x 10
envueltas. El MVL2 aislado, contiene una cadena doble de DNA en una sper
6
nico aislado del grupo 3 es MVL3. Este virus es una partcula polidrica
desnuda (alrededor de 60nm de dimetro) con una cola corta (alrededor de
25nm de largo) que contiene una hebra doble de DNA.
Estudios de los ciclos infecciosos de los grupos 1 y 2 de los Mycoplasma virus
(revisado por Maniloff et al., 15) han mostrado que ambos grupos son virus no
citocidas: las clulas infectadas continan creciendo mientras liberan la
progenie de los virus. En un reporte preliminar sobre el ciclo de infeccin del
MVL3, Liss, (13) not que las clulas infectadas mueren.
Aqu reportamos los estudios sobre el ciclo infeccioso del MVL3 mostrando que,
mientras las clulas infectadas ya no son ms viables (es decir, ya no son
capaces de formar colonias) la progenie del virus continua siendo liberada de
stas clulas durante varias horas. Este tipo de ciclo infeccioso se asemeja a
los virus citocida de animales no lticos en lugar de los bacterifagos lticos.
Tambin se presentan datos sobre la estructura del virion y del DNA viral.
MATERIALES Y MTODOS
Medios y Reguladores (solucin amortiguadora). Caldo
(contenido por litro: 20g de triptosa [Difco], 5 g de Tris, 5g de NaCl,
glucosa y 10mL de suero fraccin PPLO [Difco], y las placas de agar
(contienen: agar al 1% [Difco] en caldo triptosa) fueron utilizados para
clulas segn lo descrito por Maniloff (14).
triptosa
10g de
triptosa
cultivar
13
10
14
5 x 10
cultivo.
Determinacin del ttulo de virus y clulas. EL nmero de clulas viables
fueron determinadas contando las unidades formadoras de colonias (UFC) en
agar triptosa. Para minimizar el posible error de conteo debido a la tendencia
del micoplasmas de agregarse en un medio lquido, antes de sembrar en
placas la suspensin de clulas fue suavemente sonicada, colocando el tubo
del cultivo, en un bao de sonificacin (Industrias de ultrasonidos). La
dispersin de los agregados multicelulares fue seguida por microscopa de
contraste de fases. Las colonias generalmente eran visibles despus de 4 das
de incubacin en agar triptosa a 37C, fueron contadas despus de teirlas con
colorante de Dienes diluido (18).
Las partculas del virus MVL3 se evaluaron como UFP (unidades formadoras de
placas) en un agar blando recubriendo placas de agar triptosa: 0.1mL de
muestras de virus diluidas fueron mezclados con 0.1mL de un cultivo celular de
una noche y 1mL de caldo triptosa. La mezcla se calent brevemente a 45C y
se agreg 1mL de agar al 0.7% TES mantenido a 45C. La suspensin
resultante fue vertida en una placa con agar triptosa. Por este mtodo las
placas pudieron ser contadas despus de 24 horas de incubacin a 37C.
Adsorcin del virus: El virus (diluido 1:5) fue aadido a las clulas con una
MOI de 1. Las muestras fueron tomadas cada 5 minutos, filtrados a travs de
un filtro con membranas de 0.2 m (Sartorius) para remover clulas y virus
adsorbidos, y analizado para UFP. Se calcularon las constantes de adsorcin de
primer orden segn lo descrito por Sten (19).
Crecimiento de un solo paso. El protocolo de Delbriik (2) fue usado. El
virus (diluido 1:5) fue aadido a las clulas en un MOI de alrededor de 0.1,
despus 30 minutos a 37C, para permitir la adsorcin del virus, el cultivo
infectado se diluy
106
104 a 105
por Ellis y Delbriick (4). Aunque el protocolo original de estallido simple utiliza
un MOI muy bajo, el experimento con MVL3 tuvo que utilizar una MOI ms alta
debido a los grandes tiempos de incubacin requeridos. Las clulas fueron
infectadas con un MOI de 1. Despus de 30 minutos la suspensin de clulas
fue diluida
10
200 muestras de 1mL: 100 muestras de 1mL fueron analizadas para UFP
despus de 8 horas de la infeccin y 100 fueron analizadas despus de 48
horas de infeccin.
Cintica de estallido simple. Para medir la cintica de la produccin del
virus, solo por clulas infectadas. 20 unidades de filtrado Millex (Millipore Co:
tamao del poro, 0.2Lm) fueron inoculadas cada una con un promedio de
menos de una clula infectada. Para esto, se prepar una solucin de clulas
diluidas como se describe en el experimento de estallido simple y fue filtrada a
travs de cada unidad Millex. Por lo tanto, cada filtro recibi cero o una clula
infectada. Una jeringa de 20mL con caldo triptosa fue montada en la parte
superior de la unidad de filtro, y una jeringa vaca de 5mL fue conectada en el
fondo del filtro por una pieza esteril de tubera Tygon. (Fig.1). Despus de 4, 8 y
24 horas de incubacin, 1mL de caldo triptosa se agreg a travs del filtro,
usando la jeringa inferior para generar una filtracin con presin negativa y
analizarlas para UFP. En cada tiempo 5mL de caldo triptosa fueron vertidos a
travs del filtro para remover cualquier virus libre restante del filtro. Se
encontr que la mayora de la progenie del virus fue removida del filtro en el
primer mL de muestra que se retir en cada tiempo. Despus de 5mL
subsecuentes de lavado (que contena de 0 a UFP/5mL) no mas UFP pudieron
ser removidas. Por lo tanto, el virus removido de un filtro en tiempos
posteriores representa que recin se liberaba el virus.
Microscopa electrnica. (i) Tincin negativa. El virus purificado fue
adsorbido a las redes de microscopio de electrones de carbono recubierto y
teido negativamente con cido fosfotngstico (pH 7.0). Micrografas
electrnicas similares fueron obtenidas con acetato de uranilo acuoso (80.5%).
Las fotografas fueron tomadas a 50,000x aumentos con iluminacin de campo
brillante en un Siamens Emilskop 102 en 80kV con un objetivo de 40m de
apertura.
(ii).Medida del DNA. Para la medida del DNA, se us el procedimiento de
Kleinschmidt (11). El virus purificado fue disociado en una reserva conteniendo
1011
agitando gentilmente. Despus de la separacin de fases, el dodecil sulfatofenol de sodio fue removido por dilisis contra TES. La solucin resultante del
DNA fue diluida 1:10 en una solucin conteniendo acetato de amonio 0.5M
(concentracin final) y 0.1mg de citocromo c por mL. Una cantidad de 50L de
esta solucin fue difundida en una hipofase de acetato de amonio 0.25M y
recogida con rejillas revestidas de carbono. Estas fueron teidas con
5 x 10
102 fue hecha sin estar en campo oscuro o en campo brillante despus de
rotar sombreadamente con Pt-Pd. El microscopio se calibr con una rejilla
replica. Se midieron las molculas de negativos proyectados con una
computadora Wang 2200 equipada con un digitalizador PenX (Zscherbel,
Germany).
Resultados
Estudios estructurales. Las partculas del virus teidas negativamente son
polidricas, cerca de 60nm de dimetro (fig.2). Los viriones tiene una cola
corta, cerca 20nm de largo y 10nm de dimetro, adjuntados en un collar de
alrededor 8nm de espesor y 16nm de ancho. Con frecuencia las fibras son
vistas, generalmente aparecen estar fijadas en el collar. An no ha sido posible
determinar ya sea la longitud, o el nmero de fibras por virin.
Las molculas de DNA purificadas del MVL3 son lineales. Las mediciones de la
longitud del contorno de 93 molculas (fig.3) dio un peso molecular estimado
6
de (26+- 0.6) x 10
Adsorcin del virus. La adsorcin del virus MVL3 sigue una cintica de
primer orden, el nmero de UFP no adsorbidas durante la adsorcin disminuye
exponencialmente (datos no mostrados). La tasa de primer orden de la
constante K fue calculada de estos experimentos y se encontr que es de
clulas infectadas. Las mediciones del crecimiento del virus durante tiempos
largos (fig.5) indican que las partculas del virus son liberadas de las clulas
infectadas en un periodo de 10 a 15 horas. Cerca de 10 a 15 horas despus de
la infeccin se alcanza una meseta en ttulo de virus que permanece sin
cambios por al menos otras 27 horas. Puesto que el ttulo final de virus es 120
veces ms alto que el nmero de centros infecciosos medidos despus de la
adsorcin, el rendimiento promedio del virus fue alrededor de 120.
Despus de 24 horas de infeccin, el cultivo sigue ligeramente turbio. En un
microscopio de contraste de fases, partculas del tamao de clulas de A.
laidlawii an podan ser reconocidas junto con esferas translucidas de
dimetros arriba de 10m. Ningn aumento adicional en la turbidez fue
observado despus de varios das de incubacin.
Lisis artificial. La posible existencia de partculas infecciosas intracelulares
del virus durante el periodo latente fue examinada por lisis artificial de clulas
infectadas (fig.6). Considerando la liberacin fisiolgica del virus como se
muestra en los experimentos de crecimiento en un solo paso comienza 90
minutos despus de la infeccin, las partculas maduras pueden ser
demostradas alrededor de los 70 minutos despus de la infeccin por lisis
artificial de las clulas infectadas. A partir de 3 horas de este experimento, el
ttulo del virus intracelular fue siempre ms alto que el ttulo del virus libre,
indicando que la maduracin y la liberacin del virus contina en estas clulas
infectadas.
El experimento no fue continuado por ms de tres horas, puesto que despus
de este tiempo la reinfeccin podra afectar la cintica observada.
Estallido simple. Las clulas infectadas en una MOI baja, fueron diluidas en
200 tubos, tales que cada tubo reciba un promedio de menos de una clula
infectada (tabla 1). La mitad de los tubos fueron analizados para UFP despus
de 8 horas y la otra mitad fueron analizados despus de 24 horas. Los datos
son mostrados en la tabla 1 y en la figura 7.
Los anlisis de estos datos (son descritos por Ellis y Delbruck [4]) muestran que
cada tubo haba recibido un promedio de 0.63 clulas infectadas; por lo tanto,
estadsticamente en cada tiempo, 37 tubos reciban 1 clula, 9 reciban 2
clulas, y 1 reciba 3 clulas. De estos datos, el promedio del rendimiento del
virus por clula infectada fue de 140 despus de 8 horas de la infeccin y 236
despus de 24 horas. Esto es ms alto que lo estimado por el experimento de
crecimiento a tiempos largos (fig.5) donde la MOI alta podra haber reducido el
rendimiento del virus.
Los datos de estallido simple indican que los virus MVL3 son liberados de las
clulas infectadas durante un tiempo extendido por mecanismos de liberacin
no lticos en lugar de una sola explosin.
Cintica de estallido simple. Para confirmar la conclusin de que las clulas
infectadas individuales producen virus durante un periodo extendido, la
produccin del virus en clulas infectadas individuales fue analizada en varios
tiempos durante 24 horas. Veinte filtros fueron cada uno inoculados con
muestras de 1mL preparadas como se describe en el experimento de estallido
simple. El filtrado de cada filtro fue analizado para UFP A 3, 8 Y 24 horas de
infeccin. Los datos obtenidos en un experimento tpico son mostrados en la
Tabla 2. Puesto que en siete de los filtros se encontr que no contenan clulas
infectadas (Tabla 2), estadsticamente por una distribucin de Poisson, siete
filtros recibieron una clula infectada, cuatro recibieron dos clulas infectadas,
uno recibi tres clulas infectadas, y uno recibi cuatro clulas infectadas.
Puede verse que la aparicin y la tasa de liberacin del virus de clulas
individuales como en funcin del tiempo de infeccin son altamente variables.
Cada clula que comienza a producir el virus durante el transcurso de un
experimento contina hacindolo a travs del ltimo punto de datos.
La viabilidad de clulas infectadas con MVL3. Las clulas K2 y el virus se
mezclaron en una MOI de 10 y se incubaron a 37C. Se tomaron muestras justo
antes de la adicin del virus y durante la infeccin y analizadas por UFC. El
nmero de UFCs disminuye rpidamente despus de la adicin del virus
(fig.8): la fraccin superviviente fue de
105
103
despus de 30 minutos y de
26 x 10
25 x 106
Daltones.
En
estos
estudios,
la
constante
experimentalmente encontrada de
tasa
3 x 10
10
de
adsorcin
del
MVL3
fue
2 x 109
mayor que los resultados experimentales. Esto indica que la adsorcin requiere
un alto grado de especificidad en la interaccin virus-clula.
Diferente de otros Mycoplasmavirus que han sido descritos (e.g., Maniloff et al.,
15), el MVL3 mata a sus clulas husped. Pero en contraste con otros
bacterifagos el MVL3 no tiene un ciclo ltico clsico. En su lugar, las clulas
infectadas con MVL3, aunque ya no son viables (en el sentido de ser UFC)
continan para liberar la progenie del MVL3 durante varias horas. Una
examinacin individual de clulas infectadas en un estudio de cintica de
estallido simple, mostr que la tasa de liberacin del virus fluctu durante el
tiempo que la clula estuvo produciendo el virus. Esto podra ser explicado por
un modelo en el cual una clula infectada, y en lugar de continuar liberando la
progenie del virus, libera a los virus en pulsos, en cada pulso siendo la
liberacin de un nmero variado de virus. Coherente con este modelo, nuestros
estudios preliminares de microscopia electrnica sugieren que un fragmento de
una clula infectada podra producir vesculas de membranas rodeando
partculas de los virus separadas del resto de las clulas. Por lo tanto, la
interaccin virus-clula infectada del MVL3 se asemeja a esos virus citocidas no
lticos de animales.
La liberacin total de virus por clula infectada (medida en experimentos de
estallido simple) se encontr que vara sobre un rango de 100 veces de clula a
clula. Adems el rendimiento para este virus es diferente entre las clulas, el
experimento de estallido simple mostr que el tiempo en que una clula
individual infectada comienza a liberar el virus vara de clula en clula.
Al comienzo de estos estudios, usando lo que sabemos, han sido ligeramente
favorables las condiciones de crecimiento celular, un periodo de latencia ms
largo y una produccin de virus ms pequea fueron observados y dados en un
reporte preliminar. (K. Haberer, 1978 Fourth Int. Congr. Virol. Abstr.,p. 173).
Problemas fisiolgicos similares y clulas husped de diferentes cepas podran
explicar la pequea produccin del virus MVL3 reportado por Lyss (12). En el
desarrollo el protocolo experimental usado en los estudios reportados aqu, se
encontr que, para obtener curvas de crecimiento del virus, reproducibles y
buenas producciones del virus, debe tenerse cuidado de asegurar que las
clulas husped estn creciendo activamente en el tiempo de infeccin.