Anda di halaman 1dari 21

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN SEDERHANA
Senin, 3 Maret 2015
Kelompok I
Senin, Pukul 13.00 16.00 WIB

Nama

NPM

Prasetyo Dwi A.P.

260110130135

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI


FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2015

Nilai

TTD

(Dhiya) (Emanuel) (Puspagita)

I.

TUJUAN
Mengamati ukuran, bentuk dan struktur-struktur tertentu dari
bakteri, dengan menggunakan satu macam zat pewarna.

II.

PRINSIP
1. Teknik aseptis
Teknik aseptis adalah proses tanpa kontaminasi untuk menjamin
preparasi bebas dari mikroba kontaminan. Tekink aseptis
digunakan sepanjang percobaan berlangsung baik alat, bahan,
lingkungan sekitar, maupun praktikan. Untuk alat dan bahan dapat
diterapkan metode sterilisasi.

2. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yanng digunakan
hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut
yang merupakan suatu cara yang cepat untuk melihat mrfologi
bakteri secara umum

3. Ikatan ion
Pewarnaan bakteri didasarkan atas adanya ikatan ion antara
komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari
pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena
adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada
pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan
pewarna asam dan pewarna basa.

III.

TEORI DASAR
Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan
karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna. Salah satu
cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk

diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal


tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu
mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.
(Waluyo, 2007)

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit,


karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat
kecil. Unutk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik
pewarnaan sel bakteri sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah
diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan
salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi (Dwidjoseputro, 1998).

Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba banyak dilakukan


baik secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak
langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut ialah
untuk :
1.

Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupun

fungi.
2.

Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.

3.

Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur

dalam jasad.
4.

Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga

sifat-sifat fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui. (Suriawiria,
1999)

Ada tiga macam prosedur pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana


(simple stain), pewarnaan diferensial (differential strain), dan
pewarnaan khusus (special strain) (Pratiwi, 2008).

Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna


untuk meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya.
Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan
ini sering digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada
mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentu yang bulat (coccus),
batang (basil), dan spiral. (Lay, 1994).

Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan


sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa)
sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana
umumnya bersifat alkalin (komponen kromotofiknya bermuatan
positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu
fiksasi, peluntur warna, subtrat, intensifikasi, pewarnaan dan
penggunaan warna penutup. Suatu preparat yang sudah menyerap zat
warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka zat warna terhapus.
Sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer.
Bakteri-bakteri ini disebut bakteri tahan asam, dan ini merupakan ciri
khas bagi suatu spesies. (Dwidjoeseputro, 1998)

Langkah-langkah utama dalam persiapan spesiemen mikroba untuk


pemeriksaan mikroskopis adalah :

Penempatan olesan atau lapisan spesiemen pada kaca objek.

Fiksasi olesan pada kaca objek

Aplikasi

pewarnaan

tunggal

(pewarnaan

sederhana)

serangkain larutan pewarna atau reagen. (Pelczar,1986)

IV.

ALAT DAN BAHAN


a. Alat
1. Bak pewarna
2. Cawan petri
3. Kaca obyek

atau

4. Kapas
5. Kertas saring
6. Ose
7. Pembakar spirtus
8. Mikroskop cahaya

b. Bahan
1. Alkohol 70%
2. Aquadest
3. Minyak emersi
4. Sampel air liur
5. Zat warna biru metilen
6. Zat warna karbol gentian violet (CGV)

c. Gambar Alat

1. Bak pewarna

2. Cawan petri

3. Kaca objek

4. Kapas

5. Kertas saring

6. Ose

7. Pembakar spirtus

8. Mikroskop cahaya

V.

PROSEDUR
Pertama, kaca objek dibersihkan menggunakan alkohol 70%
hingga tidak terdapat lemak di kaca objek. Kemudian sampel dari air
liur dioleskan di atas kaca objek yang telah dibersihkan. Selanjutnya
sampel yang telah dioleskan di atas kaca objek difiksasi di atas api.
Setelah dingin, preparat diteteskan oleh zat pewarna CGV di atas bak
warna dan didiamkan selama 15-30 detik. Selanjutnya zat pewarna
CGV yang berlebih dituangkan dari preparat lalu dibilas dengan
aquadest sampai bersih dari zat pewarna. Setelah itu, preparat
dikeringkan oleh kertas saring dan diteteskan minyak emersi.
Kemudian preparat diamati dibawah mikroskop cahaya. Hasil
pengamatan

digambar

di

buku

gambar.

Untuk

pewarnaan

menggunakan metilen biru langkah yang dilakukan sama, hanya

berbeda saat pendiaman setelah penetesan zat warna. Untuk metilen


biru didiamkan selama 1-2 menit setelah diteteskan.

VI.

HASIL PENGAMATAN
Zat

Perbesaran

pewarna

40x

CGV

100x

Metilen
biru

40x

Hasil pengamatan

100x

VII.

PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini dilakukan pengamatan pada bakteri dengan


menggunakan pewarnaan sederhana. Digunakan pewarnaan karena
pada umumnya bakteri bersifat transparan dan berukuran sangat kecil
sehingga sulit untuk diamati. Untuk membantu dalam pengamatan
bakteri maka digunakan pewarnaan bakteri oleh zat pewarna. Pada
pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk
meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya.
Pewarnaan sederhana digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan
penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentuk
yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral. Hal pertama yang harus
dilakukan adalah penyiapan preparat. Pertama-tama kaca objek
dibersihkan menggunakan alkohol 70% sampai bersih. Hal ini
bertujuan agar tidak ada kandungan lemak yang tersisa di atas kaca
objek saat diamati nantinya. Selanjutnya adalah penyiapan preparat,
yaitu pengolesan sampel di atas kaca objek yang sudah ditandai
dengan spidol agar mempermudah daerah pengamatan bakteri
nantinya. Sebelum sampel dioleskan, ose yang nantinya akan
digunakan untuk mengambil sampel harus disterilkan terlebih dahulu
dengan cara difiksasi. Setelah ose dingin, sampel yang terdapat dalam

cawan petri tertutup diambil menggunakan ose untuk kemudian


dioleskan di atas kaca objek yang sudah dibersihkan. Proses ini
dilakukan di dekat pembakar spirtus agar sampel tidak terkontaminasi
mikroorganisme dari luar. Sampel diletakkan di dalam cawan petri
tertutup agar terhindar dari mikroorganisme yang terdapat dari udara
sekitar, agar bakteri yang diamati pada sampel tidak terkontaminasi
dari lingkungan luar. Setelah sampel dioleskan di atas kaca objek, kaca
objek difiksasi dengan cara melewatkan kaca objek di atas pembakar
spirtus. Hal ini bertujuan agar sampel bisa melekat pada kaca objek.
Saat fiksasi preparat kaca objek hanya dilewatkan sebentar saja, karena
jika terlalu lama bakteri yang ada pada sampel akan mati karena tidak
tahan panas. Selanjutnya preparat yang sudah diolesi sampel ditetesi
zat pewarna. Zat pewarna yang digunakan pada praktikum pewarnaan
sederhana kali ini ada dua, yaitu CGV dan metilen biru. Tiap zat
pewarna memiliki waktu untuk didiamkan yang berbeda ketika sudah
diteteskan di atas sampel. Untuk CGV, hanya didiamkan selama 15-30
detik, sedangkan untuk metilen biru didiamkan selama 1-2 menit.
Bakteri pada sampel akan bereaksi dengan zat pewarna karena
sitoplasma dari bakteri bersifat basofilik (suka terhadap basa),
sedangkan zat pewarna yang digunakan bersifat alkalin (komponen zat
warnanya bermuatan positif). Setelah didiamkan selama waktu yang
telah ditentukan, zat pewarna berlebih di atas preparat dibuang dan
kemudian preparat dibilas secara perlahan menggunakan aquadest.
Untuk menghilangkan sisa aquadest, digunakan kertas saring untuk
mengeringkan preparat yang akan diamati nantinya. Kemudian sampel
yang berada dalam daerah pengamatan di preparat ditetesi oleh minyak
emersi untuk kemudian diamati. Saat pengamatan akan didapatkan
bakteri-bakteri dalam bentuk coccus (bulat) dan batang yang berwarna
sesuai dengan zat pewarna yang diteteskan yaitu warna ungu untuk
pewarna CGV dan warna biru untuk pemarna metilen biru.

VIII. KESIMPULAN
1. Bentuk dan struktur bakteri dalam sampel dapat teramati dengan
menggunakan pewarnaan sederhana
2. Di dalam sampel teramati bakteri dengan bentuk bulat dan batang

IX.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro,

D,1989.

Dasar-dasar

Mikrobiologi.

Malang:

Djambatan

Lay, B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : Rajawali.

Pelczar & Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi Jilid 2. Jakarta :


Universitas Indonesia

Pratiwi, S. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga.

Suriawiria, U. 1999. Mikrobiologi. Jakarta : Universitas Terbuka.

Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press.

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN GRAM
Senin, 3 Maret 2015
Kelompok I
Senin, Pukul 13.00 16.00 WIB

Nama

NPM

Prasetyo Dwi A.P.

260110130135

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI


FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2015

Nilai

TTD

(Dhiya) (Emanuella) (Puspagita)

I.

TUJUAN
Menganuti dua kelompok bakteri yaitu Gram positif dan Gram
negatif, dengan menggunakan prosedur pewarnaan Gram, Memahami
setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur
tersebut.

II.

PRINSIP
1. Teknik aseptis
Teknik aseptis adalah proses tanpa kontaminasi untuk menjamin
preparasi bebas dari mikroba kontaminan. Tekink aseptis
digunakan sepanjang percobaan berlangsung baik alat, bahan,
lingkungan sekitar, maupun praktikan. Untuk alat dan bahan dapat
diterapkan metode sterilisasi.

2. Pewarnaan diferensial
Pewarnaan

diferensial

merupakan

teknik

pewarnaan

yang

menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian selsel mikroba. Teknik pewarnaan ini tidak hanya menggunakan satu
jenis zat pewarna, berbeda dengan pewarnaan sederhana yang
hanya menggunakan satu zat pewarna.

3. Ikatan ion
Pewarnaan bakteri didasarkan atas adanya ikatan ion antara
komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari
pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena
adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada
pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan
pewarna asam dan pewarna basa.

4. Absorpsi
Absorpsi adalah proses pemisahan bahan dari suatu campuran gas
dengan cara pengikatan bahan tersebut pada permukaan absorben
cair yang diikuti dengan pelarutan.

III.

TEORI DASAR
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit,
karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat
kecil. Unutk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik
pewarnaan sel bakteri sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah
diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan
salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi (Dwidjoseputro, 1998).
Pewarnaan gram atau metode gram adalah

salah satu teknik

pewarnaan yang paling penting dan luas di gunakan untuk


mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah
terfiksasi di kenai larutan-larutan berikut zat pewaraan Kristal violet,
larutan yodium, larutan akohol(bahan pemucat) dan zat pewarnaan
tandinganya berupa zat warna safranin atau air fucshin. Metode ini di
beri nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian
Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884
untuk

membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiela,

pneumonia. Bakteri yang telah diwarnai dengan metode ini dibagi


menjadi dua kelompok yaitu, bakteri gram positf dan bakteri gram
negatif. Bakteri garam positif akan memprtahankan zat pewarna kristal
violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah
mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna
Kristal violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat
pewarna tandingnya yaitu dengan zat pewarn air fucshin atau safranin
akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini di sebabkan oleh
perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya (Pelczar, 2007).

Bakteri gram positif adalah bakeri yang mempertahankan zat


warna metal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis ini
akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop sedangkan bakteri
gram negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan
klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama berdasarkan pada
perbedaan struktur dinding sel bakteri .Bakteri gram negatif adalah
bakteri yang tidak mempertahankan zat metal ungu pada metode
pewarnaan gram. Bakteri gram-positif akan mempertaahankan warna
ungu gelap setelah di cuci dengan alkohol. Sementara bakteri gramnegatif tidak. Pada uji pewarnaan gram suatu pewarnaan penimbal
(conterstain)di tambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua
bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.
Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini
perbedaan struktur dinding selnya. Banyak spesies organisme inang,
sifat pathogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada
dinding sel gram-negatif terutama lapisan lipopolisakarida. (Pelczar,
2007)

IV.

ALAT DAN BAHAN


d. Alat
9. Bak pewarna
10. Cawan petri
11. Kaca obyek
12. Kapas
13. Kertas saring
14. Ose
15. Pembakar spirtus
16. Mikroskop cahaya
e. Bahan
7. Alkohol 70%
8. Aquadest

9. Lugol
10. Minyak emersi
11. Pemucat alkohol 95%
12. Suspensi campuran bakteri E. coli dan S. aureus
13. Zat warna karbol fuchsin
14. Zat warna karbol gentian violet (CGV)

f. Gambar Alat

1. Bak pewarna

2. Cawan petri

3. Kaca objek

4. Kapas

5. Kertas saring

6. Ose

7. Pembakar spirtus

8. Mikroskop cahaya

V.

PROSEDUR
Pertama, kaca objek dibersihkan menggunakan alkohol 70%
hingga tidak terdapat lemak di kaca objek. Kemudian sampel dari
suspensi dioleskan di atas kaca objek yang telah dibersihkan.
Selanjutnya sampel yang telah dioleskan di atas kaca objek difiksasi di
atas api. Setelah dingin, preparat diteteskan oleh zat pewarna CGV di
atas bak warna dan didiamkan selama 1 menit. Selanjutnya zat
pewarna CGV yang berlebih dituangkan dari preparat lalu dibilas
dengan aquadest sampai bersih dari zat pewarna. Setelah itu, preparat
diteteskan oleh lugol dan didiamkan selama 2 menit. Lugol yang
berlebih kemudian dibuang dan preparat dibilas menggunakan
aquadest. Setelah itu preparat ditetesi oleh larutan pemucat alkohol
tetes demi tetes secara singkat dan kemudian dibilas lagi menggunakan
aquadest. Kemudian preparat ditetesi karbol fuhsin dan didiamkan
selama 30 detik, kemudian karbol fuhsin yang berlebih dibuang dan
preparat

dibilas

menggunakan

aquadest.

Selanjutnya

preparat

dikeringkan menggunakan kertas saring dan setelah kering ditetesi


oleh minyak emersi untuk kemudian diamati.

VI.

HASIL PENGAMATAN
Perbesaran

Hasil pengamatan

40x

VII.

PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini dilakukan pengamatan pada bakteri dengan
menggunakan pewarnaan gram. Hal pertama yang harus dilakukan
adalah penyiapan preparat. Pertama-tama kaca objek dibersihkan
menggunakan alkohol 70% sampai bersih. Hal ini bertujuan agar tidak
ada kandungan lemak yang tersisa di atas kaca objek saat diamati
nantinya. Selanjutnya adalah penyiapan preparat, yaitu pengolesan
sampel di atas kaca objek yang sudah ditandai dengan spidol agar
mempermudah daerah pengamatan bakteri nantinya. Sebelum sampel
dioleskan, ose yang nantinya akan digunakan untuk mengambil sampel
harus disterilkan terlebih dahulu dengan cara difiksasi. Setelah ose
dingin, sampel yang terdapat dalam tabung reaksi tertutup diambil
menggunakan ose untuk kemudian dioleskan di atas kaca objek yang
sudah dibersihkan. Proses ini dilakukan di dekat nyala api agar sampel
tidak terkontaminasi oleh mikroorganisme dari luar. Sampel diletakkan
di dalam tabung reaksi tertutup karena sampel bersifat likuid dan juga

agar terhindar dari mikroorganisme yang terdapat dari udara sekitar,


agar bakteri yang diamati pada sampel tidak terkontaminasi dari
lingkungan luar. Setelah sampel dioleskan di atas kaca objek, kaca
objek difiksasi dengan cara melewatkan kaca objek di atas pembakar
spirtus. Hal ini bertujuan agar sampel bisa melekat pada kaca objek.
Saat fiksasi preparat kaca objek hanya dilewatkan sebentar saja, karena
jika terlalu lama bakteri yang ada pada sampel akan mati karena tidak
tahan panas. Selanjutnya preparat yang sudah diolesi sampel ditetesi
zat pewarna. Zat pewarna yang pertama digunakan adalah CGV,
preparat ditetesi oleh CGV. Setelah itu preparat dibilas menggunakan
aquadest dan ditetesi oleh lugol dan didiamkan selama 2 menit. Setelah
itu lugol dibilas menggunakan aquadest dan preparat diteteskan larutan
pemucat alkohol secara sekilas. Kemudian preparat dibillas aquadest
dan diteteskan karbol fuchsin dan didiamkan selama 30 detik untuk
kemudian dibilas menggunakan aquadest. Bakteri pada sampel akan
bereaksi dengan zat pewarna karena sitoplasma dari bakteri bersifat
basofilik (suka terhadap basa), sedangkan zat pewarna yang digunakan
bersifat alkalin (komponen zat warnanya bermuatan positif). Untuk
menghilangkan sisa aquadest, digunakan kertas saring untuk
mengeringkan preparat yang akan diamati nantinya. Kemudian sampel
yang berada dalam daerah pengamatan di preparat ditetesi oleh minyak
emersi untuk kemudian diamati. Saat pengamatan akan didapatkan
bakteri Staphylococcus aureus berbentuk coccus yang berwarna ungu
dan juga Eschericia coli berbentuk batang yang berwarna merah muda.
Hal ini disebabkan karena Staphylococcus aureus merupakan bakteri
gram positif dimana lapisan peptidoglikan pada membrannya lebih
tebal dibandingkan lipid. Peptidoglikan akan mengikat zat warna yang
cocok dengan kepolarannya yaitu CGV. Sehingga saat dibilas alkohol,
CGV yang terikat pada peptidoglikan tidak akan terbawa alkohol. Hal
tersebut akan menyebabkan bakteri gram positif akan berwarna sama
dengan warna CGV yaitu ungu. Sedangkan Eschericia coli adalah

bakteri gram negatif, dimana kandungan lemak dalam membran


bakteri tersebut lebih banyak dibanding peptidoglikannya. Lemak
memiliki kepolaran yang berbeda dengan zat pewarna CGV sehingga
CGV tidak berikatan dengan bakteri melainkan hanya berada di
lapisan luar bakteri. Hal tersebut menyebabkan zat pewarna CGV akan
hilang

terbawa ketika dibilas dengan alkohol. Lemak memiliki

kepolaran yang sama dengan karbol fuhsin yang menyebabkan


membran bakteri gram negatif akan berikatan dengan karbol fuhsin
secara kuat dan memberi warna pada bakteri saaat pengamatan (warna
merah muda).

VIII. KESIMPULAN
1. Bakteri gram positif dan gram negatif yang terdapat pada sampel
dapat teramati menggunakan pewarnaan gram
2. Bakteri gram positif yang teramati dalam sampel adalah
Staphylococcus aureus
3. Bakteri gram negatif yang teramati dalam sampel adalah
Eschericia coli

IX.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta :


Djambatan.

Pelczar, M.J.2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press.