Anda di halaman 1dari 33

SEMINARIO N02

OTROS MICROORGANISMOS DE IMPORATANCIA CLNICA

1. ESPIROQUETAS
Las espiroquetas tienen una morfologa en espiral que las asemeja a un resorte metlico;
algunas presentan un enrollamiento ms apretado que otras. Sin embrago, la
caracterstica ms distintiva de este orden es el modo en que se mueven, que se basa en
el uso de dos o ms filamentos axiales (o endoflagelos) encerrados en el espacio
existente entre una vaina externa y el cuerpo de la clula. Un extremo de cada filamento
axial se adhiere cerca de un polo de la clula (vanse fig.).
Mediante la rotacin de su filamento axial, la clula rota en direccin opuesta, como un
tirabuzn, lo que le permite moverse con mucha eficiencia a travs de los lquidos. Para
las bacterias esto es ms difcil de lo que parece. En la escala de una bacteria el agua es
tan viscosa como la melaza para los seres humanos. Sin embargo, una bacteria
tpicamente puede moverse cerca de 100 veces la longitud de su cuerpo en un segundo
(o cerca de 50 pm/segundo), mientras que un pez grande, como un atn, slo puede
moverse 10 veces la longitud de su cuerpo en ese tiempo.

En la cavidad oral de los seres humanos se encuentran muchas espiroquetas y es


probable que hubiera espiroquetas entre las primeros microorganismos que van
Leeuvenhoek observ y describi en la saliva y en raspados de diento en la dcada de
1603. Una localizacin extraordinaria de las espiroquetas es sobre las superficies de
algunos de los proemios que digieren la celulosa encontrados en las termitas, donde
pueden funcionar como sustitutos de los flagelos.
Treponema. Las espiroquetas comprenden varias bacterias que son patgenos
importantes. La que se conoce mejor pertenece al gnero Treponena y es Treponema
pallidum, la causa de la sfilis (fig.b).
Borrelia. Los miembros del gnero Borelia causan la fiebre recurrente y la enfermedad
de Lyme, enfermedades graves que habitualmente transmiten garrapatas o piojos.
Leptospira. La leptospirosis es una enfermedad que suele transmitirse a los seres
humanos a travs de agua contaminada por especies de Leptospira. Las bacterias son
ANALISIS CLNICO

Pgina 1

SEMINARIO N02
excretadas en la orina de Ciertos animales (p. ej.. perros. ratas y cerdos) de modo que
los perros y los patos domsticos por lo general estn inmunizados contra la
leptospirosis.1

FIGURA Espiroquetas. Las espiroquetas son microorganismos helicoidales con filamentos


axiales debajo de una vaina externa que les permite realizar un movimiento de rotacin similar
al de un tirabuzn. (a) Este corte de una espiroqueta muestra numerosos filamentos axiales
entre la clula oscura y la vaina externo. (b) Esta microfotografa electrnica de uno porcin
de Treponema pallidum muestra la vaina, que se separ de lo clula durante la preparacin
para la microscopia, y dos filamentos axiales, adheridos cerca de uno de los extremos de la
clula bacteriana debaio de la vana.

2. MICOPLASMAS
Los micoplasmas son muy pleomorfos porque carecen de pared celular y pueden
producir filamentos que se asemejan a los hongos, de all su nombre (mykes hongo y
plasma = (ormado). Las clulas del gnero Mycoplasma son muy pequeas, con un
tamao que vara de 0,1 a 0,25 pm y un volumen celular dcl 5% del de un bacilo tpico.
Corno su tamao y plasticidad les permita atravesar los filtros que retenan a las
bacterias en un comienzo fueron considerados virus. Los micoplasmas representan los
microorganismos autorreplicantes ms pequeos capaces de llevar una existencia
celular independiente. Los estudios de su DNA sugieren que estn estricamente
relacionados con el grupo de bacte-rias gramposirivas que abarca los gneros Bacilus.
Estreptococos y Lactobacilus pero gradualmente han perdido material gentico. Para
describir este proceso se ha utilizado el trmino evolucin degenerativa.
Entre los micoplasmas el patgeno humano ms importante es M. pneumoniae, que es
la causa de una forma comn de neumona leve. Otros gneros del orden
ANALISIS CLNICO

Pgina 2

SEMINARIO N02
Mycoplasmatales son Spiroplasma, clulas con una morfologa en tirabuzn rgido que
causan enfermedades graves en las plantas y son parsitos frecuentes de los insectos que
se alimentan de plantas, y Ureaplasma, denominados as porque pueden degradar la urea
de laorina de modo enzimaticoy en ocasiones se asocian con infecciones urinarias.
Los micoplasmas pueden crecer en medios artificiales que les proporcionen esteroles, si
es necesario, y satisfagan otros requerimientos nutricionales fsicos especiales. Las
colonias miden menos de 1 mm de dimetro y tienen un apecto caracterstico en "huevo
frito" cuando se las observa con aumento. Para muchos propsitos a menudo resultan
ms satisfactorios los mtodos de cultivos celulares. De hecho, los micoplasmas crecen
tan bien con estos mtodos que constituyen un problema de contaminacin frecuente en
los laboratorios de cultivos celulares.1

3. RICKETSIAS
Se trata de microorganismos procariotas que se comportan como parsitos intracelulares
estrictos. Pertenecen al dominio Bacteria phylum: Proteobacteria, orden: Rickettsiales.
Tienen forma bacilar, cocobacilas o son pleomorficas y su tamao es de alrededor de
0.3 por 1.2 um. Son grmenes gramnegativos aerobios.
No se colorean bien con la coloracin de Gram, pero si con las de Giemsa o de
Gimnez, que permite visualizarlas con el microscopio ptico.

ANALISIS CLNICO

Pgina 3

SEMINARIO N02
Tienen dos cidos nucleicos, DNA y RNA, y ribosomas para la sntesis de protenas. El
general no pueden metabolizar la glucosa como sustrato: pueden sintetizar ADP, pero
no ATP, el cual obtienen de la clula hospedadora.
Se cree que este parasitismo energtico obligado se debe a un sistema inusual de
transporte a nivel de sus membranas, mediado por una enzima, la translocasa que
intercambia el ADP bacteriano por ATP celular, adems de otros metabolitos esenciales
(aminocidos y nucletidos) presentes en el citoplasma de la clula eucariota.

ESTRUCTURA CELULAR

Las rickettsias poseen dos envolturas: la membrana citoplasmtica interna y la pared


celular ms externa en la que es posible identificar dos capas: una interior electrodensa
de peptidoglucano, cido murmico y cido diaminopimelico y otra ms externa de
lipopolisacarido, separadas por un espacio periplsmico; estas caractersticas
estructurales las relacionan con las bacterias y con los virus por la particularidad de
requerir clulas vivas para su desarrollo. No tienen flagelos y estn rodeadas por una
biopelcula poco adherente.

CULTIVO Y REPRODUCCION

Debido a que no se desarrollan en medios inertes, pueden cultivrselas en huevos


embrionados, animales de experimentacin o en cultivos de clulas de mamferos o
artrpodos a temperaturas de 33 a 35C, donde crecen en abundancia. Se reproducen
por fusin binaria en el citoplasma de las clulas que infectan, principalmente en clulas
endoteliales y linfoides circulantes. Son agentes patgenos de muy alto riesgo, por lo
que se evita su manipulacin para cultivo.

CLASIFICACION Y ACCION PATOGENA

La rickettsiaceae comprende dos generos: Orientia (especie tsutsugamushi: agente del


tifus de los matorrales, transmitida por caros) y Rickettsia: con el grupo tifus (especies:
R. prowazekki y R. typhy) y el grupo de la fiebre moteada (especies R. rickettsii, R.
akari, R. conori, R. siberica y R. africae).
La infeccin por rickettsias es transmitida por picaduras de caros o garrapatas y por las
deyecciones contaminadas de piojos, pulgas y ratas.
Las rickettsias penetran en las clulas por medio de un mecanismo de fagocitosis
inducida por el parsito y quedan dentro de un fagosoma. Casi inmediatamente la
enzima fosfolipasa A2 de las rickettsias destruye la membrana fagosmica, evitan as la
accin ltica de los lisosomas y los microorganismos se esparcen y reproducen
activamente en el citoplasma eucariota hasta que su nmero destruye la clula y se
liberan para reiniciar el ciclo. En algunas especies, la liberacin de produce por
exocitosis con filopodios o por pasaje intercelular sin lisis.(1)

ANALISIS CLNICO

Pgina 4

SEMINARIO N02
4. CLAMIDIAS
Las clamidias son bacterias muy semejantes a las rickettsias, pero tienen un ciclo
intracelular de reproduccin ms complejo. Comparten con ellas y los virus la condicin
de ser parsitos intracelulares estrictos.
Son formas cocoideas, inmviles, con membrana citoplasmtica y ribosomas; no poseen
peptidoglucano en su pared gramnegativa, con aspecto de bicapa separadas por un
espacio periplsmico. No poseen capsulas ni flagelos. Pueden tener proyecciones en su
superficie, y un complejo grupo de protenas en la membrana externa responsables de la
gran variabilidad antignica, del tropismo y la infectividad. Poseen dos cidos
nucleicos, pero no producen su propio ATP, por lo cual las ATP/ADP transferasas estn
presentes en todas las especies de clamidias.

REPRODUCCION

Se multiplican en vesculas dentro de citoplasma de la clula hospedadora, mediante un


ciclo complejo, con dos etapas (ciclo bifsico).
Despus de adherirse al cuerpo elemental (CE) a receptores especficos, penetra en la
clula hospedadora por medio de un proceso comparable a la fagocitosis (endocitosis).
Estos CE que permanecen dentro del fagosoma e inhiben la fusin de los grnulos
lisosomales aumentan de tamao hasta llegar a los 8000-1000 nm y se tornan esfricos,
ms frgiles, menos densos y ricos en RNA: en esta etapa del ciclo no son infecciosos,
pero si metablicamente activos y se denominan cuerpos reticulados (CR). Dentro de
las vesculas fagosmicas, estos se multiplican por fision binaria y producen
microorganismos pleomrficos. En este estadio pueden visualizarse inclusiones
intracitoplasmticas. Una vez que se han multiplicado, los CR se condensan y dan
origen a los CE que, por autolisis celular, quedan libres y con capacidad de infectar
otras clulas.

CLASIFICACION Y ACCION PATGENA

Pertenecen al Dominio Bacteria Plylum XVI Chamydial.


Los estudios filogenticos efectuados con PCR han generado una reclasificacin del
orden Chlamydiales. La familia Chlamydiaceae comprende dos gneros:
Chlamydophyla (Cp), con tres especies patgenas para el hombre: Cp. Psittaci, Cp.
Pneumoniae y Cp. Abortus. Y el gnero Chlamydia (C), con el patgeno humano,
Chlamydia trachomatis.
In vivo las clamidias infectan clulas linfoides, epiteliales no ciliadas, cilndricas o
cbicas de diferentes mucosas: conjuntiva, endocervix, recto y endometrio,
genitourinarias y trompas de Falopio. La injuria celular se produce por la lisis y
probablemente por accin de toxinas o reacciones autoinmunes.(1)

ANALISIS CLNICO

Pgina 5

SEMINARIO N02
DIAGNSTICO POR EL LABORATORIO DE LAS INFECCIONES
MICTICAS2
CUADRO 1 Signos Sntomas y agentes etiolgicos de las micosis extrapulmonares1
TIPO

DE

INFECCIN

SIGNOS Y SNTOMAS

Cutnea

Lesiones superficiales descamativas, que varan en tamao, forma y color,


del trax o de la espalda: tia versicolor secundaria a la infeccin por
Malassezia furfur
Prurito, lesiones descamativas conocidas como ta: dermatofitosis
Afeccin fungoide exofitica e hiperqueratsica que produce engrosamiento y
costras conocida como tia fvica:
Trichophyton tonsurans, T. violaceum y T. schoenleinii
Lesiones descamativas o con costras limitadas a las zonas intertriginosas
hmedas de piel sugieren infecciones por levaduras: Candida albicans
Infeccin pustular subcutnea primaria en el sitio de inoculacin, con
diseminacin proximal y evolucin de lceras cutneas secundarias a lo
largo de los trayectos linfticos: Sporothrix schenckii.
Pstulas que no curan, lceras o fstulas: enfermedades micticas
diseminadas por hongos dimorfos y micetomas secundarios a una diversidad
de hongos
Lesiones purpricas y quistes subcutneos: feohifomicosis
Lesiones fungoides. hemorrgicas y con cambio de coloracin:
cromomicosis

SNC

Comienzo insidioso de cefaleas que aumentan en frecuencia e intensidad,


acompaado por naseas, irritabilidad y torpeza: criptococosis

Urinaria

Pielitis y pielonefritis asociadas con la administracin prolongada de


antibiticos. corticosteroides, inmunosupresores, frmacos antineoplsicos y
la insercin durante periodos prolongados de sondas urinarias, en especial en
mujeres mayores: candidiasis
Piuria limitada, dolor abdominal en hipogastrio, polaquiuria: cistitis no
bacteriana en mujeres de mediana edad: Torulopsis glabrata

Ocular

Conjuntivitis, infecciones de la crnea y queratoconjuntivitis: especies de


Fusarium. Aspergillus, Cladosporium Acremonium y otros. Las infecciones
intraoculares, por lo general secundarias a traumatismo o ciruga ocular:
Candida albicans, especies de Aspergillus o de Zygomyces.

Endocarditis

Fiebre de baja intensidad, soplos cardacos. vegetaciones en


ecocardiografa: especies de Candida, de Aspergillus, de Paecilomyces

ANALISIS CLNICO

Pgina 6

la

SEMINARIO N02

Sinusitis

I.

Dolor facial e hiperemia cutnea, cefalea, fiebre de baja intensidad,


evidencia radiogrfica de senos paranasales ocupados o con niveles lquidos:
Aspergillus fumigatus, Sporothrix schenckii, especies de Alternaria y
Pseudallescheria boydii

RECOGIDA DE LA MUESTRA2

Para alcanzar el xito en el diagnstico micolgico partiendo de una sospecha clnica, es


fundamental realizar adecuadamente la recogida de la muestra a partir de la lesin, su
correcta manipulacin para mantener la viabilidad del agente etiolgico y evitar
posibles contaminaciones en su transporte y procesamiento, la siembra de la misma en
los medios idneos y a la temperatura adecuada, as como la identificacin e
interpretacin correcta de los aislamientos. nicamente con el procesamiento adecuado
se puede recuperar el hongo claramente asociado con el proceso infeccioso. A la hora de
valorar un crecimiento fngico hay que tener siempre presente la necesidad de
diferenciar un aislamiento significativo de otros que no lo son, ya que no es lo mismo
identificar una especie fngica que diagnosticar una micosis.
Consejos generales para optimizar la recogida de las muestras:2
1. Debe disponerse de un protocolo de recogida de muestras que ser actualizado
peridicamente.
2. Es responsabilidad del mdico asegurar una correcta recogida y envo en
condiciones adecuadas de las muestras, funciones que no deben ser delegadas en
personal no cualificado.
3. Es necesario recoger las muestras aspticamente, utilizando contenedores
estriles, remitirlas al laboratorio antes de 2 horas y sembrarlas lo antes posible.
4. La muestra debe recogerse antes de instaurar el tratamiento y siempre de la parte
activa de la lesin (cuando se sospecha una micosis pulmonar es preferible una
muestra respiratoria que un hemocultivo).
5. Se debe evitar la utilizacin de hisopos siempre que el tipo de lesin lo permita,
pues estn contaminados frecuentemente con microbiota bacteriana. Sin

ANALISIS CLNICO

Pgina 7

SEMINARIO N02
embargo, algunas muestras (conducto auditivo, faringe, vagina, crvix) no
pueden ser recogidas de otra forma.
6. Las muestras de lesiones cerradas y abscesos suelen presentar un gran
rendimiento. Deben aspirarse con jeringa y transferirse a un contenedor estril
con solucin salina, prestando atencin a la recogida de grnulos, si los hubiese.
7. El raspado de lesiones de piel y faneras puede realizarse con distintos materiales;
los ms utilizados son bistur, moqueta o cepillo.
8. En situaciones que requieran un estudio epidemiolgico, debe establecerse la
necesidad de una recogida de muestras ambientales, familiares o animales.
9. El recipiente de recogida se identificar con los datos del enfermo (nombre y
localizacin), y debe protegerse para que no se rompa en su transporte al
laboratorio.
10. Las muestras deben ir acompaadas obligatoriamente del volante de peticin
para Microbiologa. En el cual, al menos, debe hacerse constar la siguiente
informacin: datos del paciente (nombre y apellidos, nmero de historia clnica,
fecha de nacimiento y sexo); datos clnicos (orientacin diagnstica, tratamiento
antimicrobiano, enfermedad de base y antecedentes de inters); datos del mdico
solicitante.
11. Al laboratorio se le debe informar de la sospecha de presencia de hongos
peligrosos. Tambin si se sospecha la presencia de hongos con requerimientos
especiales, as como de viajes u origen de paciente.
Los envases para la recogida de las muestras pueden variar segn el tipo de muestra a
recoger y transportar:
Tubos estriles con tapn de rosca: LCR y otros lquidos biolgicos.
Frascos estriles de boca ancha con tapn de rosca: orinas, esputos, heces,
fragmentos de tejidos, etc.
Torundas o hisopos de algodn estriles: Se usan para tomar muestras de
superficies y orificios corporales (exudados, secreciones).
Jeringas estriles: slo se admiten cuando su volumen no permita transferir la
muestra a un medio de transporte adecuado.
Frascos de hemocultivo para lquidos biolgicos.
Placas de Petri estriles.

ANALISIS CLNICO

Pgina 8

SEMINARIO N02
II.

TRANSPORTE2,4

Todas las muestras deben enviarse al laboratorio rpidamente, sin conservantes. Las
muestras deben transportarse en un recipiente estril, humidificado y a prueba de
vertidos; sin embargo, las muestras dermatolgicas pueden transportarse en un
recipiente seco (placa de Petri, papel de fotografa negro, entre dos portas). En general,
no deben introducirse en medios de transporte, a no ser que sea fcil retirar la muestra
del medio. Las muestras en que se sospeche la presencia de dermatofitos u hongos
dimrficos se conservarn a temperatura ambiente, nunca refrigerados. Los raspados
corneales y hemocultivos deben sembrase directamente en el medio de cultivo
adecuado. Si esto no fuera posible, se usarn medios de transporte adecuados o se
conservaran a 4 C. Las condiciones de transporte y almacenamiento vienen reflejadas
en la tabla 1, considerando ciertas variaciones segn el agente probable.
III.

MANEJO2,3

Todas las muestras deben manejarse como si tuvieran microorganismos potencialmente


peligrosos. Cuando una muestra se recibe en el laboratorio, y antes de procesarse, debe
someterse a una inspeccin previa para asegurarse que ha sido bien seleccionada,
recogida y transportada. Se rechazar en los siguientes casos: a) muestra no identificada,
b) transporte inadecuado o demasiado prolongado, c) muestra derramada, d) cantidad
insuficiente o inadecuada. En todos estos casos se contactar con el mdico solicitante
para pedir nueva muestra o solucionar el problema de la misma.
IV.

PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA2

Para realizar un buen diagnstico micolgico es importante que la muestra se recoja y se


transporte en condiciones idneas y que no se demore su cultivo. Aunque hay pocos
estudios sobre la disminucin de la viabilidad de los hongos a temperatura ambiente o
por la accin del hielo seco, es conocida la dificultad de recuperar Rhizopus arrhizus en
muestras en las que se demora el cultivo, y tambin, la prdida de viabilidad de algunos
hongos por la desecacin, temperatura elevada (>37 C) o baja (<10 C),
sobrecrecimiento bacteriano, presencia leucocitos, etc. La refrigeracin puede
comprometer el aislamiento de hongos dermatofitos, Malassezia spp. y H. capsulatum.
Las muestras que estn potencialmente contaminadas con microbiota bacteriana

ANALISIS CLNICO

Pgina 9

SEMINARIO N02
(muestras de piel, aspirados transtraqueales, aspirados de odo interno, muestras de
conjuntiva) deben enviarse a temperatura ambiente.
En trminos generales, los procedimientos utilizados en el laboratorio de bacteriologa
son adecuados para el cultivo de hongos, pero hay que tener en cuenta que,
habitualmente, la carga microbiana es inferior en el caso de los hongos con respecto a
las bacterias. Esto obliga a recoger mayor cantidad de muestra para obtener un
rendimiento ptimo. Las muestras inaceptables no deben procesarse y el facultativo
debe ser informado inmediatamente. Todo laboratorio debe distribuir por escrito las
normas de rechazo de muestras.
Consejos generales para optimizar el procesamiento de muestras2,4

a. Comprobar que el etiquetado de la muestra es correcto.


b. Registrar toda la informacin necesaria que pudiera afectar a la calidad de la
muestra y que represente inters diagnstico (aspecto, color, olor, consistencia,
cogulos, etc.), as como todo lo relacionado con su recogida, transporte y
conservacin.
c. Durante el procesamiento, deben seguirse todas las medidas de seguridad
necesarias, tanto para el personal como para la muestra.
d. El procesamiento debe llevarse a cabo tan pronto como sea posible para
garantizar la viabilidad del hongo, utilizando el medio de cultivo y la
temperatura de incubacin ms adecuada.
e. La recuperacin de los hongos es imprescindible para su identificacin y la
realizacin de pruebas de sensibilidad.
f. El tipo de procesamiento y los medios utilizados dependen de las caractersticas
de cada muestra.
a) MEDIOS REQUERIDOS Y CONDICIONES DE INCUBACIN3,4
El objetivo fundamental de la utilizacin de los medios de cultivo es optimizar el
crecimiento de los microorganismos. En los medios de cultivo micolgicos, los
antimicrobianos se utilizan tanto para inhibir el crecimiento bacteriano como el de otros
hongos ambientales.
A. CLASIFICACIN3
ANALISIS CLNICO

Pgina 10

SEMINARIO N02
Atendiendo a su composicin, los medios de cultivo pueden ser generales, enriquecidos,
selectivos, diferenciales y especializados:
i.

Generales: El ms caracterstico y clsico es el agar glucosado de Sabouraud


(AGS). Se utiliza como medio de cultivo general y fundamentalmente para la
realizar la descripcin de las caractersticas morfolgicas de la mayora de los
hongos.

ii.

Enriquecidos: Se utilizan especialmente en micosis sistmicas endmicas


(histoplasmosis, blastomicosis), para la recuperacin de la fase levaduriforme.
Un ejemplo de estos medios es el agar cerebro-corazn con sangre (BHI).

iii.

Selectivos: Son medios que favorecen el crecimiento de los microorganismos


deseados impidiendo el de otros. Los componentes ms utilizados como agentes
selectivos

son

antibacterianos

(cloranfenicol,

gentamicina,

penicilina,

estreptomicina) y tambin inhibidores de hongos como la cicloheximida que es


especialmente til en las muestras cutneas y respiratorias para el diagnstico de
micosis sistmicas endmicas.
iv.

Diferenciales: Se utilizan para ayudar a la identificacin del hongo basada en la


apariencia de ste en dicho medio, merced a la adicin de determinados
componentes como por ejemplo sustancias cromgenas, o indicadores de pH
como en el DTM.

v.

Especializados: Son aquellos medios que contienen algn componente (por


ejemplo, cido cafeico) destinado a aislar un agente concreto (C. neoformans),
favorecer la identificacin de ciertas especies (por ejemplo, el medio de
Czapeck), u obtener estructuras de reproduccin sexual (por ejemplo, agar
acetato, agar patatazanahoria).

B. PREPARACIN3
La buena calidad de los medios es indispensable para conseguir el aislamiento y la
identificacin de los hongos; por lo tanto, cuando se utilicen medios comerciales es
necesario tener en cuenta la garanta que aporta el proveedor y la calidad de la
distribucin. Cuando se prepara un medio deshidratado deben seguirse rigurosamente
las instrucciones del fabricante, evitando errores en la forma de disolverlos o
suspenderlos, en la temperatura y duracin de la esterilizacin para que no se afecte la
calidad del producto final. Algunos antibiticos deben aadirse al medio una vez
ANALISIS CLNICO

Pgina 11

SEMINARIO N02
esterilizado y a la temperatura adecuada, para que no se inactiven por las altas
temperaturas de la esterilizacin.
C. CONTROL DE CALIDAD3
Para asegurar la correcta utilizacin de los medios, deben controlarse peridicamente
sus caractersticas ms importantes: apariencia, esterilidad, pH y funcionamiento. El
funcionamiento se puede evaluar utilizando las cepas de control adecuadas para cada
medio.
D. SOPORTE3
El soporte habitual para los medios de cultivo en Micologa suelen ser tubos de cristal o
placas de Petri (90 mm). Los tubos tienen la ventaja de soportar incubaciones
prolongadas y aumentan la seguridad en el caso de sospecha de micosis endmicas. Si
se utilizan tubos, deben incubarse en posicin horizontal las primeras 24 horas para que
el inculo no se concentre en el fondo. Los tubos deben de ser de boca ms ancha que
los habituales en bacteriologa, porque en ellos, las colonias no son fciles de aislar. Si
los tubos utilizados son de tapn de rosca, el cierre debe mantenerse parcialmente
abierto para garantizar las mejores condiciones atmosfricas. Cuando se eligen placas,
es conveniente que contengan 40 ml de medio para evitar que se sequen, y deben
cerrarse con cinta adhesiva para que no se abran involuntariamente, protegiendo al
personal de los hongos patgenos y evitando la contaminacin con hongos externos. El
precintado debe ser permeable al aire, ya que cuando el aire circula libremente se
favorece la produccin de pigmento y la superficie del agar se seca, permitiendo el
desarrollo de micelio areo y esporas.
E. ALMACENAMIENTO3
Los medios se deben guardar refrigerados a 2-8C. Para mejorar su conservacin y
prevenir la desecacin, es aconsejable invertir las placas e introducirlas en bolsas de
plstico. Las placas de Petri suelen conservarse en buen estado unos tres meses,
mientras que los medios semislidos o lquidos en tubo de tapn de rosca se conservan
bien hasta 6 meses. Sin embargo, ciertos medios, al contener sustancias inestables
(antibiticos, vitaminas, sangre, etc.), no se conservan en buen estado tanto tiempo.
Tambin hay que tener presente que algunos componentes de ciertos medios pueden
verse afectados por la luz, por lo que estos medios deben almacenarse en contenedores
ANALISIS CLNICO

Pgina 12

SEMINARIO N02
opacos. Como norma general, todos los medios deben utilizarse antes de la fecha de
caducidad indicada por el fabricante y, antes de su utilizacin, deben atemperarse,
durante unos minutos, a temperatura ambiente.
F. ELECCIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO3,4
Los medios ms utilizados en el cultivo de hongos son: agar Sabouraud glucosa (AGS),
habitualmente con la modificacin de Emmons, con cloranfenicol y con/sin actidiona;
agar infusin cerebro corazn (BHI) con o sin sangre de cordero al 5%, con o sin
antibacterianos; agar inhibidor para mohos (MIA); y agar patata glucosa (APG). Sin
embargo, los hongos tambin pueden crecer en medios no selectivos, incluidos la
mayora de los medios bacteriolgicos, si se incuban el tiempo suficiente. La eleccin y
el nmero de medios a utilizar estn condicionados por el coste, la disponibilidad y las
preferencias personales, pero siempre se deben incluir medios con antibacterianos y sin
ellos. La incorporacin de cicloheximida (actidiona), inhibidor de muchos hongos
considerados contaminantes, ayuda especialmente en las micosis de la piel, aunque
pueda inhibir algunos patgenos fngicos importantes; por ello, debe utilizarse siempre
en combinacin con otro medio sin cicloheximida. Los medios de cultivo ms
empleados en micologa pueden agruparse en dos categoras en funcin de su utilidad:
aislamiento e identificacin.
Para el aislamiento, la utilizacin de 3-4 medios prcticamente cubre todas las
necesidades: AGS con/sin antimicrobianos; un medio con cicloheximida y agar infusin
cerebro corazn, para las micosis sistmicas endmicas. Para la identificacin, puede ser
necesario un nmero mayor de medios que depender del nmero de muestras, las
etiologas ms probables en la zona geogrfica, las posibilidades del laboratorio y el
nivel diagnstico esperable segn el tipo de centro.
i.

Agar Czapek Dox: se utiliza en el cultivo de hongos saprofitos, especialmente


Aspergillus spp.y Penicillium spp. Es el medio de referencia para la
identificacin de Aspergillus spp.

ii.

Agar de patata glucosa (APG): es un medio utilizado para la estimulacin de la


formacin de conidias, en la preparacin de inculos de hongos miceliales y en
la estimulacin de produccin de pigmentos: rojo en Trichosporum rubrum, rosa
salmn en Microsporum audouinii y amarillo en Microsporum canis. Se utiliza
con frecuencia en microcultivos para observar las caractersticas morfolgicas.

ANALISIS CLNICO

Pgina 13

SEMINARIO N02
iii.

Agar de Staib. Agar semillas de Nger (Guizottia abyssinica): utilizado para


aislar Cryptococcus spp. y C. neoformans. Este ltimo es el nico que posee
fenol oxidasa, que le permite la formacin de un pigmento similar a la melanina
a partir del cido cafeico, un catecol, que posee la semilla. El cloranfenicol lo
convierte en medio selectivo. Existen medios semisintticos que incorporan el
cido cafeico y evitan la utilizacin de esta semilla.

iv.

Agar Dixon modificado: utilizado en el cultivo de Malassezia spp. Puede


modificarse aadiendo cloranfenicol o bien cloranfenicol y cicloheximida.

v.

Agar glucosado de Sabouraud modificado por Emmons: es el medio estndar


para el aislamiento, esporulacin y conservacin de muchos hongos. Su pH y la
concentracin de glucosa favorecen la esporulacin.

vi.

Agar infusin de cerebro corazn: puede utilizarse como medio enriquecido para
facilitar el crecimiento de C. neoformans a partir de muestras estriles como el
LCR y el mantenimiento de la fase levaduriforme de algunas micosis sistmicas,
ya sea con sangre o sin ella. En general, est indicado para el aislamiento de una
gran variedad de patgenos, incluyendo levaduras, mohos y bacterias como
Nocardia. Enriquecido con sangre de carnero al 10%, se utiliza para el
aislamiento de todos los hongos, incluyendo los hongos dimrficos. Pueden
aadirse antibacterianos (cloranfenicol y/o gentamicina) para convertirlo en
selectivo. En algunas ocasiones tambin puede completarse con cicloheximida
(facilita el aislamiento de Histoplasma capsulatum y Blastomyces dermatitidis).

vii.

Agar inhibidor de mohos: es un medio enriquecido que contiene cloranfenicol o


gentamicina, pero no actidiona. Se utiliza en el aislamiento de hongos sensibles
a la cicloheximida (Cryptococcus, zigomicetos, etc.) a partir de muestras
contaminadas. Permite el desarrollo de la mayora de los mohos y de las
levaduras.

viii.

Agar Leeming y Notman (ALN): utilizado en el cultivo de Malassezia spp.


Puede

modificarse

aadiendo

cloranfenicol

bien

cloranfenicol

cicloheximida.
ix.

Agar Sabouraud con cicloheximida y cloranfenicol: es un medio selectivo


utilizado para el aislamiento de hongos patgenos a partir de muestras muy
contaminadas con hongos saprofitos y bacterias. Se utiliza fundamentalmente en
el aislamiento de dermatofitos y hongos dimrficos. Inhibe algunas especies de

ANALISIS CLNICO

Pgina 14

SEMINARIO N02
hongos de inters mdico (Candida no albicans, Aspergillus, zigomicetos, C.
neoformans, etc.).
x.

Agar Trichophyton (1 a 7): son siete medios que se utilizan en la identificacin


de especies de Trichophyton basndose en sus requerimientos nutricionales.

xi.

Agar urea de Christensen: se utiliza en la identificacin de algunos dermatofitos,


especialmente Trichophyton rubrum de Trichophyton mentagrophytes y de
algunas levaduras (C. neoformans).

xii.

Medios cromognicos para levaduras: contienen diversos sustratos enzimticos


que estn unidos a compuestos cromognicos. Muy til para el estudio de
levaduras.

xiii.

Dermatophyte test medium: medio utilizado para el aislamiento de dermatofitos


en muestras muy contaminadas, proporcionando una identificacin presuntiva.
Los dermatofitos producen alcalinizacin, virando el medio de amarillo a rojo.
Algunas bacterias y algunos hongos tambin pueden producir alcalinizacin.
Debido a que se trata de un medio coloreado, no es un medio til para la
caracterizacin de los pigmentos producidos por los dermatofitos. La
cicloheximida inhibe muchos de los hongos saprofitos.

xiv.

Agar harina de maz con/sin Tween 80: se utiliza en el cultivo y diferenciacin


de especies de Candida basndose en las caractersticas miceliales. El Tween 80
se incorpora para demostrar la formacin de clamidoconidias. Si se le aaden 10
g de glucosa puede utilizarse en la diferenciacin de T. rubrum y T.
mentagrophytes basndose en la produccin de pigmento.
G. INCUBACIN3,4

La temperatura ptima de crecimiento de la mayora de los hongos patgenos es 30 C.


Sin embargo, Sporothrix schenckii es una excepcin, crece ms rpido a 2728 C. Hay
laboratorios que utilizan la temperatura ambiente en lugar de 30C, pero no es
recomendable, ya que los cambios de temperatura son notables entre el da y la noche en
la mayora de los laboratorios. La temperatura de 37C no se recomienda por dos
razones principales: 1) muchas muestras contienen abundantes bacterias que crecen muy
bien a esta temperatura; 2) algunos hongos crecen mal a esta temperatura o no crecen,
especialmente los hongos que infectan la piel. No hay ventaja en incubar
simultneamente a 30C y a 37C. La temperatura de 37C debe reservarse para hongos
ANALISIS CLNICO

Pgina 15

SEMINARIO N02
dimrficos o algn hongo que se desarrolle mejor a esta temperatura. No obstante,
tambin es necesaria una estufa a 37C para verificar la tolerancia a esta temperatura.
Sin embargo, utilizar 37C para el aislamiento del estadio levaduriforme de
Histoplasma o Blastomyces no aporta ventajas y, adems, son morfolgicamente
indistinguibles de otras levaduras. Los cultivos de hongos deben incubarse durante 3-4
semanas antes de ser desechados, y no deben desecharse cuando se asla un hongo, sino
que debe completarse el periodo de incubacin. Sin embargo, hay muestras que se
pueden eliminar antes (por ejemplo, exudado vaginal), a los 7 das, cuando se realizan
cultivos habituales.

EXAMEN DIRECTO. IDENTIFICACIN DE LOS HONGOS FILAMENTOSOS

La identificacin de hongos filamentosos (mohos) son: el tipo de talo. la morfologa


macroscpica del micelio, micelio areo y profundo, es decir, las caractersticas
coloniales, tanto de frente como en el reverso. Las colonias de hifas son macroscpicas
de variados aspectos y colores(algodonoso, aterciopelado, polvoso). La morfologa
microscpica del micelio se refiere al tipo de hifa estructura y modo de formacin del
cuerpo reproductivo sexual, tipo de esporas, tamao, aspecto externo, agrupacin,
nmero de clulas, flagelos. Las levaduras forman colonias semejantes a las bacterianas.
Para la identificacin de levaduras, se requiere reconocer adems de la morfologa, la
determinacin de caractersticas fisiolgicas y bioqumicas, especialmente su accin
sobre azcares.5
La identificacin de los hongos filamentosos se lleva a cabo por el aspecto de las
colonias y fundamentalmente por la morfologa microscpica del micelio de las esporas
y de las estructuras en las que se forman, que suelen ser caractersticas del gnero o
incluso de la especie, por tanto, su identificacin se basa en la observacin
microscpca, aunque algunas caractersticas metablicas pueden ayudar a la
identificacin, particularmente la exigencia en factores esenciales de crecimiento.
Cuando se corta con el asa micolgica un fragmento de una colonia micelal y se
transfiere a un portaobjetos o incluso si se emplea la tcnica del celo, con frecuencia la
estructuras se alteran y fragmentan y no pueden visualizarse intactas, lo que impide la
correcta identificacin del hongo, aunque permite la diferenciacin entre hongos
filamentosos inferiores y superiores.6

ANALISIS CLNICO

Pgina 16

SEMINARIO N02
Para obviar este hecho y poder observar sin distorsin el micelio y las estructuras de
reproduccin asexual, es preferible recurrir al microcultivo. La tcnica del microcultivo
consiste en cortar de una Placa Petri con agar Saboraud un dado de 1 cm sobre y
depositarlo sobre un portaobjetos estril situado en otra placa de Petri vaca. A cada
lado del cubo de agar se inocula el hongo filamentoso. Se coloca sobre el agar un
cubreobjetos y se coloca la tapa de la placa Petri incubndose en ambiente hmedo.
Cuando el micelio crece, al cabo de unos das, se expande como una planta trepadora
por la cara inferior del cubreobjetos, el cual puede tomarse con cuidado y ponerse sobre
un portaobjetos en el que previamente se haya depositado una gota de colorante de
contraste, como el azul de actofenol. as, pueden observarse las estruturas fngicas sin
distorsin. Se han comercializaado sistemas que facilitan el desarrollo de esta tcnica. 6

La identificacin inicial de los hongos dimrficos suele basarse en las caractersticas


morfolgicas de las estructuras de reproduccin asexual, que se observan sembrando en
el hongo en agar Saboraud incubado a 28C, donde crece en la forma
filamentosa(esporulada). Para demostrar su
dimorfismo trmico se realizan resiembra
en medio con sangre y se incuba a 37C
durante varios das.2
Consideraciones Generales sobre la
identificacin
de
los
hongos
7
filamentosos
Para
identificar
hongos
filamentosos se requiere una combinacin
de:
La

velocidad

del

crecimiento
Las caractersticas
morfolgicas de las colonias
Las caractersticas
morfolgicas microscpicas
En la mayora de los casos el ltimo item proporciona los datos ms concluyentes para
la identificacin. La determinacin de la velocidad de crecimiento puede ser la medida
ms util cuando se examina el cultivo de un hongo filamentoso pero es posible que
tenga un valor limitado porque la velocidad de crecimiento de ciertos hongos vara en
funcin de la cantidad de inculo presente en la muestra clnica. En general la velocidad
de crecimiento de los hongosdimorfos como B. dermatidis; h. capsulatum y P.
brasiliensis es baja y se requieren de 1 a 4 semanas para que las colonias se tornen
visibles. El crecimiento de C. imunitis suele ser rpido y riesgoso para los
bacterilogos. Sin embargo, en algunos casos los cultivos de B. dermatidis e H.
capsulatum pueden observarse en el curso de 3 a 5 das, una circunstancia poco
frecuente que se presenta solo cuando hay grandes cantidades de la muestra. Las
colonias de los cigotos pueden aparecer dentro de las 24 horas mientras que los otros
hongos hialinos y dematiceos a menudo crecen en 1 a 5 das. En consecuencia, la
ANALISIS CLNICO

Pgina 17

SEMINARIO N02
velocidad de crecimiento de un hongo es importante pero debe utilizarse jutno con otras
caractersticas antes de realizar una identificacin definitiva.
Las caractersticas morfolgicas de las colonias pueden tener un valor limitado en la
identificacin de los hongos filamentosos debido a la variacin natural entre los
aislamientos y las colonias desarrolladas en medios de cultivo diferentes. SI bien es
posible reconocer hongos comunes aislados en formarepetida en el laboratorio , la
morfologa de la colonia es un criterio no fiable y debe utilizarse solo como
complemento de las caractersticas morfolgicas microscpicas. Deben considerarse las
condiciones de incubacin y los medios de cultivo. Por ejemplo H. capsulatum, que en
agar infusin de cerebro y corazn aparece como un hongo filamentoso algodonoso de
color blanco a ocre, puede aparecer levaduriforme cuando se desarrolla en el mismo
medio enriquecido con sangre.
En general las caractersticas morfolgicas, microscpicas de los hongos filamentosos
son estables y su variacin es mnima. l identificacin definitiva se basa en la forma
caracterstica, en el modo de reproduccin y en la dispocisin de las esporas; sin
embargo el tamao de las hifas tambin proporcionainformacin til. La hifas grandes
similares a cintas y con pocos tabiques de los cigomicetos, se reconocen con facilidad
mientras que las hifas pequeas (de alrededor de 2 um de dimetro) pueden sugerir la
presencia de un hongo dimrfico o de un dermatofito.

IDENTIFICACION DE LEVADURAS DE IMPORTANCIA CLINICA


La identificacin de la especie de toda levadura aislada en sangre o en cualquier otro
lquido corporal estril est plenamente justificada. Sin embargo, debido a que los
organismos levaduriformes forman parte de la flora normal de piel y mucosas, el
aislamiento de levaduras a partir de hisopos nasofarngeos, esputo, lavados bronquiales,
orina, raspados de uas, muestras vaginales o heces puede cuestionar su significado
clnico. No obstante, el aislamiento reiterado de levaduras en diferentes muestras
clnicas del mismo paciente es sugestivo de infeccin por el microorganismo aislado y
requiere la identificacin de la especie causal.

1- IDENTIFICACION MEDIANTE CRITERIO MORFOLOGICO


1.1.Criterios macroscpicos
Estos criterios tienen en cuenta el aspecto de las colonias de levaduras al crecer en los
diferentes medios de cultivo.
La mayora de los organismos levaduriformes crecen fcilmente en un gran nmero de
medios de cultivo usados rutinariamente en el laboratorio de Microbiologa (agar
sangre, agar chocolate, agar Cled, etc.). Sin embargo, el agar glucosado de Sabouraud
(SDA), con o sin antibiticos aadidos, es el medio de aislamiento por excelencia para
la identificacin de levaduras.
ANALISIS CLNICO

Pgina 18

SEMINARIO N02
En el medio SDA las colonias de levaduras suelen ser completas, ligeramente
abombadas o planas, de consistencia mantecosa, lisas (Figura 11.1) o rugosas (Figura
11.2), con olor dulzn agradable, volvindose ms pastosas a medida que envejecen.
Por lo general las colonias de levaduras no desarrollan micelio areo, aunque en
ocasiones pueden aparecer prolongaciones aracneiformes en la periferia de las colonias.
Si se observa un micelio areo definido, debe considerarse la posibilidad de que se trate
de un hongo dimrfico o de ciertas especies de levaduras que pueden formar micelio
verdadero como Geotrichum (Figura 11.3), Galactomyces, Trichosporon (Figura 11.4)
o Blastoschizomyces (su teleomorfo Dipodascus).
Una colonia de aspecto y consistencia mucoide sugiere la formacin de cpsulas y
puede ser el paso inicial para la identificacin de Cryptococcus neoformans (Figura
11.5).
Las colonias de color rojo-anaranjado o naranja, de aspecto cremoso o rugoso, son
caractersticas de las especies del gnero Rhodotorula (del gr. rhodo, rojo) (Figura 11.6)
y Sporobolomyces (anaranjado), color que manifiestan estas levaduras por su riqueza en
carotenoides. Pero no todas las colonias blancas y cremosas son levaduras; las especies
de algas acloroflicas del gnero Prototheca, tras incubacin a 28 C durante 3-4 das,
desarrollan unas colonias blancas cremosas muy parecidas a las producidas por el
gnero Candida (Figura 11.7).

1.2. Criterios microscpicos


Ciertas caractersticas microscpicas son muy tiles para la identificacin de algunas
especies de levaduras. Las ms utilizadas en la prctica son las siguientes:
Prueba del tubo germinal o filamentacin precoz.- El tubo germinal es una
extensin filamentosa de la levadura, sin estrechamiento en su origen, cuyo ancho suele
ser la mitad de la clula progenitora y su longitud tres o cuatro veces mayor que la
clula madre. (Figura 11.8).

ANALISIS CLNICO

Pgina 19

SEMINARIO N02

ANALISIS CLNICO

Pgina 20

SEMINARIO N02
Slo C. albicans es capaz de producir verdaderos tubos germinales; sin embargo, otras
especies como C. tropicalis pueden producir pseudohifas precoces de aspecto similar a
los tubos germinales pero con una zona de constriccin caracterstica adyacente a la
clula madre, por lo que esta prueba es til para diferenciar C. albicans del resto de las
especies de Candida, aunque no est exenta de falsos negativos.
Metodologa
1. Emulsionar una porcin de la colonia aislada en 0,5 ml de suero humano o de conejo.
2. Incubar a 35 C durante 2 h.
3. Depositar una gota de la emulsin sobre un portaobjetos limpio y desengrasado,
colocar un cubreobjetos y visualizar a x100, x400 x1.000. Interpretacin: La prueba
es positiva si se visualizan tubos germinales (Figura 11.8). Variante: Adems de la
tcnica con suero, el test de filamentacin puede realizarse utilizando otros medios de
cultivo:
a) Plasma de conejo: Berardinelli y Opheim, describieron un medio de induccin de
tubos germinales constituido por tres partes de coagulasa plasmtica de conejo con
EDTA (BBL Microbiology Systems) y dos partes de caldo Try-Soy (Scott Laboratories,
Inc). La inoculacin, incubacin e interpretacin son similares a la tcnica con suero.
b) Medio de cultivo slido Oxgall-Tween-cido cafeico (TOC): [Oxgall 10 g, agar
20 g, Tween 80 (solucin al 10%) 10 ml, cido cafeico 0,3 g, agua destilada 1.000 ml].
La utilizacin de este medio permite la visualizacin del tubo germinal y tambin de
clamidosporas [2]. Para su realizacin se estra una pequea porcin de la colonia sobre
al agar TOC y a continuacin se coloca con suavidad un cubre-objetos estril
(flamendolo suavemente) sobre la superficie inoculada (para evitar la acumulacin de
humedad es preciso no presionar el cubre-objeto sobre a superficie del agar). Se incuba
a 35 C, en 10% de CO2, durante 2 h, manteniendo la tapa de la placa ligeramente
abierta para que todo el cultivo sea alcanzado por el CO2. La prueba es positiva si se
visualizan los tubos germinales en la zona de inoculacin a bajo aumento (x100- x400).
Formacin de hifas, blastoconidias, clamidosporas y artrosporas.- La
formacin de hifas, blastoconidias, clamidosporas o artrosporas por parte de las
levaduras constituye una caracterstica morfolgica de gran importancia para la
identificacin de algunas especies de levaduras.
Ante la presencia de estructuras con aspecto de hifas, lo primero que hay que
determinar es si se trata de pseudohifas (resultantes del proceso de formacin de
blastoconidias y, por tanto, con puntos regulares de estrechamiento) o, por el contrario,
son verdaderas hifas que se fragmentan en artroconidias. Si el desarrollo en medios
especiales (ver ms adelante) revela la presencia de seudohifas y blastoco-nidias, la
levadura a identificar pertenece a alguna especie del gnero Candida. Si por el
contrario, revela verdaderas hifas y artroconidias, lo ms probable es que se trate de
especies de Trichosporon, Geotrichum, Galactomyces o Blastoschizomyces.
Trichosporon y Blastoschizomyces producen tanto artroconidias como blastoconidias;
estas ltimas nacen en brotes de los ngulos de las artroconidias adquiriendo la forma
caracterstica de oreja de conejo (Figura 11.9). Las especies
Galactomyces geotrichum (Geotrichum candidum) y Blastoschizomyces capitatus
(Geotrichum capitatus) tambin producen blastoconidias a partir del ngulo de la
artroconidia, pero, en este caso, forman una estructura denominada palo de hockey
(Figura 11.10). C. tropicalis produce pequeas cantidades de blastoconidias, muy
esparcidas o en pequeos grupos a lo largo de las hifas. Sin embargo, C. parapsilosis,
ANALISIS CLNICO

Pgina 21

SEMINARIO N02
C. kefyr y C. krusei se ordenan a lo largo de una corriente de blastoconidias, siendo esta
la caracterstica que permite su identificacin; adems, algunas cepas pueden producir
hifas gigantes.
Las clamidosporas son formas de resistencia, redondas u ovales, de 6-12 m de
dimetro y pared gruesa, con aspecto de esporas laterales o terminales. Su produccin es
caracterstica y diagnstica de C. albicans [3] (Figura 11.11). Tambin puede hacerse
una identificacin presuntiva de esta especie si se observa la formacin de grupos
compactos de blastoconidias, a intervalos regulares, a lo largo de la pseudohifa.

ANALISIS CLNICO

Pgina 22

SEMINARIO N02

ANALISIS CLNICO

Pgina 23

SEMINARIO N02
2. Identificacin mediante criterios bioqumicos
2.1. Criterios bioqumicos enzimticos
Medios cromognicos
Estos medios estn diseados para el aislamiento e identificacin de algunas especies
del gnero Candida tras su incubacin a 30-37 C durante 24 a 48 h.
El fundamento de los mismos se basa en la deteccin de determinadas actividades
enzimticas por parte de las levaduras mediante la hidrlisis especfica de un sustrato
cromognico en presencia de un indicador de la enzima. Una de las principales ventajas
de estos medios es permitir diferenciar fcilmente los cultivos mixtos.
Estos medios pueden ser utilizados como medios de aislamientos primarios o con fines
de identificacin, despus del aislamiento de los organismos levaduriformes en los
medios convencionales. Aunque, segn nuestra experiencia, slo debera utilizarse
como medio de aislamiento primario en aquellas muestras con alta sospecha de micosis
por levaduras.
CHROMagar Candida
El medio CHROMagar Candida (CHROMagar) fue descrito por Odds y Bernaerts en
1994 para identificar las especies clnicamente importantes del gnero Candida [6].
CHROMagar Candida permite diferenciar C. albicans, C. tropicalis, C. krusei, y C.
glabrata en funcin de los colores que desarrollan en este medio.
La siembra se realiza segn las tcnicas tradicionales y las placas se incuban a 30-37 C
durante 48 h para que las levaduras desarrollen completamente el color. Al cabo de este
tiempo, las colonias de C. albicans son lisas y de color verde esmeralda, a diferencia de
C. dubliniensis que desarrolla un color verde oscuro y que, adems, es incapaz de crecer
a 45 C [7]. C. tropicalis produce colonias azul oscuro con un halo prpura-marrn en
el agar que la rodea. C. krusei forma colonias rugosas con el centro rosado y el borde
blanco. C. glabrata manifiesta un color violeta morado. Las dems especies desarrollan
colores y tonalidades diversas que no permiten su identificacin por este medio (Figuras
11.16 y 11.17).
COLOREX Candida
Colorex Candida (Biomedics) es un nuevo medio cromgenico y diferencial que
facilita la identificacin presuntiva de algunas de la levaduras de mayor importancia en
clnica (C. albicans, C. tropicalis y C. krusei).
La siembra se realiza segn las tcnicas habituales y las placas se incuban a 30-37C,
segn el origen de la muestra, durante 24-48 h. En este medio, C. albicans desarrolla
colonias verdes, C. tropicalis azules-grisceas y C. krusei colonias rosas rizadas.

ANALISIS CLNICO

Pgina 24

SEMINARIO N02

ANALISIS CLNICO

Pgina 25

SEMINARIO N02

Cromogen Albicans
Cromogen Albicans (Biomedics) es un medio diferencial y selectivo utilizado para el
aislamiento e identificacin de C. albicans en muestras vaginales, rectales, escamas,
orina, pus, escobillonados
bucales, etc. La siembra se realiza segn las tcnicas habituales y las placas se incuban a
30-37 C, segn el origen de las muestras, durante 24-48 h. Las colonias de C. albicans
adquieren un color azul verdoso caracterstico, dependiendo del periodo de incubacin y
la temperatura, con formas redondeadas, lisas y ligeramente elevadas. Las otras especies
de levaduras aparecen de color blanco cremoso y necesitan una identificacin
bioqumica posterior.
Candida ID
El medio Candida ID (bioMrieux) es un medio cromognico que permite el
aislamiento de organismos levaduriformes, la identificacin presuntiva de C. albicans y
cierta orientacin para la identificacin de otras especies no albicans. La inoculacin e
incubacin son similares a las descritas para otros medios cromognicos.
En Candida ID, las colonias de C. albicans son redondeadas, ligeramente convexas,
lisas, de bordes netos y de color azul (cuya intensidad vara en funcin del tiempo de
incubacin). Las colonias de C. tropicalis, C. lusitaniae, C. guilliermondii y C. kefyr
desarrollan un color rosa a las 48 h de incubacin.
Otras especies, como C. famata, C. humicola, y Cryptococcus neoformans, pueden
originar colonias rosas ms o menos intensas. El resto de las especies desarrolla un
color blanco-crema, requiriendo una identificacin bioqumica posterior (Figura 11.18).
Albicans ID2
El medio Albicans ID2 (bioMrieux) es muy parecido al anterior. Se ha enriquecido la
frmula para facilitar el aislamiento y la identificacin de las colonias de C. albicans
que desarrollan un color azul ms intenso. Adems, permite, la identificacin presuntiva
de C. tropicalis ya que presenta una tonalidad verdosa en este medio. Las colonias de
las dems especies son de color blanco. La inoculacin e incubacin son similares al
medio anterior.
Candida ID2 (CAN2)
El medio Candida ID 2 (bioMrieux) es un medio cromognico destinado al aislamiento
selectivo de levaduras, identificacin de la especie C. albicans y diferenciacin
presuntiva de un conjunto de especies como C. tropicalis, C. lusitaniae y C. kefyr. Este
medio se ha presentado como una modificacin de la formula anterior (medio
CandidaID-CA) . La inoculacin e incubacin se llevar a cabo igual que en los casos
anteriores, tras 24-48 h. a 30-37C, se observar el color de las colonias. Azul plido a
azul oscuro es propio de C. albicans; rosa es caracterstico de C. tropicalis, C.
lusitaniae y C. kefyr, la identificacin de estas especies debe continuarse por pruebas
bioqumica y/o inmunolgicas. Las colonias de color blanco crema no pueden
identificarse de forma presuntiva por lo que deben utilizarse tcnicas bioqumicas y/o
inmunolgicas
ANALISIS CLNICO

Pgina 26

SEMINARIO N02
CandiSelect
El medio CandiSelect (Bio-Rad) es un medio selectivo que permite la identificacin de
C. albicans mediante la hidrlisis del sustrato cromognico presente lo que origina el
desarrollo de un color azul por las colonias de esta especie. La inoculacin e incubacin
son similares a los otros medios romognicos. C. albicans se identifica por la presencia
de colonias lisas azules y el resto de las levaduras manifiesta un color blanco en sus
colonias. A las 48 h de incubacin, algunas cepas de C. tropicalis y Trichosporon spp.
Pueden tambin desarrollar colonias azules, pero morfolgicamente son diferentes a C.
albicans.
Fluoroplate Candida
El Agar Fluoroplate Candida (Merck) permite identificar macroscpicamente C.
albicans por su capacidad de hidrolizar el sustracto 4-metilumbeliferil- N-acetil--Dgalactosaminida, por la enzima
N-acetil-galactosaminidasa (NAGasa), originando una fluorescencia blanquecina al
iluminar la placa con luz ultravioleta. El resto de las especies no presenta fluorescencia.
La siembra en este medio se realiza de forma convencional y las placas se incuban a 3037 C durante 18-24 h. La lectura se realiza, en la oscuridad, colocando las placas sobre
un transiluminador de luz ultravioleta de 365 nm (Linus).

2.2. Identificacin basada en mtodos de asimilacin de nutrientes


Auxonograma convencional
Se fundamenta en la aplicacin por separado de diferentes nutrientes, hidrocarbonados o
nitrogenados, sobre un medio sinttico base para apreciar el crecimiento selectivo de
una levadura en la cercana de los nutrientes necesarios para su desarrollo. Para su
realizacin pueden emplearse soluciones acuosas esterilizadas por filtracin, cilindros
de Oxford en pocillos hechos en el agar o bien discos de papel absorbente empapados
con el nutriente. Sin embargo, las pruebas de asimilacin en medios lquidos no ofrecen
ninguna ventaja adicional sobre los medios slidos, resultando mucho ms laboriosas y
costosas.
Medios de cultivo base. Se prepararan segn la tcnica habitual y no necesitan ajustar
el pH. Se expenden deshidratados como media base de levaduras.
Auxacolor
La galera Auxacolor (Bio-Rad) es un sistema de identificacin basado en la asimilacin
de 13 azcares que permite identificar 26 especies diferentes de levaduras. El
crecimiento de la levadura se visualiza por el cambio de un indicador de pH. La galera
incorpora, adems, una prueba de resistencia a la actidiona y otra para la deteccin de la
actividad fenol-oxidasa de C. neoformans.

ANALISIS CLNICO

Pgina 27

SEMINARIO N02
Sistema Uni-Yeast-Tek
El sistema Uni-Yeast Tek (Remel) est constituido por una placa plstica con mltiples
compartimentos que contienen un medio con agar para la asimilacin diferencial de
siete hidratos de carbono.
Tambin incorpora una cubeta central con agar harina de maz-Tween 80 para
determinar el crecimiento micelial y la produccin de clamidosporas. Adems, est
provisto de agar urea, agar para la asimilacin y reduccin de nitratos y de un caldo con
extracto de carne al 2,6% (con 0,05% de glucosa) para realizar la prueba del tubo
germinal.
2.3. Sistemas semiautomticos
En la actualidad se han comercializado diversos mtodos de asimilacin de nutrientes
que simplifican tanto su uso como su interpretacin
API 20C AUX
La galera API 20 C AUX (bioMrieux) se compone de 20 cpulas con sustratos
deshidratados que permiten realizar 19 pruebas de asimilacin. Las cpulas se inoculan
con un medio mnimo semislido y las levaduras slo se reproducen si son capaces de
utilizar el sustrato correspondiente.
Permite identificar un total de 34 especies diferentes. La lectura de estas reacciones se
hace por comparacin con un control de crecimiento y la identificacin se obtiene, a
partir de un cdigo numrico, mediante un catlogo analtico o un programa
informtico.
Galera ID 32C
La galera ID 32 C (bioMrieux) est compuesta por diferentes pruebas de asimilacin y
por una base de datos especialmente adaptada. Permite identificar 63 especies diferentes
de organismos levaduriformes o relacionados y puede ser utilizada manualmente o bien
de forma automatizada mediante los sistemas ATB Expression o mini API.
La galera se compone de 32 cpulas: 29 contienen cada una un sustrato carbonado
deshidratado, una es el control negativo, otra detecta la sensibilidad a la cicloheximida y
la ltima es una prueba colorimtrica para la esculina. El procedimiento para la
inoculacin de la galera, incubacin e interpretacin es similar al descrito para el
sistema API 20 C AUX. La nica diferencia es la posibilidad de realizar la lectura de la
galera, de forma automtica, mediante el sistema ATB Expression o mini API.
Sistema Vitek
Las tarjetas Yeast Biochemical Card (YBC) del sistema Vitek (bioMrieux) permiten la
identificacin de organismos levaduriformes y afines de forma automatizada. Son unas
tarjetas plsticas desechables que incluyen 30 celdillas: 26 pruebas bioqumicas
convencionales y 4 controles. Por otra parte, el sistema Vitek consta de un mdulo con
cmara de vaco para inoculacin de las tarjetas, un lector/incubador, un sistema
automtico de manipulacin de tarjetas, un fotmetro para medir la densidad ptica, un
ordenador central y una impresora.
El sitema Vitek permite identificar 36 especies diferentes de levaduras: 16 especies del
gnero Candida, 6 Cryptococcus, 3 Rhodotorula, 2 Trichosporon, 3 Geotrichum, 2
ANALISIS CLNICO

Pgina 28

SEMINARIO N02
Prototheca, Hansenula anomala, Pichia ohmeri, Saccharomyces cerevisiae y Yarrowia
lipolytica.
2.4. Sistemas automticos
Sistema Vitek 2
El sistema Vitek 2 (bioMrieux) es un sistema totalmente automtico para la deteccin
del metabolismo fngico que puede identificar levadu-ras y organismos afines en tan
slo 15 h. Est basado en ecnologa de fluorescencia y se compone de las tarjetas de
anlisis con 63 pocillos, una consola satlite para la recogida de informacin, un
mdulo incubador, un mdulo principal donde se procesa la informacin gracias a un
software de anlisis y un sistema experto avanzado.
2.5. Identificacin rpida de levaduras mediante pruebas bioqumicas y
enzimticas
RapID Yeast Plus System
El RapID Yeast Plus System (Remel) es un sistema compuesto por un panel de 18
pocillos; cada uno contiene un sustrato convencional o cromognico que detecta la
asimilacin de carbohidratos, cidos orgnicos o aminocidos, as como la hidrlisis de
la urea y de cidos grasos. Permite identificar hasta 43 especies de levaduras.
Fongiscreen 4H
Fongiscreen 4H (Bio-Rad) es un sistema basado en el estudio del perfil enzimtico de
algunas levaduras, permitiendo identificar en 4 h C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis
y C. neoformans. La utilizacin de sustratos deshidratados por las enzimas fngicas se
manifiesta por un cambio de color, ya sea espontneamente o despus de aadir un
reactivo revelador.
3. Identificacin mediante criterios inmunolgicos
3.1. Bichro-latex albicans
Bichro-latex albicans (Fumouze) es un mtodo para la identificacin rpida de
aislamientos C. albicans por aglutinacin de partculas ltex utilizando un anticuerpo
monoclonal especfico de C. albicans.
a) bolas de ltex recubiertas con anticuerpos monoclonales que reaccionan
especficamente con el antgeno de C. albicans localizado en su pared celular, y
b) un agente disociante que permite la exposicin al antgeno.

3.2. Krusei-color
Krusei-color (Fumouze) es un mtodo para la identificacin de aislamientos de C.
krusei por aglutinacin de partculas de ltex, mediante un anticuerpo monoclonal que
reacciona especficamente con el antgeno localizado en su pared.

ANALISIS CLNICO

Pgina 29

SEMINARIO N02
3.3. Bichro-Dubli
Bichro-Dubli (Fumouze) es un mtodo para la identificacin rpida de C.
dubliniensis, basado en la coaglutinacin de blastosporas de esta especie con partculas
de ltex recubiertas con anticuerpos monoclonales, el cual permite la deteccin
especifica de un antgeno de C. dubliniensis localizado en la superficie de la clula. La
emulsin de colonias de C. dubliniensis en el reactivo Bichro-Dubli revela una
coaglutinacin, visible a simple vista, entre las blastosporas que portan el antgeno y las
particulas de ltex sensibilizadas con anticuerpos monoclonales, aglutinados azules que
progresivamente se extienden hacia la periferia, formando un borde azul alrededor de un
rea central roja/rosa.
11.5. Identificacin de levaduras lipfilas
Debido a su requerimiento de cidos grasos, las levaduras lipfilas no pueden ser
identificadas con los sistemas y medios habituales para otras levaduras, por lo que su
identificacin merece un comentario diferenciado.
Durante mucho aos se ha venido utilizando el binomio Malassezia furfur para designar
la fase micelial de las levaduras lipfilas encontradas en la piel humana, en tanto se
reservaban los trminos Pityrosporum ovale y Pityrosporum orbiculare para los dos
tipos morfolgicos de la fase levaduriforme.
La taxonoma del gnero Malassezia ha sido recientemente revisada y comprende en la
actualidad siete especies: M. furfur, M. pachydermatis, M. sympodialis, M. globosa, M.
obtusa, M. restricta y M. slooffiae
Es factible recuperar estos microorganismos en cultivos en SDA o en agar sangre de
carnero al 5% si los cubrimos con cidos grasos de cadena larga, como los contenidos
en el aceite de oliva. Tras incubacin a 35 C durante 2 a 4 das se desarrollan unas
colonias de consistencia cremosa muy parecidas a las producidas por las otras
levaduras.
Adems de los medios suplementados, tambin se puede utilizar medios especficos
para el aislamiento de las especies de este gnero, como son el medio Agar de Dixon
modificado y el de Leeming. A partir de su crecimiento en estos medios, la
identificacin de las especies de Malassezia se lleva a cabo mediante criterios
microscpicos y bioqumicos [13]. Entre estos ltimos: produccin de catalasa;
crecimiento en SDA o suplementado con lpidos a 32 C; crecimiento en Agar Dixon
modificado a 32 C, 37 C y 40 C; utilizacin de Tween 80, Tween 40 y Tween 20. (8)

FUNGIGRAMA:
Las levaduras del gnero Cndida se encuentran ampliamente difundidas en la
naturaleza. maz, agar papa, caldo para ureasa y suero en la humano para filamentacin.
Son componentes naturales de la microbiota en las personas entrndose en piel, boca,
intestino y genitales.
Est reportado que un 75% de la poblacin femenina presentar por lo menos un
episodio de vulvovaginitis por Cndida en su vida.

ANALISIS CLNICO

Pgina 30

SEMINARIO N02
El gnero Candida es un grupo de levaduras muy difundidas en la naturaleza, que puede
causar patologas en el ser humano, siendo una de las ms habituales la vulvovaginitis.
Si bien, Candida albicans se asla con mayor frecuencia, en los ltimos aos ha habido
un incremento en los aislamientos de Candida glabrata, Candida guillermondii y
Candida krusei. Estos microorganismos presentan sensibilidad disminuida o nula al
Fluconazol. Es por eso que el objetivo es caracterizar las diferentes especies de candidas
halladas en muestras de exudado vaginal, y evaluar la sensibilidad a los antifngicos de
las especies de candida no albicans encontradas.

El diagnstico definitivo en pacientes con sospecha clnica de onicomicosis se realiza


con KOH y microcultivo y se instituye el perfil de sensibilidad a antifngicos como
alilamnicos e imidazlicos. 9
Las enfermedades micticas adquiridas como padecimiento secundario por uso de
frmacos inmunosupresores, aplicacin de tcnicas invasivas (catteres intravenosos) y
portadores de enfermedad primaria con inmunosupresin (diabetes, lupus eritematoso
sistmico, etctera) han aumentado considerablemente. Las ms importantes son las
micosis superficiales por la cantidad de consultas mdicas y costos que generan;
mientras que las sistmicas, adems de afectar piel y faneras, involucran rganos cuya
afeccin pone en riesgo la vida del paciente. 9
El tratamiento est afectado por aparicin de resistencia a los antifngicos de uso
frecuente, su relativa alta toxicidad y uso de antimicticos en proceso de investigacin.
Todos estos parmetros aumentan la poblacin susceptible de adquirir infeccin
fngica, ocasionan cambios en la epidemiologa, agravamiento del diagnstico ni
tratamiento de las mismas; an ms si la eleccin teraputica habitual no tiene evidencia
del agente etiolgico ni su sensibilidad/resistencia a drogas de uso habitual.
En este contexto, es importante el papel de apoyo diagnstico y decisin teraputica
dado por los laboratorios de micologa.10

ANALISIS CLNICO

Pgina 31

SEMINARIO N02
REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

1. Tortora. Introduccin a la Microbiologa. 9 ed. Ed. Mdica Panamericana.


Argentina. 2007. pp: 334-338.
2. NEGRONI. Microbiologa Estomatolgica. 2, ed. Ed: panamericana:
Argentina. 2009. Pp: 38-41
3. Koneman E, Allen S. Koneman. Diagnostico Microbiolgico: Texto y Atlas. Ed.
Mdica Panamericana. Buenos Aires: Argentina. 2008
4. Gadea I, Cuenca M, Gadea I, Martn E, Pemn J, Pontn J et. al. SEIMC.
Procedimientos en Microbiologa Clnica: Diagnstico microbiolgico de las
micosis y estudios de sensibilidad a los antifngicos. [Sitio Web]. 2006 [citado
2014 Abr 20] Disponible en:
http://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobi
ologia/seimc-procedimientomicrobiologia21.pdf

5. Guzmn A. Importancia del laboratorio en el diagnstico de las micosis


invasoras. Rev. chil. infectol. [revista en la Internet]. 2004 [citado 2014 Abr
20] ; 21( 1 ): 39-47. Disponible en:
http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S071610182004000100005&lng=es

6. OLIVAS E (2001) Manual de Prcticas de Microbiologa. Universidad


Autnoma de Ciudad Juarez. Mxico. p.66
7. PRATTS. G (2007)
ESpaa.pp.96-97

Microbiologa.

Editorial

Mdica

Panamericana.

8. BAYLLEY Y SCOTT (2007) Diagnstico microbiolgico. 12 ed. Editorial


Mdica Panamericana. Espaa. p. 653
9. Linares, M. Solis, F. Identificacion de levadura. Visitado [19 de abril del 2014].
Web
[http://reportesparaestudiantesdequimica.blogspot.com/2011/05/identificacionde-levaduras.html]

ANALISIS CLNICO

Pgina 32

SEMINARIO N02
10. Floridia R, Ronchi G, Ampuero V. Caracterizacin de las especies de Cndida
halladas en muestras de exudado vaginal de mujeres sintomticas. 2011. Acceso:
20 Abril, 2014. Disponible en:
http://www.revistabioanalisis.com/arxius/notas/cr1A7WLV.pdf
11. Onicomicosis: agente causal, correlacin clnica y sensibilidad a alilamnicos e
imidazlicos. 2011. Acceso: 20/04/2014. Disponible en:
http://www.medigraphic.com/pdfs/patol/pt-2011/pt114f.pdf

ANALISIS CLNICO

Pgina 33