organic multi
komponen
c.
Proses pemisahan dapat dilakukan dalam waktu yang singkat
d. Seringkali murah dan sederhana karena umumnya tidak
memerlukan alat yang mahal dan rumit

V.

Alat dan Bahan

V.1.
Alat alat :
1. Kolom gelas
2. Penyangga
3. Kapas
4. Beaker glass
V.2.
Bahan bahan :
1. Ekstrak daun singkong
2. Bubur selulosa
3. wash benzen
4. Aseton

VI.

Prosedur
VI.1.
Pembuatan ekstrak pigmen plastid
Dikeringkan daun ingkong di dalam oven. Ditunbuk halus
atau gerus dalam mortis, lalu diayak. Ditimbang 5g serbuk halus
dari zat tersebut ditambahkan 15 ml aseton dan digerus dalam

mortir diatas es (mortir terlebih dahulu didinginkan di dalam

lemari es). Saring dan dipindahkan ke dalam corong pemisah yang
kering. Ditambah 20 ml petrolatum benzene dan 50 ml akuadest.
Dikocok dan dibiarkan selama 20 30 menit. Lapisan bawah
dibuang lapisan atas (ekstrak pigmen) diambil dan disimpan dalam
botol coklat yang berisi K2SO4 anhidrat.
VI.2.
Prosedur Kromatografi Kolom
Dibuat bubur selulosa dengan menggunakan pelarut wah
benzen lalu dimasukkan langsung ke dalam kolom, akan tetapi,
sebelum dimasukkan bubur selulosa dimasukkan terlebih dahulu
kapas ke dalam kolom tersebut. Dan diusahakan agar bubur
selulosa

tersebut

tidak

pecah

pecah.

Dielusi

dengan

menggunakan petroleum benzene sampai diperoleh masa yang

kompak dengan tetesan yang konstan. Dimasukkan secukupnya
ekstrak daunsingkong secara perlahan lahan secukupnya dan
tunggu hingga semua ekstrak meresap ke dalam kolom selulosa.
Dielusi kembali dnegan menggunakan PB sampai warna kuning
pertama turun (karoten) eluar dari kolom. Kemudian, elusi
dilanjutkan kembali sampai warna kuning kedua (xantofil) keluar
dari kolom. Setelah fraksi karoten dan xantofil keluar semua,
eluent diganti dengan campuran PB : aseton (12:1). Kolom dielusi
ampa semua fraksi hijau biru (klorofil A) keluar dari kolom. Elus
diteruskan sampai warna kuning hijau (klorofil B) semua kaluar.
Masing masing fraksi ditampung dalam tabung reaksi tersendiri.
VII.

Data Pengamatan
Warna ke-1 : kunimg (karoten)
Warna ke-2 : hijau klorofil (klorofil)

VIII. Pembahasan
Pada praktikum kali ini tentang kromatografi kolom dengan
menggunakan suatu sample yaitu dari daun singkong yang telah
dihaluskan. Tujuan untuk kromatografi kolom ini untuk memisahkan
suatu senyawa dari campurannya yang didasarkan pada suatu
pemisahan

daya

adsorbsi

dengan

memakai

kolom,

dengan

menggunakan suatu bantuan yaitu pelarut yang sesuai dengan

menggunakan suatu fase dim berupa selulosa.
Prinsip pada kromatografi kolom ini berdasatkan pada migrasi dan
distribusi suatu komponen komponen yang berada dalam fase diam
dan fase gerak, dan juga berdasarkan pada affinitas kepolaran analit
dengan fase diam, sedangkan fase gerak selalu memiliki kepolaran
yang berbeda dengan fase diam.
Selulosa yang digunakan pada fase diam ini adalah molekul yang
terdiri dari karbon, hydrogen, dan oksigen sehingga dapat dikatakan
bahwa sellulosa adalah polimer alam dengan rantai panjang yang
dibuat dengan menghubungkan molekul yang lebih kecil.
Pada kromatografi kolom ini ada dua metode yaitu dengan
menggunakan suatu cara kering dan juga dengan menggunakan suatu
cara basah. Akan tetapi, pada praktikum kromatgrafi kolom ini
digunakan suatu metode yaitu dengan metode kromatografi kolom
secara basah yaitu dengan cara membuat bubur selolusa yang
ditambahkan dengan pelarut petroleum benzen dan dimasukkan secara
hati hati ke dalam suatu kolom. Akan tetapi, sebelum dimasukkan
bubur selulosa tersebut ke dalam suatu kolom harus disumbat terlebih
dahulu dengan menggunakan suatu kapas tujuannya agar proses

pemisahannya berjalan dengan baik dan senyawa yang akan

dipisahkan lolos dari kapas tersebut dan zat yang partikelnya besar
akan tertahan pada kapas tersebut.
Pada kromatografi kolom ini, teknik pada saat pembuatan kolom
dengan bubur selulosa dan juga pelarut yang ditambahkan, dan pada
kolom tidak boleh sampai retak, dan harus pada keadaan padat dengan
arti tidak boleh adanya suatu ruang udara ataupun gelembung yang
terdapat

dalam

kolom

tersebut

karena

hasilnya

akan

jelek

mempengaruhi pada proses pemisahannya.

Apabila pada saat pembuatan kolom tersebut bubur selulosa belum
memadat dan konstan maka dibantu dengan menambahkan sutu pelarut
petroleum benzen hingga konstan tidak lagi terjadi perubahan dan
kolom tersebut memadat tidak adanya suatu ruang atau keretakan
antara kolom.
Apabila pada pembuatan kolom tersebut telah didapatkan kolom
yang baik tidak adanya keretakan dan sudah memadat antara ruangnya
maka dimasukkan suatu sample yang akan dipisahkan suatu
senyawanya.
Pada saat pemisahan ini terjadi, komponen komponen yang
dipisahkan memiliki kecepatan yang berbeda beda untuk turun dan
melewati kolom tersebut hal ini dikarenakan dipengaruhi salah satunya
oleh suatu pelarut yang ditambahkan, karena ketika saat pelarut
tersebut sudah dalam keadaan tidak bisa menarik suatu komponen
yang berada dalam sample tersebut maka perlu diganti lagi dengan
suatu pelarut dengan perbandingan yang lain hingga suatu pelarut
tersebut mampu untuk menarik komponen yang berada pada sample
tersebut turun untuk melewati kolom tersebut.
Pelarut yang digunakan untuk memisahkan suatu komponen warna
kuning pertama (karoten) digunakan pelarut petroleum benzene. Akan
tetapi, pada saat memisahkan suatu senyawa yang berwarna hijau
(klorofil) maka digunakan suatu pelarut yaitu petroleum benzene :
aseton dengan perbandingan 12 : 1. Hal ini dikarenakan kepolaran dari

suatu senyawa atau komponen untuk turun berbeda beda. Warna

kuning yang pertama kali keluar atau turun sifatnya lebih polar.
IX.

Kesimpulan
Metode kromatografi kolom yang digunakan pada praktikum kali
ini dengan metode basah, prinsipnya berdasarkan pada migrasi dan
distribusi pada komponen komponen yang berada pada fase gerak
dan fase diam. Dilihat dari tingkat kepolaran suatu senyawa pada fase
gerak maupun sample dapat mempengaruhi cepat atau lambatnya suatu
komponen tersebut turun melalui kolom menggunakan fase diam
berupa selulosa.

X.

Daftar Pustaka
Sudjadi. 1988. Metode Pemisahan. Konsius. Yogyakarta
Watson, G David. 2005. Analisis Farmasi edisi 2. Penerbit Buku
Kedokteran. Jakarta.
Keenan, Charles W. dkk. 2002. Kimia Untuk Universitas Jilid 2.
Erlangga: Jakarta.

Available online at : www.scribd.com (diakses pada tanggal 13 April

2015)

10