Protocolo Practicas Bioquimica Metabolica Version Marzo 2014

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD
Escuela de Ciencias Agrcolas, Pecuarias y del Medio Ambiente

Protocolo de prcticas de BM versin 2014
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

ESCUELA DE CIENCIAS AGRICOLA, PECUARIAS Y DEL MEDIO AMBIENTE
ECAPMA
PROTOCOLO DE PRCTICAS PARA LA ESCUELA
BIOQUMICA METABLICA
Cdigo: 352001
Director Nacional
JAIRO ENRIQUE GRANADOS MORENO., MSc.
2014

I ACTIVIDADES PARA EL ESTUDIANTE

PRACTICAS DE LABORATORIO
1.
IDENTIFICACION DE LA PRCTICA
Nombre de curso
Bioqumica metablica
Cdigo de curso
352001
Valor de esta
actividad prctica
Se asignar un valor en puntos segn la rbrica de evaluacin
Nombre del director

de curso
Jairo Enrique Granados Moreno
CEAD al que
pertenece
Sede Nacional Jos Celestino Mutis
Contacto del director

de curso
jairo.granados@unad.edu.co
Tel:3443700-Ext: 374. Cel.3202280647
Laboratorios DE Bioqumica y Nutricin Sede Nacional JCM,
Espacio donde se
debe desarrollar la
prctica
Laboratorios de Nutricin sede Valledupar

Laboratorios de investigacin Centro Agroecolgico Valslice
CEAD instituciones en convenio que dispongan de la
infraestructura para el desarrollo de los protocolos
Objetivos de la
prctica
Reconocer y cuantificar Biomolculas presentes en el

metabolismo de plantas y animales
Bioqumica Metablica es la ciencia que estudia todo lo
relacionado con la estructura y actividad
de las diversas
biomolculas, en sus respectivas vas metablicas, que forman

parte de la dinmica celular de organismos animales y vegetales,
Justificacin de la
prctica
presentes en todo tipo de agro ecosistemas; por ende, permite

comprender la estructura y cintica de los compuestos que
intervienen en las diversas reacciones bioqumicas metablicas
aerbicas y anaerbicas. As mismo, teniendo en cuenta que es
una ciencia terico experimental que posee conceptos, leyes,
principios y teoras cientficas, se constituye en un pilar
fundamental para la interpretacin significativa de las mltiples

reacciones
biomoleculares que gobiernan los diferentes
procesos exergnicos y endergnicos, enfocados a mantener las

funciones vitales de sistemas auttrofos y hetertrofos, los
cuales interaccionan permanentemente con el fin de garantizar la
bioactividad
de
nuestro
planeta.
En
consecuencia,
la
intencionalidad del curso se centra en el estudio de la bioqumica

estructural, biotermodinmica, actividad molecular y bioqumica
metablica aplicada, importantes en lo bioactividad de los
sistemas
biolgicos,
de
tal
interrrelacionados e incorporados
dimensin cognitiva, para
forma
que
puedan
ser
por los estudiantes en su
lograr un verdadero aprendizaje
significativo autnomo de la bioqumica metablica.
Competencias a
desarrollar
El estudiante comprende los elementos conceptuales,

procedimentales y metodolgicos que estn involucrados en la
identificacin y cuantificacin de molculas con bioactividad en
plantas y animales
Duracin de la
prctica.
12 horas
Mecanismo mediante
A travs de la rbrica de evaluacin la cual va adjunta al final de
el cual se evaluar la
del presente protocolo (la misma que est en el aula virtual)
prctica:
2. METODOLOGIA
I. ACTIVIDAD URESICA EN MUESTRAS DE ORIGEN BIOLGICO
Objetivos
Producir la hidrlisis de la urea por medio de la enzima amidohidrolosa

denominada ureasa.
Cuantificar la actividad uresica (AU) en muestras de origen biolgico
, mediante la tcnica volumtrica de Berthelot
Conceptos Previos
Ou significan los siguientes trminos:

Biocatalizador; protena; Enzima; Cintica qumica; Velocidad de reaccin;

ureasa ; actividad uresica ; Energa de activacin; Sustrato; Hidrlisis;
Incubacin; pH; Solucin buffer; Tilulacin; lnhibidores enzimticos?
1. Fundamento Terico
La ureasa es una enzima amidohidrolosa de peso molecular: 480.kD, punto

isoelctrico: 5.0 y pH ptimo entre 6 y 7, cataliza la hidrlisis de la urea
produciendo gas carbnico, hidrxido de amonio, seqn la reaccin
Ureasa
H 2N-CO-NH 2 + 3H 2O
2NH 4OH + CO2

pH=7.0 ; T=37C
Ureasa
En presencia de una solucin buffer de_fosfatos con pH = 7.0 y a una temperatura de

incubacin de 25C, la ureasa presenta una constante de Michaelis de 10,5 mmol/L. Los
principales inhibidores de su actividad enzimtica son los iones metlicos pesados tales
corno la plata (Ag+1) el mercurio (Hg+ 2) e igualmente el cido hidroxmico y la tiourea
La ureasa, se encuentra en varios tejidos vegetales como en el haba de soya, lo cual
implica que pueda ser usada en anlisis de alimentos para determinar urea, ya sea por el
mtodo de Kjeldhal o por titulacin del amonio liberado. De esta forma, al titular el
hidrxido de amonio producido por la hidrlisis, se puede calcular la cantidad de urea
hidrolizada, utilizando el mtodo estequiomtrico, puesto que se producen 2 moles de
NH4OH por cada mol de urea desdoblada. Por lo tanto, esta reaccin puede utilizarse con
xito en la determinacin de urea en sangre, orina, suelos y otros materiales orgnicos.
2. Metodologa
Lista de Materiales:Tubos de ensayo con gradilla, pinzas para bureta, erlenmeyer de
125mL , pipetas de 5 y 10mL, matraz aforado de 100mL , bao termostatado , beaker de
400mL ,bureta de 25mL , soporte universal.
Lista de Reactivos:Ureasa al 0,1 % en buffer
0,25M , HgCl2 al 1% , HCl 0,1N , indicador de Tashiro
3. Procedimiento
fosfato de pH = 7.0, Urea

3.1 Extraccin y solubilizacin de ureasa en harinas, suelos forraje (mtodo
+/-1,0 g de
Harina ,
forraje
suelo
Wm
10 mL de
NaCl 1%
Centrifugar
3500 rpm, por
5 min
Agitar
5min
Tubo de
centrfuga
3 minutos
t= 5 minSe obtiene
Sobrenadante
,(ureasa)
Filtrar
medir V
Tubo
de
ensayo
ROTULAR
EHAU
ss
ss
V medir
s
probeta
Precipitado(fi
Fase lquida
bras, grasas,
grasas y
minerales
Vf=Vs
Indica
Se descarta
Fase slida
EXTRACTO
DE
HARINA
PARA ACTIVIDAD URESICA
salting out)
En el caso de suelo, se rotula :ESAU: Extracto de suelo para actividad uresica y para
forraje :EFAU:Extracto de forraje para actividad uresica
4 .CUANTIFICACIN DE LA AU.
4.1 Mezcla de reactivos
Reactivos (mL) /
Tubos
St
Urea 0,25M
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
Buffer fosfatos pH=7,0
5,0
4,5
4,5
4,5
4,5
HgCl2 (Gotas)*
Ureasa 0,5%
0,5

EHAU (mL)
0,5
ESAU(mL)
0,5
:EFAU(mL)
0,5
Agitar los tubos (10 seg), dejar en bao de mara a 37C, durante 20
min, al final adicionar
HgCl2 (Gotas)
4.2 Titulacin
Alistar el montaje de titulacin: lavar, purgar ,cargar y enrasar la bureta con HCl
0,1N
Pasar la solucin del tubo blanco a un Erlenmeyer beaker y adicionar 3 gotas de

indicador de color Tashiro, un color azul-verdoso, es prueba positiva para el in
Amonio (NH4+)
Colocar el erlenmeyer que contiene la solucin blanco, debajo la bureta y adicionar

lentamente el HCl, hasta que aparezca y permanezca un color rosado-violceo.
Esto
indica que los equivalentes-gramo del hidrxido de amonio fueron
neutralizados por los equivalentes-gramo del cido clorhdrico.
Registrar en su tabla de datos, los mL de HCl gastados en la titulacin del blanco.
Repetir el procedimiento anterior, con el tubo Stndar y anotar los mL empleados

de HCl
Continuar el proceso con los tubos 1, 2 y 3, que contienen los extractos de suelo,
harina y forraje; registrar los mL gastados de HCl en la tabla de datos.
4.3 Tabla de Datos

Tabla 1.Datos obtenidos para actividad uresica de suelos, forrajes harinas
Indicadores
Muestras / tubos
Wm (g)
Vf (mL)
V HCl (mL)
Suelo
Harina
Forraje
Stndar
Blanco
Tipo de muestras
analizadas
Origen, ubicacin geogrfica, regin, agroclimatologa
5.Clculos
5.1 Actividad Uresica en el tubo estndar
AU=
5.2. Actividad Uresica de la harina
AU=

5.3 Actividad Uresica en el suelo (tubo 2)
AU=
5.4 Actividad Uresica del forraje
AU=
5.5 Actividad Uresica en el suelo (tubo 4)
AU=

II. CARBONO ORGNICO, MATERIA ORGNICA Y CAPACIDAD AMORTIGUADORA

( DE SUELOS
Objetivos
Realizar un balance de materia orgnica en muestras de suelo, a partir de la

determinacin del carbono orgnico por mtodo de titulacin volumtrica y tcnica
espectrofotomtrica
Cuantificar la capacidad amortiguadora de muestras de suelos mediante tcnicas
potenciomtricas y de titulacin volumtrica , en presencia de los indicadores
adecuados
1. Revisin de literatura
El suelo es un mezcla heterognea constituda por componentes orgnicos e inorgnicos,
presentes en fases lquida, slida y gaseosa; dichos componentes estn en permanente
bioactividad para generarle caractersticas fisicoqumicas y bioqumicas especficas, lo
cual determina su utilizacin en el sector agrcola y pecuario; As mismo, la dinmica de
los procesos bioqumicos en el suelo, est relacionada con la presencia de
microorganismos, los cuales, a travs de reacciones bioqumicas enzimticas (RBE)
dadas en su metabolismo, se encargan de generar humus, huminas y cidos hmicos,
como constituyentes bsicos de la materia orgnica.
El siguiente mapa resume los componentes qumicos del suelo:
Figura 1: Componentes qumicos del suelo
Fuente: Granados., J (2012)

9

En la figura anterior, se aprecia que el suelo contiene sustancias inorgnicas(SI), las

cuales incluyen las denominadas bases intercambiables(BI), tales como los minerales:
sodio, potasio, magnesio, calcio y el catin amonio (NH4+), que determinan la capacidad
de intercambio catinico (CIC); Adicionalmente, la materia orgnica contiene todas las
biomolculas derivadas del carbono orgnico(CO), Nitrgeno total (NT), oxgeno e
hidrgeno, includas en los reconocidos grupos funcionales de la qumica orgnica(
hidrocarburos, hidroxilos, carbonilos, carboxilos, aminas y amidas, entre otros)
Para la cuantificacin del CO, se utilizan dos mtodos principales: el volumtrico de
Walkey Black y el espectrofotomtrico; en tales procedimientos, el suelo es oxidado
completamente, por medio del calor generado en la reaccin exotrmica del dicromato de
potasio 1N con el cido sulfrico concentrado H 2SO4, finalmente, se realiza una titulacin
con solucin de sulfato ferroso, en presencia del indicador llamado difenilamina,
La capacidad amortiguadora, se refiere al potencial qumico que tienen los sistemas
edficos para regular y controlar su pH, cuando son sometidos a procesos de acidificacin
alcalinizacin; dicha regulacin se da por la presencia de sistemas amortiguadores
biolgicos, existentes en la materia orgnica e inorgnica del suelo.
Para ampliar este tema, por favor Consultar y explicar los siguientes conceptos,
posteriormente, utilizando conectores adecuados, elaborar mentefacto y mapa
conceptual respectivamente:
Suelo, cido dbil, base dbil, pKa, electrolitos , disociacin electroltica, materia
orgnica, carbono orgnico, humus, huminas, cidos hmicos, bases intercambiables,
amonio, capacidad de intercambio catinico, microorganismos, ecuacin de HendersonHasselbach, soluciones Buffer, Clulas, Homestasis, Equilibrio cido base,
Metabolismo, respiracin, Fotosntesis, ATP, Bicarbonato, Fosfatos, Aminocidos,
Protenas, Hemoglobina, capacidad Amortiguadora, potencial amortiguador
2. Materiales y mtodos
2.1. Materiales y equipos
Erlenmeyer de 125mL , pipetas graduadas de 10mL , esptula metlica , agitador de
vidrio, probeta graduada de 100mL , bureta de 25mL , soporte universal , beaker de
250mL , Potencimetro, equipo de titulacin, balanza analtica, espectrofotmetro, celdas
espectrofotomtricas, embudos, papel filtro, muestras de suelo
2.2. Reactivos
H2SO4 concentrado, K2Cr2O7 1N, H3PO4, Difenilamina, FeSO4 1N,
0,1N, Fenolftalena, agua destilada y solucin buffer fosfato
NaOH
2.3. Procedimiento:
2.3.1 Carbono Orgnico (CO), Mtodo de titulacin volumtrica
Muestrear suelos acorde a las recomendaciones indicadas

Recolectar informacin pertinente sobre el origen de las muestras
Secar las muestras y tamizar sobre tamiz de 2mm
10
0,1N, HCl

Pesar +0.40g de muestra, registrar el valor como Wm y colocar en Beaker de

200ml.
Adicionar 10 mL de dicromato de potacin 1N, agitar con varilla de vidrio por
1minuto
En la cabina de extraccin de gases, agregar cuidadosamente 10mL cido
sulfrico concentrado, agitar con varilla de vidrio dos minutos y dejar enfriar 15
minutos
Adicionar agua destilada hasta completar 100 mL , agitar cuidadosamente 1
minuto y dejar en reposo 1 hora
Al cabo del este tiempo, alistar montaje de filtracin y filtrar la solucin de suelo
sobre papel filtro, hasta obtener 20 mL de filtrado
Tomar 10 mL deL filtrado anterior, depositarlo en un erlenmeyer beaker y aforar
hasta 100 mL con agua destilada, agitar por 1 minuto
Agregar 5 mL de cido fosfrico concentrado, agitar por 1minuto y reposar 5
minutos
Agregar 30 gotas de difenilamina, agitar suavemente 30 segundos
Alistar montaje de titulacin( lavar, purgar y cargar la bureta con la solucin
titulante: Sulfato ferroso 1N)
Colocar el Erlenmeyer beaker que contiene la solucin diluda de suelo debajo
de la bureta y Titular lentamente, adicionanando el sulfato sobre la solucin hasta
que aparezca y permanezca un color verde esmeralda brillnate
Registrar el volumen de sulfato ferroso gastado en la titulacin: VFeSO4
Titule un blanco de reactivo y registre el volumen: B
2.3.2 Carbono Orgnico (CO), Mtodo Espectrofotomtrico
Alistar el espectrofotmetro a una longitud de onda () de 590 nanmetros (nm)

Calibrar el aparato con agua destilada, ajustando a cero la Absorbancia (A)
Colocar 5 ml del filtrado anterior en la celda espectrofotomtrica, depositarla en el
espectrofotmetro y leer la absorbancia ( Am), a la longitud de onda mencionada.
Registrar todos los valores obtenidos en la tabla de datos 1
2.3.2 Capacidad amortiguadora (, Mtodo Potenciomtrico

Alistar 4 beakers erlenmeyers y rotularlos del 1 al 4
Al primer frasco y segundo frasco, adicionar +/- 20 gramos ( Wm ) de suelo

tamizado y 40 mL de agua destilada , agitar con varilla de vidrio en agitador
magntico por 5min, introducir el electrodo del potencimetro, esperar 60
segundos y observar el pH, registrar como pH1 .
Posteriormente , agregar 5 mL de NaOH 0,1N , agitar de nuevo por un minuto y
volver a medir el pH2
En el tercer y cuarto beakers, adicionar 20mL de agua destilada y 20 mL de
solucin buffer pH 7,0, respectivamente, introducir el electrodo del potencimetro
esperar 60 segundos y observar el pH, registrar como pH1 .
Posteriormente , agregar 5 mL de NaOH 0,1N , agitar de nuevo por un minuto y
volver a medir el pH2
Registrar todos los valores en la tabla de datos 2.
11

3. Tabla de Datos
Tabla 2. Datos para determinacin de carbono orgnico, mtodos volumtrico y
espectrofotomtrico
Muestras
VFeSO4 (mL)
Peso (Wm)
Absorbancia (A)
M1
M2
Blanco (B)
Tabla 3..Datos potenciomtricos para capacidad amortiguadora de Suelos
Muestras
Peso (Wm)
Volumen (mL)
pH1 .
Suelo 1
Suelo 2
Agua destilada
Solucin
Buffer
4. Clculos
4.1%Carbono Orgnico, Mtodo de titulacin volumtrica
%CO =
Dnde:
%CO= porcentaje de carbono orgnico
VFeSO4= Volumen(mL) de sulfato ferroso
B = Volumen del sulfato ferroso gastado en el blanco
N = normalidad del sulfato ferroso
0.003= peso miliequivalente del carbono en gramos
Wm= peso de la muestra en gramo
12
pH2

4.2 Carbono Orgnico (CO), Mtodo Espectrofotomtrico
Ver ecuacin curva de calibracin de sacarosa

4.3 Materia Orgnica (%MO)
%MO= %CO 1,724

Dnde:
%MO = Materia orgnica
%CO= porcentaje de carbono orgnico
1,724= constante de Van Bemmelen
4.4 Nitrgeno Total (%NT)
%NT= %MO/20
Donde:
%NT= Nitrgeno total
%MO = Materia orgnica
4.5 Capacidad amortiguadora (, Mtodo Potenciomtrico
Capacidad Amortiguadora
Con respecto a NaOH, para muestras de suelos:
solucin buffer
Con respecto a NaOH, para muestras de agua y
13

5. Tabla de Resultados
Tabla 4. Valores de carbono orgnico, materia orgnica y Nitrgeno total en las muestras
estudiadas
Mtodo Volumtrico
Mtodo espectrofotomtrico
Muestras
%CO
% MO
%NT
%CO
%MO
%NT
Suelo 1
Suelo 2
Tabla 5. Valores de capacidad y potencial amortiguador para las muestras analizadas

Muestras
pH
Capacidad Amortiguadora (%mEq NaOH)
Suelo 1
Suelo 2
Agua destilada
Solucin Buffer
6. Grficas (diagramas de Barras, representando los resultados obtenidos)

7. Discusin e interpretacin de los resultados
8. Diagrama UVE heurstico del experimento
9. Conclusiones (mnimo 5)
10. Bibliografa, cibergrafa e infografa, mnimo 8, con normas APA
14

III. DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS NO ESTRUCTURALES (CNE), EN

FORRAJES, POR EL MTODO DE FENOL-CIDO SULFRICO:
Este mtodo determina la cantidad de carbohidratos totales No estructurales, basndose

en su contenido de almidones hidrolizables y azcares solubles.
1.PROCEDIMIENTO
1.1 Extraccin:
Pesar +/- 2.0g de muestra en balanza analtica y registrar como: ( Wm),

depositarla luego en un vaso de precipitado y agregar 50 mL de solucin
de HCl 0,6N. Agitar constantemente con la varilla de vidrio durante 3
minutos.
Llevar el beaker con la solucin al bao termostatado y calentar a

90C,durante 20 min
Dejar enfriar por 5 min y filtrar sobre papel filtro. Medir el volumen del
filtrado(Vf) y pasar 5mL a un tubo de ensayo, adicionar a ste 5mL de
NaOH 0,6N, agitar por 15 segundos, tapar y rotular as: FFCNE: Filtrado de
forraje para carbohidratos no estructurales.
1.2 Cuantificacin:
1.2.1. Mezcla Reactiva

Alistar 3 tubos de ensayo, rotularlos as: B=blanco; St=Estndar; m =muestra y
adicionarles cuidadosamente, los siguientes reactivos en el orden indicado:
15

Tubos de ensayo
Reactivos (mL)
B
St
Agua destilada
2,0
0,0
0,0
Glucosa 1%
0,0
2,0
0,0
FFCNE
0,0
0,0
2,0
Fenol 5%
1,0
1,0
1,0
5,0
5,0
5,0
2,0
2,0
2,0
H2SO4
Concentrado
H2O destilada
Agitar cuidadosamente 20 seg, incubar a 90C, por 10min, sacar los tubos,
agitar nuevamente 10 seg y dejarlos enfriar completamente
1.2.2. Lectura espectrofotomtrica
Alistar el espectrofotmetro a una
, calibrar el aparato con el tubo
blanco, ajustando a 100% de Transmitancia (%T) y 0,000 de Absorbancia (A)
Leer la Absorbancia (A) de los tubos st y m; registrar en su tabla de datos
** En caso de que no se pueda determinar directamente la absorbancia, debido al modelo

de espectrofotmetro utilizado, entonces, Leer el % de Transmitancia (%T),de los tubos st
y m, convertir estos valores a Absorbancia (A), mediante la ecuacin : A =2- Log%T ,
trabajar con 3 cifras decimales, ejemplo:0,023**
2.Tabla de datos
16

Completar la siguiente tabla:

Tabla 6.Datos para la cuantificacin de CNE
Indicadores
Descripcin
Wm
Peso de la muestra
Vf
Volumen del filtrado
Ast
Absorbancia del estndar
Valor
Absorbancia del tubo que contena el
Am
FFCNE
3.Clculos
%CNE=
Fd
IV. ACTIVIDAD CATALTICA DE LA CATALASA (ACAT)
OBJETIVOS
Determinar la actividad de la catalasa por mtodo permanganomtrico (Ulrich.,1980)
Cuantificar la actividad enzimtica de la catalasa en muestras de origen vegetal y animal
INTRODUCCIN
La catalasa como biocatalizador de origen proteco, es una enzima xido-reductasa que
participa en la degradacin del perxido de hidrgeno (H 2O2), hasta Oxgeno molecular
(O2) y agua(H2O).
17

La reaccin bioqumica enzimtica (RBE) que cataliza es la siguiente:

Catalasa
1H2O2
pH= 6,8 ;T=30C
1 H2O + O2
Dicha biomolcula , est presente en peroxisomas y mitocondrias de clulas animales y

vegetales , protegindolas de la toxicidad de los radicales libres perxido ,impidiendo su
acumulacin y beneficiando el metabolismo celular .Tambin, tiene una participacin
activa en los procesos de foto-respiracin vegetal ,promoviendo la oxidacin del glicolato
generado a nvel del estroma del cloroplasto en una etapa posterior al ciclo de Calvn de
la fotosntesis , hasta el aminocido glicina (cido-2-aminoetanoco), el cual es oxidado
finalmente en la mitocondria- por medio de reacciones de desaminacin oxidativa-hasta
CO2 , NH3 y H2O. En las clulas animales y vegetales ,el perxido hidrgeno H 2O2 se
produce durante la oxidacin de las coenzimas FAD y FMN, biomolculas importantes en
la oxidacin de
sustratos a partir del oxgeno molecular. Tambin se genera por la
oxidacin de cidos grasos(AG) en los peroxisomas. Molecularmente, la catalasa est

codificada como EC 1.11.1.6 por la: enzyme comisin numbers y se clasifica como
perxido de hidrgeno xidorreductasa, conformada espacialmente en su estructura
cuaternaria como una protena homotetramrica de peso molecular que oscila entre 210 a
280 Kilodaltons (kD) con 4 subunidades idnticas, constitudas por un grupo prosttico
de protoporfirina y el grupo hemo (Fe- III), representando estos, un 1,1 % y 0,09 %
respectivamente del peso molecular total de la enzima. En esta prctica, la actividad de
catalasa se determinar por el mtodo permanganomtrico, en el cual se titula el perxido
residual, es decir , el que no particip en la RBE, con una solucin de permanganato de
potasio (KMnO4) de concentracin conocida
METODOLOGA
Materiales
Montaje de titulacin (soporte universal, bureta, pinzas, erlenmeyer ), pipeta graduada,
probeta graduada, beaker de 400mL; tubos de ensayo con gradilla;
Reactivos:
H2O2 0,05M, H2SO4 2N, KMnO4 0,01M; Extractos de catalasa (ECAT)
PROCEDIMIENTO
18

1. Extraccin
Frutas , verduras, suelos concentrados
Pesar ms o menos 2g de muestra picada pulverizada, registrar el valor como: Wm y
colocarla en un tubo de centrifuga, luego adicionar 10mL de solucin fra de buffer fosfato
0,05M, pH=6,8-7,0, agitar, con agitador de vidrio (3min) y centrifugar a 2500rpm durante
5min. Sacar el sobrenadante, filtrar y medir su volumen, registrarlo como: Vf y tomar 5 mL
de ste para depositarlo en un tubo de ensayo, taparlo, rotularlo como: EVCAT(extracto
de verdura para catalasa ) EFCAT(extracto de fruta para catalasa), ECCAT (extracto
de concentrado para catalasa), ESCAT, colocarlos inmediatamente en bao de hielo.
Sangre: En un tubo de ensayo, colocar 0,2 mL de sangre y 10 mL de buffer fosfato fro,
agitar vigorosamente hasta obtener mezcla completa, tapar, rotular: SSCAT (Solucin
sangunea para catalasa) y guardar en refrigeracin bao de hielo.
2. Cuantificacin
2.1 Mezcla Reactiva
Alistar 7 tubos de ensayo y rotularlos as: B, 1, 2, 3, 4, 5 ,6, colocarlos en bao de hielo y
adicionar los siguientes reactivos en el orden dado:
Tubos de ensayo
REACTIVOS
(mL)
H2O2 0,03M
Buffer fosfato
H2SO4 2N
EVCAT
EFCAT
ECCAT
19

SSCAT
ESCAT
Agitar vigorosamente los tubos por 30 segundos, colocarlos nuevamente

en el bao de hielo y dejarlos en reposo durante 5min, para que se
desarrolle la RBE
H2SO4 2N
Agitar los tubos, con cuidado, por 15 segundos, hasta mezclarlos

completamente, sacar la solucin del tubo blanco y pasarla a un
erlenmeyer beaker
2.2 Titulacin permanganomtrica REDOX

Alistar el montaje de titulacin, colocar el erlenmeyer debajo de la bureta y titular
adicionando lentamente el KMnO4, agitando , hasta que aparezca y permanezca un color
rosado violeta plido, por 30 segundos, en la solucin reactiva, registrar los mL de
permanganato gastados en este proceso.
2.3 Repetir el procedimiento con los tubos restantes, registrar volmenes de KMnO4, en la
tabla de datos
3. TABLA DE DATOS
Tabla 7. Datos para actividad cataltica de catalasa (ACAT)
Indicadores
Muestras / tubos
Wm (g)
Vf (mL)
VKMnO4 (mL)
Suelo
Harina
Forraje
Verdura
Blanco
Tipo de muestras
analizadas
20

4. CLCULOS
Suelo;
ACAT=
Continuar el clculo para las dems muestras

V. CUANTIFICACIN DE NITRGENO NO PROTEICO (NNP) (Fraccin A de Van
Soest )
OBJETIVOS
Cuantificar el nitrgeno no proteco (NNP) ,tambin denominado fraccin A de Van

Soest , mediante el reactivo especfico : cido Tricloroactico (ATA)
Aplicar tcnicas instrumentales analticas de Kjeldhal y espectrofotomtricas para

determinar el contenido de NNP y Protena verdadera (PV) en forrajes y
concentrados.
1.REVISIN DE LITERATURA
Cerca del 90 % del nitrgeno total (NT) presente en el contenido del lquido ruminal, se
encuentra en forma insoluble. El 10 % de ste corresponde a nitrgeno amoniacal (NNP),
y el restante, es una mezcla entre aminocidos libres y pptidos. El amonaco (NH 3) se
encuentra en una concentracin que oscila entre 2 y 50 mg /dL, dependiendo de la racin
y del tiempo transcurrido desde la ingesta y es mxima generalmente unas dos horas
despus de la ingesta de los alimentos que aportan protena. El NH3 es el principal
nutriente nitrogenado para las bacterias del rumen; stas lo utilizan si existen adecuadas
fuentes de energa, principalmente carbohidratos, para biosintetizar
aminocidos
necesarios con el fin de cubrir sus propias necesidades proteicas. Otras fuentes de NNP
para el rumen, aparte de la protena ingerida y degradada, lo constituye la urea (H2N-CO21

NH2), la cual es degradada por la enzima bacteriana denominada ureasa clasificada

como amidohidrolasa, en presencia del agua , hasta producir: amonaco y gas
carbnico(CO2)
El amonaco producido en el rumen por encima de la capacidad de los microorganismos
para asimilarlo, se absorbe y por sangre, es transportado al hgado y convertido en urea.
Parte del amonaco libre existente en el rumen se absorbe directamente a travs del
epitelio del rumen, hasta la sangre; el resto (en la mayora de los casos, la mayor parte),
pasa con los alimentos digeridos hasta el intestino donde es absorbido, llega a la sangre y
luego al hgado. La mayor parte de la urea formada en el hgado se excreta a travs de la
orina; una parte (hasta el 20 %) es reciclada al rumen con la saliva o por difusin directa
desde la sangre a travs de la pared del rumen (A. Bondi, 1988).
En el laboratorio, el nitrgeno no proteico (NNP), que est includo en: rea, amonaco y
pptidos, es tradicionalmente aquel que pasa en el filtrado despus de la precipitacin
con un reactivo especfico para protena.
Krishnamoorthy et al. (1982) utiliz cido tricloroactico (ATA) como reactivo especfico,
para separar el nitrgeno insoluble del soluble (NNP), esto se realiza mediante la lisis de
polipptidos, hasta
pptidos der menor peso molecular, de tal forma
que son
metablicamente ms cercanos a la protena soluble(PS). Muchas bacterias ruminales

(en particular las celulolticas) no
consumen solo aminocidos, tambin requieren
pptidos, para su mantenimiento metablico.

2. Materiales y Mtodos
2.1Reactivos:
Acido Tricloroactico (ATA) al 10% ( Cl3-C-COOH )
Agua destilada
2.2 Procedimiento:
2.2.1 Extraccin con cido Tricloroactico (ATA)
Pesar +/- 2,0 g de muestra (Suelo, forraje) (picada pulverizada) , en balanza

analtica y registrar como (
y colocar en vaso de precipitado
Adicionar 20 mL de agua destilada fra, agitar por 1min
Dejar reposar la mezcla por 15 min
Adicionar 30 mL de solucin de ATA, agitar por 1min

22

Reposar a Temperatura ambiente por 20 min
Filtrar sobre papel filtro en probeta
Medir el volumen del filtrado(Vf)
Recolectar 5 mL del filtrado, colocarlos en un tubo de ensayo y rotularlo: FFNNP:

filtrado de forraje para nitrgeno no proteco FSNNP (Filtrado de suelo para
nitrgeno no proteco
Tapar los tubos y guardar en nevera a refrigeracin, hasta ser utilizados en la

mezcla reactiva
2.2.2 Cuantificacin
Cuantificar el Nitrgeno en el filtrado, por mtodo espectrofotomtrico de BiuretLowry
a) Mezcla de reactivos
Alistar 4 tubos de ensayo, rotularlos as: B:blanco; st :estndar; m-1 y m-2
Adicionar los siguientes reactivos en el orden dado, segn el cuadro:
Tubos de ensayo
Reactivos (mL)
st
m-1
m-2
FFNNP
FSNNP
Agua destilada
Albmina
0,5%
Reactivo de
Biuret
Agitar vigorosamente por 30 segundos y dejar reposar de 5 a 10 min,

a temperatura ambiente.
b) Lectura espectrofotomtrica
c) Alistar el espectrofotmetro a una longitud de onda de 540 nanmetros
(nm) y calibrarlo configurarlo con la solucin del tubo blanco.
d) Leer la Absorbancia(A) de las dems soluciones : st, m-1 y m2
Registrar estos valores en la tabla de datos
23

3.Tabla de datos
Tabla 8:Datos para Nitrgeno no proteco (NNP)
Indicadores
Muestras / tubos
Wm (g)
Vf (mL)
Absorbancia (A)
Suelo
Forraje
Stndar
Tipo de muestras
analizadas
4.Clculos
4.1% de Nitrgeno No Proteco (NNP)
%NNP=
Donde:
Am: es la Absorbancia de la muestra
Ast: Absorbancia del estndar de albmina
: volumen del filtrado en mL

: Peso de la muestra en gramos
Desarrollar clculo para muestra de suelo y forraje.
24

Opcional
CAPACIDAD AMORTIGUADORA ( Y POTENCIAL AMORTIGUADOR (p (
MUESTRAS BIOLGICAS
) DE
Objetivos
Cuantificar la capacidad amortiguadora de muestras biolgicas mediante tcnicas

potenciomtricas y de titulacin volumtrica , en presencia de los indicadores
adecuados
Realizar un anlisis comparativo del potencial bufferante de muestras de origen
biolgico ,como: leche, sangre, orina , concentrado y forrajes
1. Revisin de literatura
Con base en el artculo anexo, consultar Explicar los siguientes conceptos y elaborar
mentefacto y mapa conceptual
cido dbil, base dbil, pKa , electrolitos , disociacin electroltica , tampones fisiolgicos ,
ecuacin de Henderson-Hasselbach , soluciones Buffer , Clulas , Homestasis ,
Equilibrio cido base , animales , vegetales , Metabolismo, respiracin , Fotosntesis ,
ATP , Bicarbonato , Fosfatos, Aminocidos , Protenas, Hemoglobina .capacidad
Amortiguadora , potencial amortiguador
2. Materiales y mtodos
2.1. Materiales y equipos
Erlenmeyer de 125mL , pipetas graduadas de 10mL , esptula metlica , agitador de
vidrio, probeta graduada de 100mL , bureta de 25mL , soporte universal , beaker de
250mL , Potencimetro, equipo de titulacin, balanza digital, muestras biolgicas
(concentrado ,orina , sangre y forraje )
2.2. Reactivos
NaOH 0,1N, HCl 0,1N , Fenolftalena , rojo de metilo, agua destilada y solucin buffer
fosfato
2.3. Procedimiento:
2.3.1 Mtodo de titulacin volumtrica
Alistar 3 beaker erlenmeyer pequeos y rotular as: 1, 2, 3.
25

Adicionar al erlenmeyer uno , 20mL de agua destilada , al dos , 20mL de solucin

buffer y al tercero, 20 mL de leche.
Colocar en cada frasco 2 gotas de fenolftalena y agitar por 10 segundos
Alistar el montaje de titulacin y cargar la bureta con solucin de NaOH 0,1N
Colocar el primer frasco bajo la bureta y titular la solucin acuosa, adicionando el

NaOH hasta que aparezca y permanezca un color rosado plido, registrar el
volumen gastado en su tabla de datos.
Repetir la titulacin anterior con las dems soluciones , buffer y leche. Registrar
volmenes en tabla de datos.
Tabla 1..Datos volumtricos para capacidad amortigudora de muestras biolgicas

Muestras
Vm (mL)
V NaOH 0,1N (mL)
Agua destilada
20
Buffer fosfato
Leche
2.3.2 Tcnica potenciomtrica

Alistar 5 beakers erlenmeyers y rotularlos del 1 al 5
Al primer frasco , adicionar +/-5 gramos (W m ) de concentrado pulverizado y 100

mL de agua destilada , agitar con varillad de vidrio en agitador magntico por
5min ,filtrar y medir el pH de este filtrado ,registrar como pH 1 . Posteriormente ,
agregar 5 mL de HCl 0,1N , agitar de nuevo por un minuto y volver a medir el pH 2
En el segundo y tercer beakers , repetir el procedimiento con las muestras de

harina y forraje picado , respectivamente.
En el cuarto vaso, Agregar 1mL de sangre y 19 mL de agua destilada , agitar por

30 segundos y medir pH1 , luego, adicionar 5mL de NaOH 0,1N , agitar por un
minuto y volver a observar el pH final (pH 2)
En el quinto frasco, colocar 20mL de orina junto con 20mL de agua destilada,
agitar por 30 segundos y registrar el pH1 , luego , adicionar 5mL de NaOH 0,1N ,
agitar nuevamente por 1min y evaluar el pH final (pH 2)
26

3. Tabla de datos
Tabla 2.Datos potenciomtricos para capacidad amortiguadora de muestras biolgicas
Valores evaluados
Muestras
Wm (g)
Vm (mL)
Concentrado
Harina
Forraje
Sangre
Orina
4. Clculos
4.1 Mtodo de titulacin volumtrica
Potencial Amortiguador
27
pH1
pH2

4.2 Tcnica potenciomtrica

Con respecto a HCl
Potencial Amortiguador Con respecto a HCl
Con respecto a NaOH
Potencial Amortiguador Con respecto a NaOH
Calcular la capacidad Amortiguadora y Potencial Amortiguador de

todas las muestras biolgicas estudiadas (con respecto a HCl y NaOH)
5. Tabla de Resultados
Tabla 3. Valores de capacidad y potencial amortiguador para las muestras analizadas
Muestras
(mEq HCl
/pH)
(mEqNaOH
HCl
/pH)
Concentrado
28
NaOH

Harina
Forraje
Sangre
Orina
6. Grficas (diagramas de Barras, representando los resultados obtenidos)

7. Discusin e interpretacin de los resultados
8. Diagrama UVE heurstico del experimento
9. Conclusiones (mnimo 5)
10. Bibliografa mnimo 6, con normas ICONTEC
A. Elementos necesarios para la prctica
Protocolos gua de la actividad, Preinformes impresos, Bata blanca , cinta de

enmascarar, bayetilla roja, vidriolap, muestras de origen biolgico recolectadas y
empacadas segn la gua didctica, libreta de anotaciones, lpiz, cmara fotogrfica.
B. Productos a entregar
Trabajo prctico en equipo: En este espacio, los integrantes del grupo, ejecutarn los
respectivos procedimientos instrumentales y analticos, para determinar los componentes
qumicos en cada muestra, registrando cuidadosamente los datos en las tablas, de tal
forma que al final de cada sesin debern entregarse al docente responsable de la
prctica.
Trabajo intelectual del equipo: En esta etapa, los estudiantes efectuarn la discusin y
aportes individuales para la construccin del informe modelo. artculo cientfico, como
producto final, el cual se elaborar de acuerdo al formato anexo a este documento.
ACTIVIDAD:
En el grupo colaborativo, deben diligenciar el formato de informe final, generando un
producto de trabajo colaborativo, con base en lo establecido all y con las siguientes
caractersticas:
Mrgenes de 3cm, letra arial 12 (para ttulos y subttulos); 11(texto y contenidos) y
10, para: Resumen, subndices y superndices
29

Interlineado 1cm,para el resumen y 1,5cm para el texto.

Portada, donde se indique : Ttulo de la prctica, Integrantes del grupo , cdigo,
correo electrnico, Nombre tutor de plataforma y su correo, CEAD de origen,
programa , ECAPMA, UNAD, fecha de entrega.
El contenido deber inclur:
1. Resumen (mximo 6 lneas); palabras claves (5).
2. Introduccin (14 lneas).
3. Fundamentacin Terica (Revisin de literatura)
3.1 Mapa conceptual
3.2 Mentefacto conceptual
4. Materiales y Mtodos.
4.1 Lista de equipos utilizados
4.2 Lista de reactivos utilizados
4.3 Procedimientos (diagrama de flujo)
4.3.1 Video fotos del trabajo en el laboratorio
5. Resultados y discusin.
5.1 Tabla de datos
5.2 Ecuaciones de clculo
5.3 Tablas de resultados
5.4 Grficas estadsticas (diagramas de barras)
5.5 Discusin e interpretacin de los resultados
6. Conclusiones (cinco)
7. Bibliografa consultada (mnimo 5 referencias) (Normas APA.)
8. Anexos
8.1 Diagrama UVE heurstico de la prctica.
II ACTIVIDADES PARA EL TUTOR

El tutor de prctica, debe entrar en contacto desde el inicio del pero do acadmico
con el director de curso, con el objetivo de conformar la red de tutores, la cual se
trabajar desde los correos institucionales
Logstica y desarrollo de la prctica

Seleccin del sitio donde se desarrollar la prctica
Aseguramiento logstico para desarrollo de la prctica
Entrega de la gua a los estudiantes y seguimiento de la prctica: Su rol
debe ser de orientador y facilitador en el desarrollo de las actividades.
Conclusiones de la prctica. Establecer un mecanismo que permita el
intercambio de ideas, aclaracin de dudas y planteamiento de
conclusiones de manera conjunta.
Evaluacin. El tutor realizar la evaluacin de la prctica de acuerdo
con la rbrica.
1. Informe de Actividades
30

El tutor de prcticas deber elaborar un informe sobre el desarrollo de las

actividades del componente prctico el cual debe ser entregado al director de
curso. Dicho informe estar compuesto por los siguientes formatos
diligenciados:
Formato 1: Datos generales de la prctica
CONTROL Y SEGUIMIENTO AL DESARROLLO
DEL COMPONENTE PRCTICO
Nombre del tutor
CEAD donde se
encuentra el tutor
Curso
Ttulo de la prctica
Dia:________________
Mes_______________
Fecha de realizacin
Ao:_________
Lugar donde se
desarroll la prctica
Lugar: ________________________________________
Municipio:________________
Departamento:_______________
Temas abordados en
la prctica
Materiales y equipos
empleados en la
prctica
Observaciones
Costo aproximado
Transporte:___________________________________
Materiales y equipos:____________________________
Formato 2: registro de asistencia de los estudiantes a las actividades prcticas

REGISTRO DE ASISTENCIA DE ESTUDIANTES
A LAS ACTIVIDADES PRCTICAS
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
NOMBRES
APELLIDOS
31
CODIGO
FIRMA

10
11
12
Nombre: _________________________________________
Datos del tutor
Anexos
Cdula: ____________ Firma: ________________________

Correo___________________________________________
Telfonos _______________ Celular __________________
Evidencias del desarrollo de la prctica (Fotografas,

videos, etc).
Formato 3: Reporte de calificaciones obtenidas por los estudiantes

REPORTE DE CALIFICACIONES
Curso: _______________________________
Cdigo:_______________________________
Ttulo de la prctica: ____________________
_____________________________________
CEAD:_______________________________
Fecha:_______________________________
Tutor: _______________________________
Firma:_______________ Cdula:_________
No
Participacin
(mx.
x
puntos)
Apellidos y Nombres
Cdigo
1
2
3
4
32
Competencias
desarrolladas
Informe
(mx.
puntos)
Total
40% en
puntos

Protocolo Practicas Bioquimica Metabolica Version Marzo 2014

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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD

Escuela de Ciencias Agrcolas, Pecuarias y del Medio Ambiente

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

PROTOCOLO DE PRCTICAS PARA LA ESCUELA

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I ACTIVIDADES PARA EL ESTUDIANTE

Se asignar un valor en puntos segn la rbrica de evaluacin

Nombre del director

Jairo Enrique Granados Moreno

Sede Nacional Jos Celestino Mutis

Contacto del director

Laboratorios de Nutricin sede Valledupar

Reconocer y cuantificar Biomolculas presentes en el

biomolculas, en sus respectivas vas metablicas, que forman

presentes en todo tipo de agro ecosistemas; por ende, permite

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biomoleculares que gobiernan los diferentes

procesos exergnicos y endergnicos, enfocados a mantener las

intencionalidad del curso se centra en el estudio de la bioqumica

por los estudiantes en su

lograr un verdadero aprendizaje

significativo autnomo de la bioqumica metablica.

El estudiante comprende los elementos conceptuales,

Producir la hidrlisis de la urea por medio de la enzima amidohidrolosa

Ou significan los siguientes trminos:

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Biocatalizador; protena; Enzima; Cintica qumica; Velocidad de reaccin;

La ureasa es una enzima amidohidrolosa de peso molecular: 480.kD, punto

2NH 4OH + CO2

En presencia de una solucin buffer de_fosfatos con pH = 7.0 y a una temperatura de

fosfato de pH = 7.0, Urea

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3.1 Extraccin y solubilizacin de ureasa en harinas, suelos forraje (mtodo

Buffer fosfatos pH=7,0

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Pasar la solucin del tubo blanco a un Erlenmeyer beaker y adicionar 3 gotas de

Colocar el erlenmeyer que contiene la solucin blanco, debajo la bureta y adicionar

indica que los equivalentes-gramo del hidrxido de amonio fueron

neutralizados por los equivalentes-gramo del cido clorhdrico.

Registrar en su tabla de datos, los mL de HCl gastados en la titulacin del blanco.

Repetir el procedimiento anterior, con el tubo Stndar y anotar los mL empleados

4.3 Tabla de Datos

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Tabla 1.Datos obtenidos para actividad uresica de suelos, forrajes harinas

Origen, ubicacin geogrfica, regin, agroclimatologa

5.2. Actividad Uresica de la harina

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5.3 Actividad Uresica en el suelo (tubo 2)

5.4 Actividad Uresica del forraje

5.5 Actividad Uresica en el suelo (tubo 4)

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II. CARBONO ORGNICO, MATERIA ORGNICA Y CAPACIDAD AMORTIGUADORA

Realizar un balance de materia orgnica en muestras de suelo, a partir de la

Fuente: Granados., J (2012)

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En la figura anterior, se aprecia que el suelo contiene sustancias inorgnicas(SI), las

Muestrear suelos acorde a las recomendaciones indicadas

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Pesar +0.40g de muestra, registrar el valor como Wm y colocar en Beaker de

2.3.2 Carbono Orgnico (CO), Mtodo Espectrofotomtrico

Alistar el espectrofotmetro a una longitud de onda () de 590 nanmetros (nm)

2.3.2 Capacidad amortiguadora (, Mtodo Potenciomtrico

Al primer frasco y segundo frasco, adicionar +/- 20 gramos ( Wm ) de suelo

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