UNIVERSIDAD DE TARAPAC

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGA

Citotoxicidad inducida por Senecio sp (Chachacoma): Implicancia de la

enzima Mn-superxido dismutasa en cncer mamario
TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE:
MAGSTER EN CIENCIAS BIOLGICAS
MENCIN BIOLOGA DE LA
REPRODUCCIN Y DEL DESARROLLO
NOMBRE ALUMNO
SUSANA ALFARO LIRA
NOMBRE PROFESOR GUA
CARLOS ECHIBUR CHAU

ARICA CHILE
AO
2013

Agradecimientos
Llegando al final de esta etapa, nace la necesidad de reconocer a aquellas personas
que sin su participacin, apoyo constante y amistad no hubiese sido posible concluir este
trabajo.
Debo agradecer de manera especial y sincera al Profesor Carlos Echibur Chau, por
confiar en mis capacidades y aceptarme bajo su tutela para llevar a cabo esta tesis. Su apoyo
y confianza en mi trabajo y su capacidad para guiar la investigacin ha sido un aporte
invaluable, no solamente en el desarrollo de esta tesis, sino tambin en mi formacin como
futura investigadora. Las ideas propias, siempre enmarcadas en su orientacin y rigurosidad,
han sido la clave del buen trabajo que hemos realizado juntos, el cual no se puede concebir
sin su siempre oportuna participacin. Le agradezco tambin el apoyo brindado por el
proyecto FONDECYT #11110284, por facilitarme siempre los medios suficientes para llevar a
cabo todas las actividades propuestas durante el desarrollo de esta tesis.
Quiero expresar mis ms sinceros agradecimientos a mis profesores del magster por
su dedicacin en compartir su conocimiento y en especial al Dr. Mario Valenzuela Estrada por
darnos su apoyo en momentos de dificultad, facilitando las dependencias del laboratorio de
Biologa Molecular donde se realizaron las ltimas experiencias prcticas de este trabajo.
Y por ltimo y no menos importante, a mi familia y amigos ms cercanos, que tuvieron
que tolerar mi ausencia, mal humor y momentos de debilidad a lo largo de todo este trabajo.
Gracias, porque Ustedes, mi gente linda, confiaron en mi cuando yo no lo hice.

A todos Ustedes muchsimas gracias.

ndice
1.

Abreviaturas ..............................................................................................................1

2.

Resumen ...................................................................................................................5

3.

Introduccin ...............................................................................................................7

3.1

Generalidades del cncer ..........................................................................................8

3.2

El cncer mamario.....................................................................................................8

3.3

El microambiente tumoral: efecto de la hipoxia ..........................................................9

3.4

Potenciales terapias en aumento de las especies reactivas de oxgeno (ROS) ....... 10

3.5

Especies reactivas de oxgeno y muerte celular ......................................................12

3.6

Mecanismos de muerte celular ................................................................................13

3.7

Apoptosis ................................................................................................................13

3.9

Muerte celular y enzimas antioxidantes ...................................................................17

3.10

Familia SOD ............................................................................................................18

3.11

La Mn - superxido dismutasa .................................................................................19

3.12

Polimorfismos presentes en MnSOD .......................................................................20

3.13

Compuestos bioactivos anticancergenos de origen vegetal que utilizan vas de

estrs oxidativo como alternativa teraputica contra el cncer ................................21

Objetivos .................................................................................................................25

Materiales y mtodos ..............................................................................................27

5.1

Cultivo celular. .........................................................................................................28

5.2

Curva de crecimiento y tiempo de doblaje. ..............................................................28

5.3

Material vegetal .......................................................................................................28

5.4

Preparacin del extracto crudo de S. graveolens.....................................................29

5.5

Curva de dosis/tiempo respuesta al extracto fitoqumico de S. graveolens y dosis

letal 50 % (DL50). .....................................................................................................29

5.6

Tratamiento con extracto fitoqumico de Senecio graveolens ..................................30

II

5.7

Anlisis de expresin proteica .................................................................................30

5.8

Determinacin del polimorfismo Val16Ala de SOD2 ................................................31

5.9

Anlisis estadstico ..................................................................................................32

Resultados ..............................................................................................................33

6.1

Tiempo de doblaje. ..................................................................................................34

6.2

Curva de dosis/tiempo respuesta del extracto crudo de S.graveolens .....................35

6.3

Clculo de dosis letal al 50% (DL50) en las clulas MCF-10F y estandarizacin de las
condiciones de trabajo con el extracto crudo de S. graveolens ................................36

6.4

Efecto citotxico del extracto fitoqumico de S. graveolens en las lneas celulares

tumorignicas derivadas de cncer mamario ...........................................................37

6.5.

Efecto del extracto de S. graveolens sobre la expresin proteica de la enzima

MnSOD ...................................................................................................................39

6.6

Determinacin de las variantes polimrficas Val16Ala de MnSOD ..........................40

6.7

Anlisis de las protenas relacionadas con muerte celular ...................................... 41

7.

Discusin.................................................................................................................45

8.

Conclusiones ...........................................................................................................52

9.

Referencias .............................................................................................................54

III

ndice de Figuras
Figura 1.- Esquema de las vas intrnseca y extrnseca de la apoptosis ...............................17
Figura 2.- Curva de crecimiento calculada para la lnea celular MCF-10F ............................34
Figura 3.- Curva de dosis/tiempo respuesta .........................................................................35
Figura 4.- Grficos obtenidos a partir de las curvas de dosis/tiempo respuesta al extracto .....
crudo de S. graveolens .......................................................................................36
Figura 5.- Dosis letales al 50% de S. graveolens ..................................................................37
Figura 6.- Efecto citotxico del extracto fitoqumico de S. graveolens . .................................38
Figura 7.- Expresin proteica de MnSOD ..............................................................................40
Figura 8.- Determinacin de la variante polimrfica Val16Ala en el gen de SOD2 con la .........
enzima de restriccin NgoMIV ..............................................................................41
Figura 9.- Expresin proteica de Caspasa -8 .......................................................................42
Figura 10.- Expresin proteica de Caspasa -3 .......................................................................43
Figura 11.- Expresin proteica de Bcl-2 .................................................................................44

IV

1.- ABREVIATURAS

AP2

Factor de transcripcin, del ingls activating protein-2

APAF-1

Protena pro-apopttica, del ingls apoptotic peptidase activating

factor-1

AIF

Factor inductor de la apoptosis, del ingls apoptosis inductor factor

ATG

Genes relacionados con autofagia, del ingls autophagy related

genes

ATP

Adenosin trifosfato

BCA

Acido bicinconnico; del ingls bicinchoninic acid

Biotin-16-dUTP

Biotina-16-2'-deoxi-uridina-5'-trifosfato

BSA

Albmina de suero de bovino; del ingls bovine serum albumin

CAIX

Enzima anhidrasa carbnica IX, del ingls carbonic anhydrase IX

DEPC

Dietil pirocarbonato

EDTA

cido etilendiaminotetraactico

ER

Receptor estrognico, del ingls estrogen receptor

GPx

Glutatin peroxidasa

H2O2

Perxido de hidrgeno

HCl

cido clorhdrico

HREs

Elementos responsivos de hipoxia, del ingls hypoxia response

elements

HIFs

factores inducibles de hipoxia, del ingls hypoxia-inducible

factors

HRP

Peroxidasa de rbano, del ingls horseradish peroxidase

IAP

Protenas inhibidoras de la apoptosis, del ingls Inhibitor apoptosis

proteins

kDa

Kilodaltons. Unidad de masa atmica

LC3

Protena asociada a microtbulos-cadena ligera 3, del ingls

microtubule-associated protein- light chain 3

MCF-10F

Lnea celular epitelial mamaria no transformada e inmortalizada de

forma espontnea; del ingls Michigan Cancer Foundation-10 floating
2

MCF-7

Lnea celular de adenocarcinoma mamario, del ingls Michigan

Cancer Foundation-7

Mg++

Magnesio

MgCl2

Cloruro de magnesio

msnm

Metros sobre el nivel del mar

MnSOD

Superxido dismutasa

MPT

Poro de permeabilizacin mitocondrial, del ingls mitochondrial

permeability transition pore

MTS

Secuencia de direccionamiento mitocondrial, del ingls mitochondrial

targeting signal

NaCl

Cloruro de sodio

NAD

Nicotinamida adenina dinucletido

NADPH

Nicotinamida adenina dinucletido fosfato

NFB

Factor nuclear kappa B

NP-40

Nonidet P-40

NQO1

enzima NADPH:quinona xido-reductasa

O2-

Radical superxido

OH

Radical hidroxilo

OMS

Organizacin mundial de la salud

PARP-1

Poli[ADP-ribosa] polimerasa-1

PgR

Receptor de progesterona, del ingls progesterone receptor

pb

Pares de bases

PBS

Tampn de fosfato salino; del ingls phosphate buffer saline

PCR

Reaccin en cadena de la polimerasa; del ingls polymerase chain

reaction

PMSF

Fluoruro de fenilmetilsulfonil; del ingls phenylmethanesulfonylfluoride

PVDF

Membrana de fluoruro de polivinilideno; del ingls polyvinylidene

fluoride

SDS

Dodecilsulfato sdico; del ingls sodium dodecyl sulfate

3

SDS-PAGE

electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS; del ingls SDSpolyacrylamide gel electrophoresis

TBE

Tampn Tris-Borato-EDTA

TBS-T

Tampn tris salino con detergente no inico Tween-20; del ingls trisbuffered saline-Tween 20

TIM

Translocasa de la membrana interna, del ingls translocate of the

inner membrane

TNF

Factor de necrosis tumoral alfa, del ingls tumor necrosis factor alpha

TOM

Translocasa de la membrana externa, del ingls translocate of the

outer membrane

Tris-HCl

Detergente tris con cido clorhdrico

2.- RESUMEN

El cncer de mama es el tumor ms frecuente en las mujeres. En general, las clulas

cancerosas poseen un alto grado de estrs oxidativo, que conlleva a un aumento de su
inestabilidad gentica permitiendo la adquisicin de un fenotipo ms agresivo. El incremento
de las especies reactivas de oxgeno se ha asociado con una disminucin de la principal
enzima de defensa antioxidante, la superxido dismutasa (SOD). La Mn-superxido
dismutasa (MnSOD) es una de las tres isoformas de SOD, enzima que cataliza la conversin
del in superxido a perxido de hidrgeno y oxgeno, protegiendo a la clula de posibles
daos producidos por los radicales libres. La depresin de esta enzima, encontrada en
algunos tipos de cncer mamario, puede ser crucial para desarrollar estrs oxidativo, sin
embargo, esta caracterstica puede ser utilizada como herramienta para algunas terapias
anticancergenas.
En la bsqueda por desarrollar nuevas terapias antineoplsicas, se ha encontrado que
existen compuestos fitoqumicos de origen vegetal que inducen un efecto citotxico mediado
por vas de estrs oxidativo. En el altiplano del norte chileno, se encuentra un arbusto usado
para tratar el mal de altura, la Chachacoma (Senecio graveolens). Algunas especies smiles
de este gnero han sido evaluadas como agentes citotxicos que inducen una alteracin del
estrs oxidativo en el microambiente celular como mecanismo de accin.
En este trabajo se determin el efecto citotxico del extracto etanlico de S.
graveolens en lneas celulares derivadas de cncer mamario: ZR-75-1, MCF-7 y la MDA-MB231, y su contraparte normal MCF-10F. Se estudi la relacin entre la presencia de la enzima
MnSOD y la respuesta al efecto citotxico del extracto. Para ello, tambin se estudi la
presencia de la variante polimrfica Val16Ala en MnSOD para ver si esta influye en la
presencia de la enzima ya que esta variacin produce un cambio conformacional que afecta la
localizacin y eficiencia del transporte de esta protena hacia la mitocondria. Para la va de
muerte celular utilizada por las lneas celulares frente al efecto citotxico del extracto se
midieron los niveles de expresin de protenas claves relacionadas con muerte celular como
Caspasa -3, Caspasa -8 y Bcl-2.
Las lneas celulares ms sensibles al tratamiento con el extracto fueron las ZR-75-1 y
la MCF-7, las que disminuyeron su viabilidad a menos de un 10%, mientras que la MDA-MB231 disminuy slo a un 50%. Se observ que los niveles de viabilidad celular luego de
aplicados los tratamientos con el extracto fitoqumico, se correlacionan directamente con los
niveles de expresin proteica basales de MnSOD para cada una de las lneas celulares, es
decir, a mayor expresin mayor resistencia al efecto citotxico. El extracto crudo de Senecio
activa vas de apoptosis en la lnea celular MCF-7 sugiriendo la activacin de la va
extrnseca. Sin embargo, dado que no se observan cambios en las protenas relacionadas con
apoptosis en la lnea ZR-75-1 y MDA-MB-231, se sugiere para stas una muerte celular
independiente de caspasas.
El extracto fitoqumico de S. graveolens es un potencial agente teraputico que acta
efectivamente sobre las lneas celulares malignas menos agresivas. Estudios futuros deben
enfocarse en el mecanismo de accin de dicho extracto y en los compuestos activos que
estn ejerciendo esta bioactividad anti-tumoral.

3.- INTRODUCCIN

3.1

Generalidades del cncer

El cncer es una de las principales causas de muerte a nivel mundial. Segn datos de

la OMS, en el ao 2008 caus 7,6 millones de defunciones, en otras palabras, un 13% de

todas las muertes registradas en el mundo (Ferlay et al., 2008). La OMS prev que a nivel
mundial la mortalidad causada por el cncer aumentar en un 45% entre 2007 y 2030, pasar
de 7,9 millones a 11,5 millones de defunciones. Este aumento se deber al incremento
demogrfico, mayores expectativas de vida y hbitos poco saludables que est adoptando la
poblacin. Adems, se estima que durante el mismo perodo de tiempo la incidencia de ste
aumentar de 11,3 millones en 2007 a 15,5 millones en 2030 (Organizacin Mundial de la
Salud, 2008).
El cncer se caracteriza por una proliferacin descontrolada de clulas y es un
trmino que engloba a un conjunto de enfermedades que puede afectar cualquier parte del
cuerpo. Existen alrededor de cien tipos de cnceres con distinta histologa y etiologa pero que
comparten las siguientes caractersticas: sus clulas pueden proliferar sin necesidad de recibir
estmulos externos; son insensibles a los factores inhibitorios de crecimiento; evaden la
muerte celular programada (apoptosis); poseen una capacidad ilimitada de replicacin; son
capaces de producir nuevos vasos sanguneos y de mantenerlos (angiognesis sostenida); y
pueden invadir el tejido circundante y producir metstasis (Hanahan y Weinberg, 2000).
3.2

El cncer mamario
El cncer mamario es el tumor maligno ms frecuente en la mujer, segn los datos del

ltimo GLOBOCAN 2008. Se estima que en el ao 2008 se diagnosticaron 1,38 millones de

nuevos casos, significando un 23% de todos los cnceres diagnosticados en aquel ao. El
cncer de mama es la quinta causa de muerte entre todos los cnceres y sigue siendo el ms
frecuente en las regiones desarrolladas y menos desarrolladas del mundo, causando 458.000
defunciones sol en el ao 2008 (Ferlay et al., 2008). En Chile, el Ministerio de Salud a travs
8

del Programa Nacional de Cncer de Mama, inform que en el ao 2009 se registraron 3.100
nuevos casos y en ese mismo ao se registraron 1.338 muertes por esta causa (Ministerio de
Salud, 2011).
El cncer de mama, generalmente, se origina a partir de las clulas que se
encuentran en los lobulillos, glndulas productoras de leche, o en los conductos, vas que
transportan la leche desde los lobulillos hasta el pezn. Con menos frecuencia, el cncer de
mama puede originarse a partir de los tejidos del estroma, que incluyen a los tejidos
conjuntivos grasos y fibrosos de esta (Richie y Swanson, 2003).
3.3

El microambiente tumoral: Efecto de la hipoxia

El tumor no es slo una masa de clulas que crece descontroladamente, con el

transcurso del tiempo se ha reconocido como un tejido complejo. El tumor tiene un

componente no celular que consta de protenas de la matriz extracelular, y un componente
celular que posee clulas malignas y clulas normales tales como fibroblastos, clulas
endoteliales y clulas provenientes del sistema inmune. Todos estos elementos crean un
complejo ambiente de seales intercelulares que le permiten al tumor desarrollarse y
progresar. Incluso, la interaccin entre la matriz extracelular de este microambiente con las
clulas, epiteliales o fibroblastos normales, contribuyen al crecimiento del tumor, no slo con
un aumento de la celularidad sino tambin en la produccin de protenas extracelulares que
mantienen y renuevan el estroma tumoral, que en determinados casos pueden promover la
metstasis (Hanahan y Weinberg, 2011; Petrulio et al., 2006).
Al igual que los tejidos normales, el tumor necesita de vasos sanguneos para
abastecerse de nutrientes y oxgeno, adems de eliminar sus elementos de desecho
(Hanahan y Weinberg, 2011). En este contexto, las clulas tumorales son capaces de
modificar el microambiente a su favor, atrayendo y activando a las clulas no-tumorales tales
como, fibroblastos y clulas endoteliales para generar vasos sanguneos y linfticos (Hiscox et
9

al., 2011). Este proceso angiognico se ha observado en las etapas ms tempranas de los
tumores, progresando junto con el crecimiento del tumor (Hanahan y Folkman, 1996).
El microambiente al interior del tumor se vuelve hipxico como consecuencia de un
rpido crecimiento de las clulas malignas, disminucin de la muerte celular y a una neovascularizacin inadecuada (Nagy et al., 2010; Semenza, 2012). Este escenario obliga a las
clulas tumorales a adaptarse al nuevo ambiente con respuestas que involucran un aumento
del metabolismo de la gliclisis anaerobia, con una pobre formacin de piruvato para la
respiracin mitocondrial; aumentan el nmero de transportadores de glucosa a nivel de la
membrana citoplasmtica, aumentando la eficiencia en la captacin de esta y disminuyendo
pero optimizando el uso de la respiracin mitocondrial. Con todas estas adaptaciones el tumor
asegurara su supervivencia y le otorgara una mayor ventaja de crecimiento a estas clulas
por sobre el resto de la poblacin, confirindole una mayor agresividad (Hanahan y Weinberg,
2011; Kim et al., 2007). Existen numerosos reportes que asocian el estado hipxico de un
tumor con un factor de mal pronstico para el paciente ya que se ha observado un aumento
de la recurrencia del cncer, metstasis, mayor resistencia a la radioterapia con radiacin
gamma, radiacin por rayos X, a algunos agentes de quimioterapia y pocas expectativas de
supervivencia para el paciente (Chouaib et al., 2012; Graeber et al., 1996).
3.4

Potenciales terapias basadas en aumento de las especies reactivas de oxgeno (ROS)

La selectividad teraputica es un tema importante en el tratamiento del cncer. El

agente antineoplsico ideal debe ser txico para las clulas malignas y afectar mnimamente a
las clulas normales. Por esta razn, existen pocos frmacos disponibles para uso clnico y
por consecuencia se sigue investigando para desarrollar y/o descubrir nuevos frmacos que
cumplan con esta caracterstica tan importante.
Las clulas normales toleran de mejor manera el aumento sbito de los niveles de
ROS provocados por un agente exgeno, ya que al poseer niveles basales bajos de estas
10

especies reactivas en comparacin a sus contrapartes malignas, poseen una mayor

capacidad de reaccin ante este tipo de agresin. Esta diferencia, entre los estados redox de
las clulas normales y malignas, sienta las bases biolgicas para provocar una muerte
selectiva de las clulas tumorales usando agentes que aumentan los niveles de estrs
oxidativo o disminuyan las enzimas relacionadas con la defensa antioxidante, caracterstica
que podra ser utilizada en posibles terapias (Trachootham et al., 2006). La mayora de las
clulas malignas exhiben elevados niveles de estrs oxidativo asociado a un metabolismo
activo, alta tasa de proliferacin celular, disfuncin mitocondrial y a la estimulacin oncognica
(Pelicano et al., 2003; Szatrowski y Nathan, 1991). Las clulas malignas son capaces de
adaptarse a un nivel constante y moderado de estrs oxidativo, aumentando sus enzimas
antioxidantes como la catalasa, superxido dismutasa y glutatin peroxidasa, por dar algunos
ejemplos. Pero esta adaptacin tiene una capacidad limitada ya que bajo ciertas condiciones
de estrs oxidativo sostenido, y de niveles mayores al que est adaptada la clula, se podra
gatillar la muerte celular al saturar las reservas antioxidantes de sta (Pelicano et al., 2004).
La mitocondria es uno de los mayores productores de especies reactivas de oxgeno y
su cadena transportadora de electrones es uno de los mayores proveedores de estas
especies. Para aumentar la cantidad de ROS a niveles txicos existen agentes como el
trixido de arsnico, este compuesto afecta la cadena transportadora de electrones
aumentando la produccin de iones superxido (Pelicano et al., 2003). Otra manera de elevar
la generacin de ROS es mediante el uso de los llamados cicladores redox. Estos ejercen su
accin mediante la formacin de radicales intermediarios al reaccionar con las flavoprotenas
reductasas, tales como la citocromo p450 y la NADPH:quinona xido-reductasa (NQO1) en
presencia de NADPH. Estos radicales intermediarios son capaces de generar ines
superxido en presencia de oxgeno molecular; dos ejemplos de cicladores redox son el
gadolinio motexafina y las antraciclinas como la daunorubicina y la doxorrubicina
(Trachootham et al., 2009).

11

Las antraciclinas son antibiticos citostticos obtenidos a partir de cultivos de la

bacteria Streptomyces peucetius. La antraciclina ms utilizada es la doxorrubicina, la cual se
usa como quimioteraputico en numerosos tipos de cncer, como por ejemplo, el de mama,
testculo, ovario y pulmn, entre otros (Kotamraju et al., 2002). La doxorrubicina, aparte de
trabajar como un ciclador redox, puede causar estrs oxidativo mediante la quelacin del
hierro intracelular, conocida como reaccin de Fenton que genera radicales de hidroxilo
(Kotamraju et al., 2002). La siguiente ecuacin es la representacin simblica de la reaccin
de Fenton:

e
3.5

Especies reactivas de oxgeno y muerte celular

Como resultado del metabolismo aerbico de las clulas, es normal la produccin

constante de pequeas cantidades de radicales libres o ROS, como lo son los radicales
hidroxilo (OH), aniones superxido (O2-) y perxido de hidrgeno (H2O2), entre otros. Por
esta razn, la clula posee una defensa antioxidante que acta rpidamente para mantener la
homeostasis redox. Cuando la cantidad de radicales libres aumenta a un nivel que no puede
ser contrarrestado por el sistema antioxidante se produce el llamado estrs oxidativo que, de
persistir, puede oxidar y daar biomolculas crticas como protenas, lpidos y material
gentico. Este tipo de dao oxidativo puede llevar a alteraciones en la transmisin de seales,
expresin del DNA, induccin de mutagnesis y gatillar la apoptosis (Mates y SanchezJimenez, 2000).
La mitocondria juega un papel importante en la activacin de la apoptosis ante varios
estmulos mediante la permeabilizacin de su membrana y liberacin de la citocromo c (Mates
et al., 2012). Bax, miembro pro-apopttico de la familia Bcl-2, puede causar de forma directa
la liberacin de la citocromo c (Simon et al., 2000). Otra de las alteraciones que puede

12

provocar el aumento de ROS es la peroxidacin lipdica, agresin que puede afectar la

membrana plasmtica o las membranas de los orgnelos citoplasmticos, lo que tambin
puede inducir apoptosis (Yin y Doung, 2003).
3.6

Mecanismos de muerte celular

Hasta el momento se han descrito tres tipos de muerte celular: muerte celular

programada tipo I, conocida como apoptosis; muerte celular tipo II o autofagia; y muerte
celular tipo III, tambin llamada necrosis. La apoptosis es un proceso controlado dependiente
de energa, que afecta a un nmero reducido de clulas y no existe descarga del contenido
intracelular al ambiente extracelular, evitando el reclutamiento de clulas inflamatorias que
afecten a las clulas vecinas (Elmore, 2007). La autofagia, por su parte, se caracteriza por el
secuestro del citoplasma y orgnelos en vesculas, las que luego se unirn con lisosomas,
propios de la clula, para su posterior degradacin. En pocas palabras la clula se degrada a
s misma (Codogno y Meijer, 2005). La necrosis es un proceso en el cual la muerte es
inducida de manera pasiva e independiente de energa. Este proceso afecta a la clula que lo
padece y al grupo de clulas que est a su alrededor, puesto que la clula pierde la integridad
de su membrana y descarga todo su contenido citoplasmtico al medio extracelular
provocando una reaccin inflamatoria producto de las enzimas y proteasas liberadas, adems,
del reclutamiento de clulas inflamatorias (McCall, 2010; Orrenius et al., 2011).
3.7

Apoptosis
Este proceso de muerte celular programada, involucra una serie de genes que

requieren un consumo activo de energa en forma de ATP (Afford y Randhawa, 2000). La

clula apopttica pasa por una serie de cambios morfolgicos y alteraciones bioqumicas
como lo son: la fragmentacin de ADN, condensacin de la cromatina, retraccin celular y
finalmente se produce la eliminacin del contenido citoplasmtico y nuclear al medio
extracelular, encapsulado en su propia membrana citoplasmtica. Estos restos celulares luego
13

son fagocitados por macrfagos o por las clulas adyacentes, sin descargar residuos al
ambiente extracelular que puedan desencadenar una reaccin inflamatoria (Hacker, 2000; J.
F. Kerr, 2002). El proceso apopttico es un complemento importante para la regulacin del
nmero de clulas durante el desarrollo (Hacker, 2000), renovacin de clulas en individuos
adultos (Jacobson et al., 1997), e importante medio de defensa mediado por linfocitos NK
(natural killer) que eliminan clulas daadas por una enfermedad o agentes externos (Norbury
y Hickson, 2001). Existen dos mecanismos por el cual la apoptosis puede activarse: la va
intrnseca, o mitocondrial, y la va extrnseca, tambin conocida como va de los receptores de
la muerte (Figura 1).
La va intrnseca se caracteriza por ser estimulada por seales intracelulares que
actan directamente sobre la mitocondria. Estas seales involucran estmulos como la
ausencia de factores de crecimiento, presencia de citoquinas, radiacin ionizante, toxinas,
hipoxia, infecciones virales y radicales libres (Elmore, 2007). Todos estos estmulos pueden
causar la permeabilizacin de la membrana mitocondrial por la apertura de poros llamados
MPT (MPT; por sus siglas en ingls Mitochondrial Permeability Transition pore). La apertura
de estos poros esta mediada por protenas pertenecientes a la familia Bcl-2: Bax y Bak (Narita
et al., 1998). Su apertura, libera desde el espacio intermembranal de la mitocondria al
citoplasma factores pro-apoptticos tales como la citocromo c, Smac/DIABLO y la sern
proteasa HtrA2/Omi. Estas protenas son capaces de activar la va mitocondrial dependiente
de caspasas (Garrido et al., 2006; Garrido y Kroemer, 2004; Vaux, 2011).
La citocromo c es una protena que participa en la generacin de ATP en la cadena
transportadora de electrones de la mitocondria. Cuando la citocromo c pasa desde la
mitocondria al citoplasma, esta se une a la protena citoslica Apaf-1 promoviendo la
oligomerizacin de esta ltima, que a su vez se une a la procaspasa -9 formando de esta
manera el apoptosoma (Acehan et al., 2002). Con la formacin del apoptosoma, la
procaspasa -9 se activa pasando a caspasa -9 y esta a su vez activa la cascada de caspasas
por medio del clivaje de las formas inactivas de las caspasas -3 y -7 las que se encargan de
14

activar al resto de las caspasas, por ello reciben el nombre de caspasas efectoras (Slee et al.,
1999). La caspasa -3 tambin participa en un mecanismo de retroalimentacin positiva
activando la procaspasa -9 (Slee et al., 1999). Las caspasas son cisten-proteasas, que
escinden o clivan las protenas en residuos de cido asprtico. Una variedad de protenas del
citoesqueleto son atacadas por estas caspasas contribuyendo a la reorganizacin del cuerpo
celular que ocurre durante el proceso de la apoptosis (Crawford y Wells, 2011). Adems de las
protenas del citoesqueleto, las caspasas tienen como blanco protenas reparadoras como
PARP-1. Este enzima se encarga de marcar los daos ubicados en el ADN con una cadena
de poli(ADP)ribosa con gasto de ATP y de NAD. Al clivarse PARP-1 se previene la reparacin
del ADN y se asegura la reserva energtica de ATP para el proceso de apoptosis, evitando la
necrosis por falta de ese recurso energtico (Soldani y Scovassi, 2002).
Las Smac/DIABLO y HtrA2/Omi, se han reportado como protenas promotoras de la
apoptosis inhibiendo la activacin de las IAP (del ingls Inhibitor of apoptosis proteins) (Vaux,
2011). En una etapa tarda, antes de ocurrir la muerte celular, desde la mitocondria sale un
segundo grupo de protenas apoptticas las AIF (del ingls Apoptosis Inducer Factor) y la
endonucleasa G. Las AIF se trasladan hacia el ncleo y fragmentan el ADN en piezas de 50 a
300 kb, aproximadamente. La endonucleasa G, de igual forma, se dirige hacia el espacio
nuclear y produce cortes en la cromatina promoviendo la condensacin del ncleo (Varecha et
al., 2012).
La va extrnseca de la apoptosis esta mediada por receptores de membrana,
conocidos como los receptores de la muerte. Los miembros ms estudiados de esta familia de
receptores son as/CD95, factor de necrosis tumoral (TN ) (Ashkenazi y Dixit, 1998). Los
miembros de esta familia se caracterizan por tener de 2 a 5 copias de un dominio extracelular
rico en cistena. La activacin de la apoptosis se produce cuando un ligando, pro-apopttico,
se une a su receptor especfico, uno de los receptores mejor estudiados es el Fas o CD95. La
unin del ligando Fas (FasL) al receptor Fas resulta en la trimerizacin de Fas, el cual recluta
una protena adaptadora intracelular llamada FADD (del ingls Fas-associated death domain)
15

para formar un complejo de sealizacin inductor de muerte denominado DISC (del ingls
Death-Inducing Signaling Complex) (Wajant, 2002). Una vez formado el DISC, este recluta la
pro-caspasa -8, la cual es activada proteolticamente y liberada del DISC en su forma activa
de caspasa -8. Una vez activada la caspasa -8 el proceso de la apoptosis es iniciado, pues
sta activa a las pro-caspasas -3 y -7 (Elmore, 2007). Existe un solapamiento entre las vas
extrnseca e intrnseca, puesto que la caspasa -8 cliva la protena Bid a t-Bid, perteneciente a
la familia de las Bcl-2, la cual se dirige a la membrana mitocondrial para producir un poro
transitorio, liberando las protenas pro-apoptticas, aumentando la seal de muerte celular y
disparando la va intrnseca de la apoptosis (Kantari y Walczak, 2011).
La clula no slo cuenta con protenas pro-apoptticas, tambin existen protenas
especializadas en frenar el proceso de apoptosis como las antes mencionadas IAP,
encargadas de suprimir la actividad de las caspasas y las protenas de la familia Bcl-2. La
protena Bcl-2 interacta con las protenas Bax y tBid para inhibir la formacin del poro
mitocondrial y por consecuencia la liberacin de factores pro-apoptticos, para as conseguir
la inhibicin de la apoptosis por la va intrnseca (D. A. Kerr et al., 2002).

16

Figura 1.- Esquema de las vas intrnseca y extrnseca de la apoptosis. Se destacan las
protenas claves para identificar la activacin de la va intrnseca con caspasa -9 y la va
extrnseca con la caspasa -8. El solapamiento de ambas vas se produce a nivel de las
caspasas -3 y -7 y la activacin de T-Bid. La apoptosis induce la activacin de una cascada
de caspasas y proteasas que dan inicio a la fragmentacin de protenas del citoesqueleto,
fragmentan el ADN y condensan la cromatina.

3.9

Muerte celular y enzimas antioxidantes

La intervencin de los niveles de enzimas antioxidantes puede influir en la respuesta

celular, previniendo la apoptosis o gatillndola. El aumento de las especies reactivas de

oxgeno pueden inducir la transcripcin de protenas antioxidantes tales como la superxido
dismutasa (SOD) y la glutatin peroxidasa (GPx). Existen varios reportes que involucran a las
especies reactivas de oxgeno con un mayor dao en los tejidos y tambin su influencia en el
inicio de la muerte celular. Tas y colaboradores (2005), evaluaron la cantidad de peroxidacin
17

lipdica y la cantidad de enzimas antioxidantes en tejidos de cncer mamario y descubrieron

que los tejidos cancerosos posean una mayor cantidad de peroxidacin lipdica en
comparacin a los tejidos sanos. Adems, informaron que los tejidos enfermos posean
mayores ndices de actividad enzimtica de SOD y GPx. (Tas et al., 2005).
El aumento de enzimas antioxidantes puede influenciar directamente sobre la
reaccin de la clula e incluso llevarla a la muerte por medio de procesos no apoptticos; en
queratinocitos senescentes se demostr que el aumento de la manganeso-superxido
dismutasa, uno de los tipos de SOD, induce una sobreproduccin de H2O2 capaz de provocar
muerte celular mediada por autofagia y no por apoptosis (Deruy et al., 2010). Incluso se ha
demostrado que la degradacin de ciertas enzimas antioxidantes puede gatillar la muerte
celular por una va no apopttica, como se demostr al tratar clulas L929 con zVAD (del
ingls

benzy-loxycarbonyl-valyl-alanyl-aspartic-acid

(O-methyl)-fluoromethylketone)

provocando la degradacin de la enzima catalasa y causando un desbalance en el

metabolismo de ROS, promoviendo la acumulacin de ROS y por ltimo la muerte celular (Yu
et al., 2006).
3.10

Familia SOD
La familia de las superxido dismutasas es parte de la defensa antioxidante

enzimtica de la clula junto con las enzimas catalasa y glutatin peroxidasa. Las SOD
catalizan la conversin del in superxido (

2-)

a perxido de hidrgeno (H2O2) y oxgeno

(O2) como se muestra en la siguiente frmula:

O2- + O2- + 2H+

H2O2 + O2

El perxido de hidrgeno luego es procesado por catalasa para obtener agua y

oxgeno, nivelando de esta manera las especies reactivas de oxgeno al interior de la clula.
En los mamferos existen tres miembros en la familia de las SOD: la cobre-zinc superxido
18

dismutasa (Cu/ZnSOD), manganeso superxido dismutasa (MnSOD) y superxido dismutasa

de presencia extracelular (EC-SOD) (Valdivia et al., 2009).
La enzima intracelular Cu/ZnSOD se encuentra en el espacio intermembrana de la
mitocondria, citoplasma, compartimento nuclear y en el plasma. Este miembro de la familia
SOD contiene iones de cobre y zinc como cofactores. Estructuralmente esta protena es un
dmero con un peso de 32 kDa. Su funcin es mantener bajo control las especies reactivas de
oxgeno intermedias que estn presentes en el citosol (Minc et al., 1999). Generalmente la
transcripcin de SOD1, gen que codifica para Cu/ZnSOD, no es inducida por factores
externos (Miao y St Clair, 2009). Se le conoce como un gen de expresin constitutiva, utilizado
por algunos investigadores como gen control (Minc et al., 1999).
EC-SOD tambin llamado SOD extracelular, es una glicoprotena hidrofbica de 135
kDa, aproximadamente y es codificada por el gen SOD3. Contiene cobre y zinc como
subunidades, y como su nombre lo indica est localizado en el compartimento extracelular. La
expresin de EC-SOD est limitada a ciertos tipos de clulas, como las de tipo alveolar II (Folz
et al., 1999) y clulas musculares de los vasos sanguneos (Stralin et al., 1995).
3.11

La Mn-superxido dismutasa
La superxido dismutasa dependiente de manganeso se encuentra, principalmente,

en la mitocondria como un mono-tetrmero de 96 kDa de peso que posee un tomo de

manganeso en cada subunidad. De las tres isoformas de las SOD, MnSOD es la nica que es
esencial para la vida aerbica (Miao y St Clair, 2009; Valdivia et al., 2009). En ratones knockout de MnSOD la ausencia de esta protena no afecta el desarrollo embrionario, pero al nacer
mueren tempranamente. Una disminucin en la actividad enzimtica de MnSOD producto de
mutantes inactivos de SOD2 causa muertes prematuras en ratones y en modelos de
Drosophila (Duttaroy et al., 2003; Li et al., 1995). Estudios con ratones knock-out
heterocigotos para MnSOD, mantienen slo un 50% de la actividad de MnSOD, y se observ
19

que hubo un incremento en el dao de tipo oxidativo en el ADN nuclear y mitocondrial, el cual
aumenta con la edad de los especmenes (Copin et al., 2000).
El gen SOD2, que codifica para MnSOD, est localizado en el cromosoma 6q25.3. La
regin promotora carece de cajas TATA y CAAT, sin embargo, posee una zona rica en GC, la
cual posee numerosas secuencias consenso para Sp1, AP2 y una para NF-B. El gen
contiene 5 exones interrumpidos por 4 intrones (Wan et al., 1994). SOD2 es inducible a ser
transcrito por mltiples factores de estrs oxidativo in vitro e in vivo por estmulos tales como:
exposicin a altas tensiones de oxgeno (Fazzone et al., 1993; Ho et al., 1996), hipoxia
crnica (Balkova et al., 2011), radiacin ionizante (Eastgate et al., 1993) (Akashi et al., 1995),
citoquinas pro-inflamatorias (TNF-, IL1-, IL-6) (Dougall y Nick, 1991; Visner et al., 1990)
pueden rpidamente inducir la transcripcin de SOD2.
Los monmeros de MnSOD son sintetizados en el citoplasma y poseen en la zona Nterminal una secuencia de direccionamiento mitocondrial, conocida tambin como MTS (por
sus siglas en ingls, mitocondrial targeting signal). Esta secuencia seal posee 24
aminocidos, encargada de conducir la importacin mitocondrial del precursor de MnSOD a
travs de la translocasa de la membrana externa TOM (del ingls Translocate of the Outer
Membrane) y translocasa de la membrana interna TIM (del ingls Translocate of the Inner
Membrane) (Pfanner y Geissler, 2001). Una vez en el interior de la mitocondria, la MTS es
escindida del monmero precursor de la enzima y finalmente estos se unen para formar el
mono-tetrmero y as conformar la protena activa (Okada et al., 1990; Sutton et al., 2003).
3.12

Polimorfismos presentes en MnSOD

Existen por lo menos cuatro polimorfismos en MnSOD descritos: uno en la regin

promotora (-102 C>T) que produce un cambio en el patrn de unin entre esta regin y el
factor de transcripcin AP2 con una disminucin en la actividad transcripcional (Martin et al.,
2004); dos descritos en el exn 3 el primero (58 T>C) que produce un cambio de isoleucina a
20

treonina y el segundo (60 T>C) que sustituye el aminocido leucina a fenilalanina (Borgstahl et
al., 1996; Hernandez-Saavedra y McCord, 2003). Sin embargo, el polimorfismo ms estudiado
es el que sucede en la secuencia seal mitocondrial de la protena el Val16Ala (Wang et al.,
2001).
El polimorfismo Val16Ala, del codn nmero 16 de la MTS, causado por el cambio de
un solo nucletido (SNP, del ingls single nucleotide polymorphism), produce una sustitucin
de una timina (T) por una citosina (C), generando as el cambio aminoacdico de una valina
(GTT) por una alanina (GCT). Este polimorfismo producira un cambio conformacional desde
una lmina plegada (valina-Val16) a una hlice (alanina-Ala16) de esta MTS, afectando la
localizacin y eficiencia en el transporte de esta protena hacia el interior de la mitocondria
(Bag y Bag, 2008).
Este polimorfismo Val16Ala se ha asociado a una variedad de cnceres, pero los
resultados son controversiales. Se sabe que la isoforma que posee Ala16 posee una mejor
eficiencia en el transporte de los monmeros de MnSOD de un orden de un 30 a un 40% en
comparacin a la isoforma que posee Val16 (Sutton et al., 2003). Observando estos resultados
la lgica nos dicta que esta isoforma estara relacionada con un aumento en los niveles de
ROS y por ende asociada a un mayor riesgo de padecer cncer. Sin embargo, los datos
entregan un panorama distinto ya que existen ms reportes que califican a la presencia del
polimorfismo Ala16 como un factor de riesgo para padecer cncer y otras enfermedades, y una
minora califica a Val16 como factor de riesgo.
3.13

Compuestos bioactivos anticancergenos de origen vegetal que utilizan vas de estrs

oxidativo como alternativa teraputica contra el cncer

Otro de los ejes de investigacin para desarrollar nuevas terapias se enfoca en
descubrir compuestos fitoqumicos a partir de plantas. Gracias a estas investigaciones se han
extrado nuevos frmacos anti-neoplsicos como, por ejemplo, el vinblastine y el paclitaxel.
21

El vinblastine es un compuesto aislado a partir de Catharanthus roseu. En el curso de

la proliferacin celular acta como inhibidor en el ciclo celular durante la metafase, y mediante
la unin a los microtbulos inhibe el desarrollo del huso mittico. En las clulas tumorales este
agente inhibe la reparacin del ADN y los mecanismos de sntesis de ARN (Keglevich et al.,
2012; Makarov et al., 2007). Se ha utilizado en el linfoma de Hodgking y en el carcinoma
testicular (Modriansky y Dvorak, 2005). Por su parte, el paclitaxel es un alcaloide aislado
desde la Taxus brevifolia. Su actividad teraputica abarca el cncer de ovario, mama y
pulmn (Rodriguez-Antona, 2010). Su mecanismo de accin se basa en la estabilizacin de
los microtbulos durante la divisin celular evitando la segregacin cromosmica y
produciendo un aumento de H2O2 en las clulas (Alexandre et al., 2006; Cisternino et al.,
2003).
En la bsqueda de nuevos tratamientos y compuestos activos, se ha dirigido la
atencin y los esfuerzos hacia la medicina natural, la que sustenta sus bases en el
conocimiento popular sobre los efectos positivos que tienen las plantas o infusiones de estas
para curar enfermedades. Pero el conocimiento popular no basta, sino que es necesario
encontrar cules son los compuestos activos de estas plantas que son capaces de ejercer la
accin teraputica y a la vez, encontrar potenciales nuevos usos. La Chachacoma (Senecio
graveolens) es ampliamente utilizada como planta medicinal por los pueblos ubicados en la
zona andina chilena (Villagrn y Castro, 2004). Esta planta pertenece al gnero Senecio,
perteneciente a la familia de las Astercea, la cual est compuesta por aproximadamente
20.000 especies, de las cuales ms de 930 especies estn presentes en Chile (Labb, 1992;
Teillier, 2008). Senecio graveolens se caracteriza por ser un arbusto pequeo de hasta 40
cms de altura, con un fuerte aroma y crece entre los 4.100 y 4.400 msnm en el altiplano de la
zona norte de Chile (Teillier, 1999). Dentro de la gran gama de compuestos que se obtienen
de este tipo de plantas, es usual encontrar alcaloides pirrolizidnicos, terpenos y flavonoides
(Macel y Vrieling, 2003; WHO, 1988).

22

La toxicidad inducida por los extractos y aceites esenciales de las plantas del gnero
Senecio se ha documentado por vas de estrs oxidativo. Por ejemplo, S. chrysanthemoides
desencadena una respuesta apopttica en macrfagos mediante sealizacin de estrs
oxidativo (Bandyopadhyay et al., 2009; Bondan et al., 2005). Tambin, se ha observado que
Senecio sp es capaz de aumentar los niveles de estrs oxidativo y de Cu-Zn/SOD en
eritrocitos de ganado bovino que lo consumieron (Bandyopadhyay et al., 2009; Bondan et al.,
2005). En Sudfrica, es de uso comn en medicina tradicional el S. latifolius y se ha
demostrado su efecto citotxico en las clulas HuH-7, derivadas de hepatoma, causando
destruccin del citoesqueleto, fragmentacin del ncleo y finalmente apoptosis (Steenkamp et
al., 2001).
El efecto citotxico ejercido por plantas del gnero Senecio en clulas mamarias
malignas, slo ha sido documentado para S. stabianus utilizando las clulas MCF-7,
provenientes de cncer de mama (Tundis et al., 2009). A pesar de que las plantas
mencionadas pertenecen todas al mismo gnero, no poseen el mismo efecto txico. Por otra
parte, el desconocimiento de las propiedades farmacolgicas de las especies endmicas de
nuestra zona, como la Chachacoma, no ha permitido explorar su potencial uso como agente
teraputico.
En resumen, el presente trabajo comprende el anlisis del efecto citotxico de un
extracto fitoqumico derivado de S. graveolens, planta conocida como Chachacoma, en lneas
celulares de cncer mamario. En este estudio consideramos la medicin de variables
importantes como el microambiente hipxico que es una de las constantes presentes en las
regiones tumorales. Por otra parte, evaluamos la relacin del efecto citotxico con los niveles
basales de Mn-superxido dismutasa (MnSOD), principal enzima antioxidante mitocondrial
que mantiene bajo control los niveles de radicales libres presentes en la clula. El
polimorfismo Val16Ala de SOD2, gen que codifica dicha enzima, se ha relacionado con
incapacidad de ciertos tipos de clulas de soportar un microambiente saturado con radicales
libres, razn por la cual tambin evaluamos su presencia. Las sustancias fitoqumicas
23

encontradas en la Chachacoma, sern efectivas como sustancias anticancergenas?; la

hipoxia tumoral podra ser utilizada como herramienta para crear un ambiente diferencial
para eliminar clulas malignas sin daar a las clulas normales que la rodean?; si causa algn
efecto citotxico, qu mecanismo de muerte celular utiliza?; la enzima MnSOD tiene alguna
relacin con la sensibilidad celular a una sustancia citotxica?. Estas son algunas de las
preguntas que intentaremos resolver en el presente estudio con el fin de buscar nuevas
sustancias de origen natural que puedan ser utilizadas en el tratamiento del cncer
Con todos estos datos nos hemos planteado la siguiente hiptesis: El extracto
fitoqumico de Senecio graveolens (Chachacoma) induce una respuesta citotxica diferencial
asociada a la enzima manganeso-superxido dismutasa presente en lneas celulares de
cncer mamario.

24

4.- OBJETIVOS

25

4.1

Objetivo general
Estudiar la respuesta citotxica del extracto de Senecio graveolens (Chachacoma)

asociada a la enzima manganeso superxido dismutasa en lneas celulares de cncer

mamario.
4.2

Objetivos especficos
En lneas celulares de cncer mamario:
1) Determinar la dosis letal al 50% (DL50) y las condiciones de experimentacin del
extracto crudo de Senecio graveolens.
2) Determinar la expresin proteica de MnSOD en respuesta a la exposicin del extracto
crudo de Senecio graveolens.
3) Determinar la presencia de la variante polimrfica Val16Ala de MnSOD.
4) Analizar la expresin de protenas relacionadas con muerte celular en respuesta a la
exposicin del extracto crudo de Senecio graveolens.

26

5.- MATERIALES Y MTODOS

27

5.1

Cultivo celular
Cuatro lneas celulares derivadas de cncer mamario fueron utilizadas en estos

estudios: ZR-75-1, MCF-7 y MDA-MB-231; como la contraparte normal se utiliz la lnea

celular MCF-10F, todas provienen del American Type Culture Collection (ATCC). La lnea
celular MCF-10F proviene de un tumor fibroqustico y es considerada una lnea no
tumorignica (Soule et al., 1990). Las lneas celulares ZR-75-1 y MCF-7 se aislaron de
pacientes con carcinoma ductal infiltrante (Engel et al., 1978). Y por ltimo, la lnea celular
MDA-MB-231 fue aislada desde un adenocarcinoma (Brinkley et al., 1980). Las ltimas tres
lneas celulares mencionadas se consideran tumorignicas. Los medios de cultivo utilizados
fueron los recomendados por la ATCC. Las lneas celulares se cultivaron en normoxia con
21% de O2 e hipoxia con 1% de O2, en ambos casos a 37C en una atmsfera hmeda y 5%
de CO2.
5.2

Curva de crecimiento y tiempo de doblaje

Para determinar el patrn de crecimiento y el tiempo de doblaje de las lneas celulares

se realiz una curva de crecimiento para cada una de ellas. Para ello, se sembr por
cuadruplicado una cantidad de 1 104 clulas en placas de cultivo de 24 pocillos. Las clulas
se cuantificaron mediante la tcnica de azul de tripano a las 12, 24, 48, 72, 96 y 120 hrs de
incubacin (Tirapelli et al., 2011). El tiempo de doblaje se calcul con el software Doubling
Time utilizando los datos obtenidos en la etapa exponencial de la curva de crecimiento (Roth,
2006).
5.3

Material vegetal
La planta conocida como Chachacoma (Senecio graveolens) fue recolectada en

sectores cercanos al Lago Chungar durante los meses de octubre y noviembre. Comprende
tallos, flores, hojas, races y semillas que fueron deshidratadas a la sombra a 20C durante 5
28

das a 4500 msnm. Finalizando este proceso el material vegetal seco contiene una humedad
de 15,66%.
5.4

Preparacin del extracto crudo de S. graveolens

El extracto etanlico de S. graveolens fue obtenido en los laboratorios de la Pontificia

Universidad Catlica de Chile. Para preparar la solucin stock de este extracto se disolvieron
192 mg en 2 ml de dimetilsufxido (DMSO) al 40% diluido en agua desionizada estril. Luego
se sonic a 37 KHz por 3 hrs a 37C en modo sweep (movimiento de tipo circular). Esta
solucin se centrifug a 4.000 rpm a 20C por 15 min. Despus, el extracto de Senecio se
traspas a microtubos de 1,5 ml. De esta manera se obtuvo una solucin madre de 95,9
mg/ml con un volumen final de 2 ml la que se almacen a 4C hasta su uso. Antes de iniciar
cualquier trabajo, esta solucin madre se volvi a sonicar a 37 KHz, por 30 min a 37C en
modo sweep.
5.5

Curva de dosis/tiempo respuesta al extracto fitoqumico de S. graveolens y dosis letal

50% (DL50)
Se realiz una curva de toxicidad para determinar la DL50 del extracto etanlico de S.
graveolens con distintos tiempos de exposicin. Para ello, se sembraron por cuadriplicado las
MCF-10F, en una cantidad de 1 104 clulas, en placas de cultivo de 24 pocillos y se
incubaron por 72 hrs para su asentamiento. Luego de que las clulas alcanzaron la fase
exponencial, se aplicaron los tratamientos con distintas dosis de extracto de S. graveolens en
un rango de 0 a 1,6 mg/ml con una concentracin final de 0,5% de DMSO en todas las
soluciones. Los perodos de exposicin fueron de 4, 12, 24 y 48 hrs en condiciones de
normoxia e hipoxia. Una vez finalizado los tratamientos, las clulas viables se evaluaron con
el ensayo de rojo neutro (Repetto et al., 2008). Para este efecto se realiz un lavado con PBS
estril y luego se cultivaron las clulas con una solucin de rojo neutro (40 g/ml) por 2 hrs en
la incubadora. Este colorante, que es captado por las clulas viables, se solubiliz con una
29

mezcla de desteido (50% de etanol, 1% cido actico en agua destilada), y luego

cuantificado mediante espectrofotometra a una longitud de onda de 550 m. La densidad
ptica registrada es directamente proporcional al nmero de clulas viables que se
encontraban en el cultivo. El porcentaje de viabilidad se calcul mediante la siguiente frmula:

Las DL50 y DL25 de cada tratamiento se calcularon con el programa GraphPad Prism,
versin 5.00 para Windows, utilizando las lneas de tendencia de las curvas obtenidas y a
partir de la frmula de la curva binomial se reemplaz la incgnita X hasta encontrar los datos
correspondientes a DL50 y DL25.
5.6

Tratamiento con extracto fitoqumico de Senecio graveolens

Las lneas celulares fueron tratadas con 0,2 mg/ml del extracto de S. graveolens,

correspondiente a la DL25, con una concentracin final de 0,5% de DMSO. El extracto

fitoqumico fue sonicado antes de preparar los medios de cultivo con el tratamiento, durante
una hora a 37C.
5.7

Anlisis de expresin proteica

Mediante la tcnica de western blot se analizaron los extractos proteicos de clulas

tratadas con 0,2 mg/ml de extracto crudo de S. graveolens por un perodo de 24 hrs. Las
protenas se extrajeron por medio de un buffer de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 130 mM
NaCl, 1% (w/v) NP-40, 1 mM fenilmetilsufonil fluoruro, 5 mM MgCl2, y 1 mM ortovanadato). La
concentracin proteica se calcul mediante el ensayo colorimtrico del cido bicinconnico. Se
carg un total de 20 g de protenas por lnea y se separ mediante electroforesis en un gel
de SDS-PAGE, para luego ser transferidas a una membrana de PDVF. La membrana fue
30

bloqueada con leche descremada durante 1 hr a temperatura ambiente e incubada toda la

noche a 4C con los siguientes anticuerpos: Bcl-2 (SC-7382), Caspasa 3 (SC-7272), Caspasa
8 (SC-7890) y MnSOD (SC-133134), todos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA,
EEUU). Las diluciones de los anticuerpos variaron de 1:200 a 1:1000. El anticuerpo
secundario, conjugado con peroxidasa de rbano (HRP), se utiliz en una concentracin de
1:5000 y se incubo por una hora a temperatura ambiente. La seal se detect mediante el uso
de un kit de quimioluminiscencia (Western Lightning Chemiluminescence Reagent kit, Pierce
Elmer, MA, EE.UU), el cual se us de acuerdo al protocolo del fabricante, sobre pelculas
fotogrficas (BioMax light film, Carestream Kodak, NY, EEUU). Como marcador de carga se
utiliz la protena -actina (A5316, Sigma-Aldrich, St. Louis, EEUU) con una dilucin de
1:10000.
5.8

Determinacin del polimorfismo Val16Ala de SOD2

Para la determinacin de la presencia del polimorfismo se realiz una extraccin de

ADN a todas las lneas celulares y mediante la tcnica de PCR, se amplific la zona que
comprende la secuencia seal mitocondrial del gen SOD2. Para ello, se utilizaron los
partidores con-sentido 5-ACC AAC CAG CAG GCA GCT GGC- y anti-sentido 5-GCG TTG
ATG TGA GGT TCC AG- (Akyol et al., 2004). El programa de PCR consisti en 35 ciclos de
desnaturalizacin a 95C por 1 min, alineamiento a 61C por 1 min, extensin a 72C por 2
min y una elongacin final a 72C por 7 min para obtener un producto de 107 pb. Luego, se
realiz una digestin con la enzima de restriccin NgoMIV que reconoce la secuencia 5GCCGCC- . Los amplicones se incubaron en presencia de NgoMIV a 37C durante 16 hrs,
pasado este tiempo la enzima se inactiv a 80C durante 20 min. Los fragmentos resultantes
de la digestin fueron de 89 y 18 pb para el polimorfismo Ala16 y de 107 pb para el
polimorfismo Val16. Estos productos de digestin se visualizaron en un gel de agarosa al 3%
con bromuro de etidio en tampn TBE.

31

5.9

Anlisis estadstico
Los anlisis estadsticos fueron realizados con la ayuda del programa informtico

GraphPad Prism, versin 5.00 para Windows.

Para demostrar si distintas concentraciones de oxgeno influyen en el comportamiento
de las curvas de dosis/tiempo respuesta se realiz un ANOVA de dos vas con un significancia
del 95% (p<0.05).
Para demostrar la influencia de los ambientes de normoxia e hipoxia en las DL50
calculadas para el extracto crudo de Chachacoma, se aplic el test t de student con una
significancia del 99% (p<0,01).
Para demostrar el efecto citotxico diferencial del extracto de Chachacoma sobre la
viabilidad de las distintas lneas celulares, se utiliz el test de ANOVA de una va aplicando el
test de comparacin mltiple de Dunnett con una significancia de 99% (p<0,01).
Los resultados fueron expresados en promedios desviacin estndar (DS).

32

6.- RESULTADOS

33

6.1

Tiempo de doblaje
Se realizaron curvas de crecimiento y tiempos de doblaje para poder estimar el

nmero inicial de clulas a cultivar para que las diferentes lneas celulares finalizaran el
experimento con un 70% de confluencia correspondiente a la etapa exponencial de su curva
de crecimiento.
En la Figura 2 se muestran los resultados obtenidos en la lnea celular no
tumorignica MCF-10F. Con los datos de la curva de crecimiento, se ajust una curva
exponencial con la que se calcul el tiempo de doblaje, resultando en 24,6 horas para MCF10F.

Figura 2.- Curva de crecimiento realizada a la lnea celular MCF-10F. En A) se presenta la curva
confeccionada en el laboratorio y en B) la curva generada por el software Doubling Time el cual
calcula y genera una regresin exponencial para determinar el tiempo de doblaje de las clulas. Las
barras de error corresponden a la desviacin estndar.

34

6.2

Curva de dosis/tiempo respuesta del extracto crudo de S. graveolens

En la Figura 3A se muestra el formato utilizado en esta experiencia. Las clulas se

cultivaron en placas de 24 pocillos, y para cada una de las concentraciones del extracto crudo
se realizaron cuatro rplicas. Se pudo apreciar, de manera cuantitativa, que la respuesta
celular fue dosis dependiente, ya que al aumentar la concentracin del extracto crudo de S.
graveolens, la cantidad de clulas teidas con rojo neutro disminuye de manera directamente
proporcional (Figura 3B).

Figura 3.- Curva de dosis/tiempo respuesta. A) Imagen representativa del

formato utilizado para la confeccin de las curvas. B) Imgenes
representativas de las clulas despus del ensayo de rojo neutro.

En este ensayo se realizaron cuatro tiempos de exposicin, con el objetivo de lograr

una visin global sobre el comportamiento celular ante el efecto del extracto crudo de S.
graveolens.
Como se puede observar en los grficos de la Figura 4, a las 4 hrs de exposicin no
existe una diferencia significativa entre los ambientes de normoxia y de hipoxia. Sin embargo,
se observa en el perodo de 12 hrs una diferencia estadsticamente significativa (p<0,05), y a

35

las 24 y 48 horas diferencias altamente significativas (p<0,01). Con estos datos se puede
afirmar de que las clulas son ms sensibles al efecto citotxico al extracto de Senecio
graveolens en un ambiente hipxico (Figura 4B).

Figura 4. Grficos obtenidos a partir de las curvas de dosis/tiempo respuesta al extracto crudo de
S. graveolens. En A) se presentan los datos obtenidos en un ambiente de 21% O2 y en B) los
datos obtenidos con un 1% de O2. Las barras de error corresponden a la desviacin estndar.

6.3

Clculo de dosis letal al 50% (DL50) en las clulas MCF-10F y estandarizacin de las
condiciones de trabajo con el extracto crudo de S. graveolens
Las DL50 se calcularon a partir de los datos obtenidos de las curvas de dosis/tiempo

respuesta. En la Figura 5, se presentan las dosis letales al 50% del extracto fitoqumico de S.
graveolens observadas en las distintas horas de exposicin y en los ambientes de 1 y 21% de
O2. A las 4 y 12 horas de exposicin la variable de oxgeno no influye sobre el valor de la DL 50
del extracto de Senecio. Con los datos graficados de DL50 se puede apreciar de manera ms
precisa que existe una respuesta celular diferencial ms sensible bajo hipoxia ante el efecto
citotxico de la Chachacoma. Interesantemente, a las 24 hrs de exposicin se observa que
existe una diferencia substancial de la citotoxicidad al comparar las condiciones de oxgeno
del cultivo (p<0,01). La lnea celular MCF-10F es ms sensibles al efecto citotxico del
extracto hasta en un 52.23% si esta se encuentra en un medio hipxico y, adems, esta
sensibilidad observada no aumenta con el tiempo de exposicin, puesto que a las 48 hrs la
36

DL50 permanece constante. Sin embargo, la DL50 obtenida en hipoxia es significativamente

menor a la obtenida en condiciones de normoxia (p< 0,01).
Con estos datos se logr estandarizar las condiciones de trabajo ptimos para el
tratamiento con el extracto de S. graveolens, concluyendo un tiempo de tratamiento de 24
horas, una dosis de trabajo de 0,2 mg/ml de extracto crudo el cual equivale a la DL25 en
condiciones de 1% O2.

Figura 5.- Dosis letales al 50% de S. graveolens. A) Grfica con los datos de dosis letales al 50%
del extracto crudo de S. graveolens. B) Determinacin de las condiciones de trabajo con extracto
rudo de S. graveolens en clulas MCF-10F. (*) Diferencia significativa (p<0,01). Las barras de error
corresponden a la desviacin estndar.

6.4

Efecto citotxico del extracto fitoqumico de S. graveolens en las lneas celulares

tumorignicas derivadas de cncer mamario
Una vez determinadas las condiciones de trabajo con el extracto de Senecio, fue

necesario corroborar si el tratamiento escogido (DL25) es capaz de matar a las clulas

malignas, con una dosis mnimamente txica para la lnea celular MCF-10F como contraparte
normal. Entonces, se realiz un ensayo de viabilidad con rojo neutro en todas las lneas
37

celulares despus de ser tratadas con la dosis de 0,2 mg/ml del extracto de Chachacoma por
un perodo de 24 hrs en condiciones de hipoxia.
La lnea celular normal, se mantuvo con una viabilidad de un 75%, mientras que las
clulas malignas ZR-75-1 y MCF-7 disminuyeron su poblacin viable hasta 9.26% y 5.95%,
respectivamente, sin existir diferencia significativa entre ambos. Sin embargo MDA-MB-231, la
lnea celular con el fenotipo ms agresivo, se ve afectada en menor grado por el tratamiento
disminuyendo a slo un 50,08% su poblacin viable (Figura 6). Las tres lneas celulares
malignas presentan bajas en su viabilidad que son estadsticamente significativas al ser
comparadas con la lnea celular normal (p<0,01).

Figura 6.- Efecto citotxico del extracto fitoqumico de S. graveolens. Tratamiento de

las lneas celulares de cncer mamario con 0,2 mg/ml del extracto (DL 25) en
condiciones de hipoxia (1% O2) durante 24 hrs. (*) Diferencia significativa entre grupos
experimental y grupo control MCF-10F (p<0,01). (**) Diferencia significativa entre
grupos experimentales (p<0,01). Las barras de error corresponden a la desviacin
estndar.

38

6.5

Efecto del extracto de S. graveolens sobre la expresin proteica de la enzima MnSOD

Al determinar que las lneas celulares malignas derivadas de cncer mamario se ven

afectadas por el tratamiento el compuesto fitoqumico de S. graveolens queda por resolver si

la expresin proteica de la enzima anti-oxidante MnSOD tena alguna relacin con la
capacidad de las lneas celulares de soportar el efecto de la sustancia fitoqumica. Para ello
se realiz un western blot con extractos proteicos de las clulas tratadas con 0,0 mg/ml y 0,2
mg/ml de extracto de S. graveolens.
Como se puede observar en la Figura 7, el extracto de S. graveolens no induce
cambios en la expresin proteica basal de MnSOD. Sin embargo, al comparar los niveles de
expresin de MnSOD de las lneas celulares con los niveles de viabilidad de la Figura 7, existe
una relacin directa entre los niveles de expresin basal de MnSOD y la resistencia a la
citotoxicidad del extracto fitoqumico. A mayor cantidad de protena anti-oxidante mayor es la
resistencia al efecto del extracto.

39

Figura 7.- Expresin proteica de MnSOD. A) Deteccin de los niveles de MnSOD en lneas celulares
de cncer mamario tratadas con extracto crudo de S. graveolens en condiciones de hipoxia. B)
Representacin grfica del grado relativo de luminiscencia de la expresin de MnSOD.

6.6

Determinacin de las variantes polimrficas Val16Ala de MnSOD

Dado que existen reportes que involucran la presencia del polimorfismo Val16Ala con

la disponibilidad de MnSOD en la mitocondria, se determin la presencia de esta variante en

las lneas celulares utilizadas en este trabajo.
En la Figura 8A se muestran los productos de PCR donde se amplific la secuencia
nucleotdica que presenta la variante polimrfica en estudio. Una vez que se tuvo certeza de
que los productos de PCR estaban en buenas condiciones, vale decir presencia de una banda
ntida sin ADN degradado observable, se prosigui con la digestin enzimtica utilizando la
NgoMIV para identificar los polimorfismos existentes. En el caso de que se encontrase el
polimorfismo Ala, la enzima corta el amplicn de 107 pb, dejando bandas de 89 y 17 pb como
40

sucedi en los casos de la MCF-7 y la MDA-MB-231. En caso de que la variante Val este
presente, la enzima no digiere el producto de PCR, dado que no este no posee la secuencia
consenso, como lo ocurrido en las clulas MCF-10F y la ZR-75-1.

Figura 8.- Determinacin de la variante polimrfica Val16Ala en el gen de SOD2 con

la enzima de restriccin NgoMIV. A) Gel de agarosa que muestra las bandas del
amplicn SOD2 para las diferentes lneas celulares. B) Gel de agarosa que muestra
las bandas de 107 y 89 pb obtenidas para las lneas celulares de cncer mamario.
Mpm: Marcador de peso molecular; pb: Pares de bases.

6.7

Anlisis de las protenas relacionadas con muerte celular

Con el objetivo de analizar si la disminucin de la viabilidad causada por el extracto

fitoqumico de S. graveolens es mediada por la va extrnseca de la apoptosis se realizaron

western blots para observar la expresin de caspasa -8.
El nivel de expresin proteica de pro-caspasa -8 (55 kDA) en la lnea celular MCF-10F
no present cambios con el tratamiento (Figura 9A). Por otra parte, la lnea celular MDA-MB-

41

231, que baj en un 50,08% su viabilidad, present una baja de expresin de la pro-caspasa 8 en un 41%. En el caso particular de las lneas celulares ZR-75-1 y MCF-7 los niveles de procaspasa -8 no parecen verse afectados por el tratamiento con el extracto crudo, pues
presentan bajos niveles basales de esta protena en comparacin a las lneas celulares MCF10F y MDA-MB-231. Sin embargo, en la lnea celular MCF-7 la seal de la caspasa -8
activada (18 kDA) aumenta considerablemente cuando es expuesta al extracto. Existen
diferencias en los niveles basales de la pro-caspasa -8 entre las lneas celulares, siendo
similares MCF-10F y MDA-MB-231 entre s, cabe destacar la similitud en la expresin basal
entre ZR-75-1 y MCF-7, clulas que disminuyeron considerablemente su poblacin viable con
este tratamiento de Chachacoma (0,2 mg/ml).

Figura 9.- Expresin proteica de Caspasa -8. A) Deteccin de los niveles de Caspasa -8 en
lneas celulares de cncer mamario tratadas con extracto crudo de S. graveolens en condiciones
de hipoxia. B) Representacin grfica del grado relativo de luminiscencia de la expresin de
Caspasa -8.

En el caso de la caspasa -3, se observa que existe una diferencia en los niveles
basales de esta protena en las distintas lneas celulares, destacndose la nula seal en la
lnea MCF-7 y el alto nivel de expresin en MDA-MB-231 (Figura 10). Se observaron cambios

42

sutiles a nivel de la pro-caspasa 3 con el tratamiento de Chachacoma en las lneas celulares

ZR-75-1 y MDA-MB-231, con una disminucin en la intensidad de la seal de un 28 y 17%
respectivamente. Con el nivel de deteccin utilizado en estos experimentos no fue posible
hallar la seal de la caspasa 3 activada, de aproximadamente 17 kDa, hallndose slo la
seal de la pro-caspasa -3 con un peso de 34 kDa.

Figura 10.- Expresin proteica de Caspasa -3. A) Deteccin de los niveles de Caspasa -3 en lneas
celulares de cncer mamario tratadas con extracto crudo de S. graveolens en condiciones de hipoxia.
B) Representacin grfica del grado relativo de luminiscencia de la expresin de Caspasa -3.

En la Figura 11, se muestran los resultados del anlisis de expresin de la protena

Bcl-2. Se puede apreciar una banda de 33 kDa, que corresponde a la forma fosforilada de
esta protena en las lneas celulares MCF-7 y MDA-MB-231, no as en MCF-10F y ZR-75-1.
En las lneas celulares tratadas con el extracto crudo se aprecia un aumento en la intensidad
de la seal de la forma fosforilada en un 30% en la lnea MCF-7 y en un 34,9% en el caso de
MDA-MB-231.

43

Figura 11.- Expresin proteica de Bcl-2. A) Deteccin de los niveles de Bcl-2 en lneas celulares de
cncer mamario tratadas con extracto crudo de S. graveolens en condiciones de hipoxia. B)
Representacin grfica del grado relativo de luminiscencia de la expresin de Bcl-2.

44

7.- DISCUSIN

45

Los niveles de oxgeno al interior de un tumor, y en general en los tejidos normales,

no son de un 21% de O2, sino que corresponden a niveles mucho ms bajos, entre 5% en
tejidos del crvix uterino a 13% en los alveolos pulmonares, incluso hay de 0,1% y menos
(Vaupel et al., 2007). Existen mucho reportes que indican que los pacientes que poseen
tumores hipxicos generalmente tienen un mal pronstico, independiente de parmetros
clnicos habituales como grado de malignidad, fenotipo o estado de los ganglios centinela
(Vaupel, 2009). La hipoxia provoca en estos paciente una resistencia a la radioterapia (Moeller
et al., 2007) y quimioterapia (Rohwer y Cramer, 2011), permite el crecimiento de clulas con
una menor respuesta a estmulos apoptticos (Graeber et al., 1996), produce una
desdiferenciacin de las clulas estimulando el fenotipo agresivo (Vaapil et al., 2012) y
promueve tambin la angiognesis, metstasis e inestabilidad genmica (Semenza, 2012).
Por estas razones, se opt por realizar los experimentos de las curvas de dosis/tiempo
respuesta en dos ambientes controlados de 1 y 21% de O2, para observar si el extracto de
Senecio graveolens induce un efecto citotxico de manera diferencial en ambos ambientes. El
extracto fitoqumico mostr ser ms efectivo bajo condiciones de hipoxia en un tiempo ptimo
de tratamiento de 24 horas, disminuyendo la poblacin viable de MCF-10F, en comparacin a
la dosis obtenida en condiciones de normoxia en el mismo tiempo de exposicin. Cul es el
mecanismo por el que el extracto crudo de Chachacoma es ms eficaz en condiciones de
hipoxia?, deber ser objeto de futuros estudios as como tambin el compuesto especfico que
posee la actividad citotxica.
La dosis utilizada en este experimento, correspondiente al DL25 (0,2 mg/ml), fue capaz
disminuir la poblacin viable de las lneas celulares malignas ZR-75-1 y MCF-7 en un 9.26% y
5.95%, respectivamente, manteniendo un 75% de viabilidad en la lnea celular control MCF10F. Se ha probado el efecto citotxico de otro miembro del gnero Senecio en la lnea celular
MCF-7, el Senecio stabianus, el cual tuvo la habilidad de disminuir la viabilidad celular en un
50% con una dosis de 91,1 g/ml de extracto metanlico (Tundis et al., 2009). Si bien la dosis
utilizada en este trabajo est por sobre las DL50 de los frmacos como Vinblastine, DL50 de 25
M en MCF-7 (aproximadamente 0,02 g/ml), y paclitaxel, DL50 de 35 M en MCF-7
46

(equivalente a 0,0 g/ml) (Gruber et al., 2001), es la primera aproximacin con auspiciosos
resultados en la investigacin de nuevos compuestos activos que podran ser extrados desde
la Chachacoma, planta nativa de la regin de Arica y Parinacota, con un potencial uso anticancergeno y que, adems, acta de manera ms eficiente en un ambiente hipxico.
Las clulas para sobrevivir a la hipoxia, activan un sin nmero de mecanismos para
lidiar con el ambiente hostil. Muchos de estos mecanismos de respuesta, son mediados por
los factores inducibles de hipoxia (HIFs, del ingls Hypoxia-Inducible Factors) compuestos por
las subunidades alfa (HIF-) y beta ( I -) (Keith y Simon, 2007). Bajo condiciones de hipoxia
HIF-, se estabiliza y heterodimeriza con I - en el ncleo, este complejo proteico se une a
los elementos responsivos de hipoxia (HREs, del ingls Hypoxia Response Elements) y
modula la expresin de mltiples genes que son importantes para la angiognesis,
supervivencia celular y tumorignesis (Pouyssegur et al., 2006). Se sabe que la lnea celular
MDA-MB-231, bajo condiciones hipxicas es capaz de expresar la protena anhidrasa
carbnica IX (CAIX, del ingls Carbonic Anhydrase IX Protein) (Li et al., 2009). CAIX es una
enzima anclada a la membrana citoplasmtica que cataliza de forma reversible la hidratacin
del CO2, est ligada al control del pH tumoral extra e intracelular, y es expresada
selectivamente en los tumores hipxicos (Chen et al., 2010). Es posible que la expresin de
esta protena en la lnea celular MDA-MB-231 le confiera un fenotipo ms agresivo en
comparacin a las otras lneas celulares tratadas en este experimento y le ayude no slo a
sobrevivir ante el efecto txico del extracto de S. graveolens sino que tambin al ambiente
hipxico al que se expuso. Sin embargo, existen reportes en el cual la lnea celular MCF-7 y
ZR-75-1 son capaces de inducir la expresin de CAIX en un ambiente hipxico, pero MDAMB-231 tiene la particularidad de poseer un nivel basal mayor de CAIX en comparacin a
MCF-7, HCC1395 y HCC1937, estas dos ltimas, correspondientes a lneas celulares
mamarias provenientes de cncer de tipo ductal (Chen et al., 2010).
La expresin proteica de MnSOD no se vio afectada por el tratamiento de Senecio, sin
embargo la respuesta celular se ve dependiente de los niveles basales de esta protena. Ante
47

un alto nivel basal de MnSOD, las clulas parecen tolerar mejor el efecto citotxico de
Senecio en comparacin a las lneas que poseen bajos niveles basales de esta protena. Los
niveles basales encontrados en este experimento en las lneas MDA-MB-231 y MCF-7
concuerdan con los reportados en otros trabajos (Ennen et al., 2011; Kattan et al., 2008).
MnSOD juega un rol importante en el desarrollo del cncer dependiendo de su nivel basal.
Bajos niveles de esta enzima en clulas malignas se correlacionan con una alta tasa de
crecimiento celular y altos niveles de esta protena se asocian con la capacidad de invasin y
metstasis que adquieren estas clulas malignas al incrementar sus niveles de H2O2
producidos por MnSOD, lo que activa la expresin de las metaloproteasas (MMP), adquiriendo
un fenotipo ms agresivo (Nelson et al., 2003; Ridnour et al., 2004). Por consiguiente, es
probable que esta pueda ser una de las causas por la que la lnea celular MDA-MB-231 sea
ms resistente ante el efecto del fitoqumico en comparacin a las lneas ZR-75-1 y MCF-7
que poseen niveles basales menores de MnSOD. Ante estos antecedentes es posible plantear
que el mecanismo de accin del extracto fitoqumico de la Chachacoma est relacionado con
las vas de estrs oxidativo, ya que su efecto citotxico se ve influenciado por los niveles
basales de la enzima MnSOD.
Uno de los polimorfismos ms estudiados que se presenta en el gen SOD2 es
Val16Ala, que produce cambios conformacionales en la secuencia seal que dirige la protena
a la mitocondria. Se considera como un factor de riesgo el poseer el polimorfismo Ala, puesto
que al ser ms eficiente en el transporte de MnSOD al interior de la mitocondria, producira un
desbalance en la generacin de perxido de hidrgeno y por ende un aumento en las
mutaciones y una resistencia a la apoptosis (Bag y Bag, 2008; Dasgupta et al., 2006). Sin
embargo, en este trabajo las lneas celulares MCF-7 y MDA-MB-231 poseen este polimorfismo
y presentan grandes diferencias. Primero, sus expresiones proteicas de MnSOD son distintas
entre s y, adems, reaccionan de distinta manera ante el efecto citotxico del extracto
fitoqumico de Senecio graveolens en funcin a sus niveles basales de esta protena. Cabe
destacar que variadas investigaciones no asocian la sola presencia de este polimorfismo
como un factor de riesgo, sino ms bien se asocia a otros factores como, por ejemplo, el uso
48

de terapia de reemplazo hormonal (Liu et al., 2012), o la presencia de otros polimorfismos en

las protenas relacionadas con la detoxificacin de H 2O2 (Cox et al., 2006). La diferencia que
se observa entre las clulas con el polimorfismo Ala puede tambin asociarse a la expresin
de receptores como lo son el receptor estrognico (ER), de progesterona (PgR) y ErbB2, ya
que MDA-MB-231 se caracteriza por ser triple negativa y ms agresiva en comparacin a
MCF-7 que es positiva para ER y PgR. An hay mucha controversia respecto a esto debido a
que tambin hay investigaciones que no encuentran un nexo entre la presencia de los
polimorfismos y factores de riesgo (Bag y Bag, 2008).
Al analizar las protenas relacionadas con la apoptosis las caspasas -3 y -8,
observamos que en el caso de la caspasa -8 todas las lneas celulares poseen distintos
niveles basales de esta protena, y slo se observa en la lnea celular MCF-7 tratada con el
extracto fitoqumico la caspasa -8 activada, no as en MCF-10F, ZR-75-1 y MDA-MB-231. Con
este resultado se presume que en el caso particular de la lnea celular MCF-7 el extracto
fitoqumico de Senecio graveolens estara activando la va extrnseca de la apoptosis.
Dado que la caspasa -8 es una protena clave en la activacin de esta va apopttica,
era necesario corroborar si la disminucin en la viabilidad celular mediada por el tratamiento
con Chachacoma activaba la apoptosis en general, se analiz tambin la expresin de la
caspasa -3, protena que es considerada junto con la caspasa -7 como protenas efectoras de
la apoptosis (Elmore, 2007). En el caso de la lnea celular MCF-7 no se observ la seal de
esta protena, lo que concuerda con los datos encontrados anteriormente por otros
investigadores que detectaron la delecin del gen que expresa esta protena CASP-3
(Janicke, 2009). Incluso esta delecin no afecta el proceso de apoptosis, puesto que las
protenas que son clivadas por ella son escindidas de igual modo en su ausencia (Janicke et
al., 1998). Por otra parte, el alto nivel de pro-caspasa -3 detectado en la lnea celular MDAMB-231 concuerda con reportes anteriores (Vegran et al., 2011). Dado que no fue posible
detectar la seal de la caspasa -3 activada en ninguna de las lneas celulares, se analiz la
diferencia en la expresin de la pro-caspasa encontrndose discretas diferencias en las lneas
49

celulares ZR-75-1 y MDA-MB-231; las clulas tratadas disminuan la expresin de procaspasa -3 en comparacin a las no tratadas, lo que se puede atribuir al clivaje de esta
protena activada por la apoptosis. Puede que la ausencia de caspasa activada, este dada por
una temprana activacin de esta protena, la que no es posible apreciar a las 24 horas de
tratamiento con Chachacoma. El procesamiento temprano de las caspasas se ha observado
en lneas celulares provenientes de cncer mamario tratadas con el compuesto feniletil
isotiocianato, el cual fue capaz de inducir el procesamiento proteoltico de las caspasas -3 y -9
desde las 4 horas de exposicin (Syed Alwi et al., 2012).
Para corroborar la activacin de la apoptosis, se puede analizar la expresin de Bcl-2,
esta protena anti-apopttica que al ser fosforilada pierde su capacidad de interactuar con las
protenas pro-apoptticas y por ende de frenar el inicio de la apoptosis (Tamura et al., 2004).
Los resultados encontrados en la lnea celular MCF-7 concuerdan con los datos de caspasa 8, ya que en las clulas tratadas con el extracto de Senecio aumenta la cantidad de Bcl-2
fosforilado, situacin que tambin se puede apreciar en la lnea celular MDA-MB-231. Es
posible que en el caso particular de la lnea ZR-75-1 el extracto crudo est disminuyendo la
viabilidad celular mediante un mecanismo alternativo al de la apoptosis. Si el extracto crudo
de Senecio graveolens acta bajo un mecanismo que se relaciona con estrs oxidativo se
podra especular que la ZR-75-1 este disminuyendo por un proceso de muerte celular
mediada por autofagia. Se ha demostrado que las especies reactivas de oxgeno pueden
regular la induccin de la autofagia y con esto promover la supervivencia o la muerte celular.
El control que ROS ejerce sobre la autofagia inducida por la escasez de alimentos lo hace
mediante la regulacin de Atg4. Esta protena es responsable de la desconjugacin de LC3II,
al inactivarse Atg4, por medio de la oxidacin causada por el aumento de ROS, se promueve
la formacin de autofagosomas (Scherz-Shouval et al., 2007). Las especies reactivas de
oxgeno pueden promover la muerte celular mediada por autofagia por medio de la
eliminacin selectiva de catalasa (Yu et al., 2006) y en respuesta al factor de necrosis tumoral
alfa (TN ) (Djavaheri-Mergny et al., 2006).

50

Aunque la hipoxia en si es un factor de mal pronstico, tambin existen casos en

donde un ambiente hipxico es capaz de producir una sensibilidad aumentada frente a
algunas drogas (Wilson y Hay, 2011). Es el caso de las llamadas pro-drogas bioreductivas, las
cuales se activan selectivamente en ambientes hipxicos. Un buen ejemplo de ello es el
compuesto aromtico N-xido tirapazamina, el cual es de 50 a 200 veces ms txico en
cultivos hipxicos que en normxicos (Brown, 1993). Tambin se ha establecido como foco de
estudio la inhibicin de protenas que se expresan selectivamente en ambientes hipxicos,
como lo es el caso de los factores de transcripcin de la familia HIFs (Poon et al., 2009;
Semenza, 2003).
Reportes han mostrado cmo un derivado de estrgeno es capaz de matar
selectivamente clulas leucmicas y no as linfocitos normales mediante la inhibicin de las
enzimas superxido dismutasas, plantendolas como un blanco molecular que elimina
selectivamente clulas malignas (Huang et al., 2000). Dado que en esta investigacin se
observan altos niveles basales de MnSOD en la lnea MDA-MB-231, la cual es ms resistente
al efecto citotxico del extracto de Chachacoma, queda planteada la siguiente interrogante:
sera ms efectiva la actividad citotxica del extracto de Senecio graveolens si se inhibe o
disminuye el nivel basal de esta enzima?.
La naturaleza ha mostrado ser una excelente fuente de nuevas drogas, incluyendo
agentes anti-tumorales. Aproximadamente, el 60% de las quimioterapias utilizadas de alguna
u otra manera provienen de fuentes naturales incluyendo las plantas (Cragg y Newman, 2005;
Srivastava et al., 2005; Stankovic et al., 2011). Este reporte constituye un primer gran paso en
la exploracin del potencial anti-tumoral que esconde la Chachacoma.

51

8.- CONCLUSIONES

52

El presente trabajo es el primer reporte que involucra el efecto citotxico de un

extracto fitoqumico aislado desde Senecio graveolens sobre lneas celulares de cncer
mamario.
Este extracto, es capaz de actuar de manera diferencial dependiente de los niveles de
oxgeno, siendo ms activo en un ambiente hipxico sobre las clulas de cncer mamario.
El extracto de Chachacoma es capaz de disminuir la viabilidad de las lneas celulares
ZR-75-1 y MCF-7 en ms de un 90%, esta disminucin es dependiente de los niveles basales
de MnSOD, ya que en las clulas que poseen mayor cantidad de esta protena, su nivel de
viabilidad no disminuye de forma tan considerable como lo fue en el caso de MCF-10F y MDAMB-231. Un posible mecanismo de accin de este extracto estara basado en la generacin
de radicales libres o en la interaccin con esta enzima antioxidante.
El mecanismo por el cual el extracto crudo de Senecio estara disminuyendo la
poblacin celular sera mediante la activacin de la apoptosis en las lneas celulares malignas
MCF-7 y MDA-MB-231. En el caso particular de la lnea MCF-7 se est activando la va
extrnseca de la apoptosis. Dado que no se observan cambios en las protenas relacionadas
con apoptosis en la lnea ZR-75-1, se sugiere una muerte celular alternativa a la apoptosis.
Queda por dilucidar cul o cules son los compuestos activos que estn ejerciendo la
actividad anti-tumoral del extracto fitoqumico de Senecio graveolens y qu mecanismo de
accin poseen, adems de esclarecer su interaccin con la enzima MnSOD, para as
encontrar la forma de sensibilizar la lnea celular MDA-MB-231 ante el efecto citotxico de
este extracto, tal vez disminuyendo la expresin basal de esta enzima. Adems, queda la
interrogante de cmo la lnea celular ZR-75-1 disminuye su poblacin viable por efecto del
extracto de Chachacoma.

53

9. REFERENCIAS

54

Acehan, D., et al. (2002). Three-dimensional structure of the apoptosome: implications for
assembly, procaspase-9 binding, and activation. Mol Cell, 9(2), 423-432.
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