Ao de la Promocin de la Industria

Responsable y Compromiso Climtico

UNIVERSIDAD NACIONAL
AGRARIA LA MOLINA

CROMATOGRAFA

CURSO:

Laboratorio de Qumica Orgnica

ALUMNOS:
HORARIO:

Jueves 11 AM. 1 PM.

2014
I.

OBJETIVOS

Conocer la cromatografa como tcnica de separacin de mezclas de

sustancias, sus caractersticas y los factores que en ella intervienen.

Comparar las distintas tcnicas cromatogrficas estudiadas y saber cul elegir

en un momento determinado.

Calcular los valores de Rf del Azul de Metilo y del Amarillo de Metilo.

Separar los compuestos de la mezcla dada (Azul de Metilo + Amarillo de

Metilo)

II.

INTRODUCCIN
-

Cromatografa de columna

Se vierte el disolvente en la columna cromatogrfica, en la fase mvil se observa

etanol. En la base de la columna cromatogrfica se encuentra un algodn que facilita
el paso del eluato obtenindose as las distintas fases. Luego se deposita la mezcla a
separar y se abre la llave de la columna cromatogrfica hasta que toda la mezcla sea
adsorbida por el silicagel (fase fija). Se empieza a adicionar ms etanol hasta que se
eluya el colorante que ms rpido se desplaza. Despus se cambia de recipiente se
empieza a eluir el segundo colorante.

Cromatografa en capa fina

En una placa que contiene silicagel, a un centmetro de la base, se coloca tres gotas
de un colorante y tres gotas de la mezcla, cada una en diferentes extremos.
Continuamos ponindolo en una suspensin preparada que contiene 1-propanolbutano. Una vez puesto se tapa y no se debe de mover hasta calcular el frente del
solvente.

Cromatografa sobre papel

En un extremo de la tira de papel filtro, a 1,5 cm de la base, se coloca tres gotas de

colorante y tres gotas de mezcla, cada una en extremos diferentes. Se introduce la tira
de papel filtro a un tubo de ensayo el cual contiene 1-propanol-butano. Una vez
colocado el papel filtro se tapa y no se mueve hasta terminar con el desarrollo del
experimento.

III. MARCO TERICO

Cromatografa

La cromatografa es un mtodo fsico de separacin para la caracterizacin de

mezclas complejas, la cual tiene aplicacin en todas las ramas de la ciencia y la fsica.
Es un conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencin selectiva, cuyo
objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y
determinar las cantidades de dichos componentes.
Las tcnicas cromatogrficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase mvil
que consiste en un fluido (gas, lquido o fluido supercrtico) que arrastra a la muestra a
travs de una fase estacionaria que se trata de un slido o un lquido fijado en un
slido. Los componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase
estacionaria. De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a
distintas velocidades y se van separando. Despus de que los componentes hayan
pasado por la fase estacionaria, separndose, pasan por un detector que genera una
seal que puede depender de la concentracin y del tipo de compuesto.

Cromatografa en columna

Es el mtodo ms utilizado para la separacin de compuestos orgnico a escala

preparativa. La fase estacionaria se deposita en el interior de una columna de vidrio
que termina con una placa porosa que impide su paso y en un estrechamiento con una
llave. La mezcla se deposita sobre la parte superior de la fase estacionaria mientras
que la fase mvil atraviesa el sistema. Los compuestos van saliendo por separado de
la columna y se recogen en fracciones, los ms polares quedan ms retenidos y para
que salgan generalmente hace falta aumentar la polaridad del disolvente. El tiempo
necesario para eluir un compuesto de la columna se llama tiempo de retencin.
Consta de tres etapas: llenado de la columna, aplicacin de la muestra y elucin.
Durante la elucin se observa que los compuestos van saliendo por separado de la
columna y se recogen en fracciones, los ms polares quedan ms retenidos y para
que salgan generalmente hace falta aumentar la polaridad del disolvente.

Cromatografa en capa fina

Se trata de una cromatografa de absorcin ascendente. Este tipo de cromatografa se

utiliza mucho en la identificacin de compuestos orgnicos.
La fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La fase
estacionaria ser un componente polar y el eluyente ser por lo general menos polar
que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor
velocidad sern los menos polares.
La bsqueda del eluyente requiere probar con varios disolventes de diferente polaridad
o con mezclas. Para compuestos poco polares, que se desplazan con mucha facilidad,

se debe utilizar un disolvente apolar como el hexano y en el caso de compuestos de

polaridad media, mezclas de hexano y acetato de etilo.
Los componentes de una mezcla se pueden identificar midiendo las constantes Rf
(factor de retencin) de las diferentes manchas y comparando con compuestos
patrones conocidos.

Rf= Distancia recorrida por el compuesto

Distancia recorrida por el disolvente

Cromatografa sobre papel

Es la ms sencilla de las tcnicas, pero slo nos dar resultados cualitativos. Est casi
en desuso. El mtodo se basa en un mecanismo de reparto, y consiste en depositar
una pequea cantidad de muestra en el extremo de una tira de papel de filtro, que se
deja evaporar. Luego se introduce la tira en una cubeta que contenga el disolvente, de
manera que ste fluya por la tira por capilaridad.
Cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al extremo, se retira el papel y
seca. Si el disolvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se
vern las manchas de distinto color separadas.
Hay varios factores de los cuales depende una cromatografa eficaz: la eleccin del
disolvente y la del papel de filtro.

IV. ANLISIS DE RESULTADOS Y DISCUCIONES

-

Cromatografa en columna

Gracias a este tipo de

cromatografa
se logr saber que
las sustancias que
componan la mezcla a separar eran:

Azul de Metilo
Anaranjado de metilo

Esto se debe a que en la

cromatografa
de columna, las
molculas de una
mezcla son
separadas en base a la
afinidad
de sus molculas por la fase
estacionaria o por la fase mvil.

RfA =

1 cm____ = 0.19
6.4 cm - 1 cm

RfB =

4.5 cm__ = 0.83

6.4 cm - 1 cm

Cromatografa sobre papel

RfA =

3.1 cm___ = 0.51

10.3 cm - 1.5 cm

RfB =

6.1 cm___ = 0.69

10.3 cm - 1.5 cm

Cromatografa en capa fina

V. CONCLUSIONES
-

Se concluye en esta prctica que por medio de la cromatografa es posible

identificar de qu sustancias est compuesta una mezcla, y de cmo la polaridad
del solvente utilizado para la cromatografa determina el resultado, mostrndonos
sus diferentes compuestos.

Se determina que se puede usar la cromatografa de columna a escala preparativa;

mientras que las cromatografas de capa fina y sobre columna, slo a escala
cualitativa.

VI. RECOMENDACIONES
-

VII.

Todos los materiales, incluida la muestra deben estar completamente secos.

Los solventes a utilizar como fase mvil deben ser qumicamente puros.
En lo posible, una vez utilizada la slica, almacenarla en recipientes secos y
bien tapados.
No tocar la slica con los dedos, la grasa aparecera como parte de la muestra.
Las fases mviles que contienen solventes voltiles, cambian su composicin
por evaporacin, prepare slo la cantidad que necesite y utilcela el mismo da

APNDICE 1: CUESTIONARIO I

1.- Cul es la principal utilidad de la cromatografa en columna?

La utilidad de la cromatografa en columna se basa en el anlisis, la separacin o
purificacin de sustancias o mezcla de stas a travs de ciertas tcnicas y mtodos
muy eficientes usados en los actuales laboratorios de qumica.
Otras utilidades:
A. Separaciones de componentes de plantas medicinales.
B. Separacin de componentes de una sntesis orgnica.
C. Separacin de colorantes.
D. Separacin e identificacin de morfina.
E. Separacin de cido actico, alcohol metlico y metil-etil cetona.
F. Separacin e identificacin de los compuestos intermedios de una sntesis orgnica,
por ejemplo en la sntesis del naftaleno, identificacin de cido naftlico, anhdrido
naftlico, benceno.
G. En la produccin sinttica de acetaminofen, identificacin de la timina de la Nacetilbenzoquinona.
H. Identificacin de levo-alfa-acidoaminoadipico, durante la biosntesis de penicilina.
I. Identificacin de 8-nitroisoquinolina, durante la sntesis de Ciprofloxacina, un
antibitico.
2.- Qu fenmenos fijos intervienen en una columna cromatogrfica que utilice
Silica gel como fase fija?

Los fenmenos fsicos presentes son la adsorcin y desorcin, el primero consiste en

que las molculas de una sustancia (adsorbato) se adhieren en la superficie de un
slido finamente dividido (adsorbente, Slica Gel) y el segundo es la separacin de las
molculas adsorbidas en la superficie del slido.
3.- Cules son las principales diferencias entre un HPCL y una columna
cromatogrfica simple?
Las principales diferencias derivan en que las columnas de HPCL el solvente o fase
mvil circulan con gran dificultad (por su empaquetamiento mucho ms compacto), por
lo que debe ser impulsado a alta presin (mediante bombas de alta presin) y las
columnas suelen estar construidas en materiales muy fuertes como el acero
inoxidable. Adems, para lograr la mxima eficiencia de los solventes usados en HPCL
deben tener un mayor grado de pureza y el eluato al salir de la columna pasa a travs
de un detector para monitorear la presencia del material.
4.- Cul es el factor que hace que la HPCL sea mucho ms eficiente que una
columna cromatogrfica simple?
La mayor eficiencia de esta tcnica se debe a que la fase estacionaria est formada de
partculas esfricas muy pequeas y de tamao uniforme. Usndose micro esferas con
un tamao de 5 a 10 micrones.
5.- Estamos operando una columna cromatografa usando como absorbente
slica gel y casi todos los compuestos se han eluido, excepto un compuesto que
no es eluido con este solvente Qu cambios introducira para poder eluirlo?
Debido a que es el nico que no pudo ser eluido con el slica gel, utilizara un nuevo
solvente en la cual el compuesto logre superar la adsorcin hacia la silica gel y se
pueda separar finalmente.
6.- Cmo se puede trabajar con sustancias incoloras en una columna
cromatogrfica si nos es posible localizar las sustancias dentro de una
columna?
Aunque los compuestos incoloros pueden formar bandas bien definidas en una
columna de adsorcin cromatogrfica se necesita la utilizacin de mtodos especiales
para la localizacin de las bandas de los productos adsorbidos y para poder separarlos
convenientemente. Para la localizacin de las bandas de los productos adsorbidos se
emplea generalmente una lmpara ultravioleta. Para la localizacin de las fracciones
de una mezcla adsorbida se pueden emplear tambin mtodos puramente empricos
por ejemplo en la columna se puede diluir con una serie de disolventes de polaridad
gradualmente creciente y el filtrado (eluato) se recogen pequeas fracciones. La
eliminacin del disolvente en cada de una de estas se administra el compuesto
orgnico que ha sido eluido en ella , una vez identificado el compuesto mediante un

punto de fusin o alguna otra propiedad se puede mezclar con los productos idnticos
obtenidos en las fracciones prximas.
7.- Qu tipo de cromatografa utilizara para eliminar las sales minerales que
estn contaminando una muestra de cafena?
El mtodo elegido seria el intercambio inico. Vertemos la muestra en una resina
catinica y luego sobre una resina aninica para eliminar cada ion de la sal, y como
resultado nos quedara la cafena y agua.
8.- Qu es un colector de fracciones?
Es un dispositivo para recuperar volmenes fraccionados del efluente de una columna
cromatogrfica.
9.- Qu diferencia encuentra usted entre la cromatografa de gases y la
cromatografa en columna?
En cromatografa de gases (GC), la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de
una columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de
un gas inerte, y a diferencia de la mayora de los tipos de cromatografa, la fase mvil
no interacciona con las molculas del analito; su nica funcin es la de transportar el
analito a travs de la columna.
10. Qu son las resinas de intercambio inico y cul es su utilidad?
Las resinas de intercambio inico son materiales sintticos, slidos e insolubles en
agua, que se presentan en forma de esferas o perlas de 0.3 a 1.2 mm de tamao
efectivo, aunque tambin las hay en forma de polvo.
Estn compuestas de una alta concentracin de grupos polares, cidos o bsicos,
incorporados a una matriz de un polmero sinttico (resinas estirnicas, resinas
acrlicas, etc.) y actan tomando iones de las soluciones (generalmente agua) y
cediendo cantidades equivalentes de otros iones. La principal ventaja de las resinas de
intercambio inico es que pueden recuperar su capacidad de intercambio original,
mediante el tratamiento con una solucin regenerante.
En los copolmeros de estireno, las cadenas de estireno se enlazan mediante el
divinilbenceno y el contenido de este ltimo est directamente relacionado con la
resistencia mecnico e inversamente proporcional con su porosidad.

VIII.

APNDICE 2: CUESTIONARIO II

1. Qu entiende por Rx?

A la relacin entre el desplazamiento de una sustancia, con respecto a otra patrn
(qumicamente similar a la muestra).

2. Cules son las diferencias entre la c.c.f. y la de papel?

La cromatografa en capa fina permite el uso de absorbentes eficientes, los que se
aplican formando una capa delgada y uniforme que se adhiere sobre la superficie de
un soporte inerte rgido por el uso de un agente aglomerante o por las propias
cualidades del material. El espesor de la capa adsorbente vara entre 0,1 y 2 mm. Las
sustancias se depositan en solucin en la base de la plancha, la que se coloca
verticalmente en la Cuba cromatografa que contiene el solvente escogido. Cuando
este llega a la altura deseada, se saca el cromatograma, se seca, se revela y se
determina el Rf o Rx de cada sustancia.
En cambio, la cromatografa sobre papel es un tipo de particin que utiliza el papel
filtro como soporte inerte de la fase fija que puede ser el agua u otro lquido. Las
separaciones se realizan por la particin continua de las sustancias entre la fase
acuosa y la fase orgnica que fluye por el papel por capilaridad. La muestra se
siembra cerca del borde inferior del papel filtro. Luego de que la siembra esta seca se
sumerge el extremo del papel en un recipiente, hermticamente sellado, que contiene
el solvente de desarrollo, ste asciende por capilaridad y los componentes de la
muestra se van desplazando a diferente velocidad del lugar en que fueron sembrados.
La identificacin de los distintos componentes de la mezcla se hace por comparacin
con sustancias patrn o midiendo su desplazamiento respecto al de la fase mvil.
3.- Cite algunas de las aplicaciones de la cromatografa en su especialidad.
-

Anlisis de Alimentos por Cromatografa:

El anlisis de los alimentos mediante la cromatografa de columna, de capa delgada,

de papel y cromatografa de gas son de mucha utilidad en el campo de la nutricin, la
investigacin de nuevos productos, el control de la calidad de los alimentos, etc.
Asimismo, colabora con la identificacin de aquellas plantas y animales que merecen
consideracin como alimentos para el hombre. Tareas todas estas en las que est
involucrado el Ingeniero en Industrias Alimentarias, as como tambin un Ingeniero
Zootecnista.
4. Interprete los valores de Rf 0,05; 0,6 y 0,98.
El valor de Rf es una constante usada para intentar la identificacin de un compuesto
ya que el desplazamiento de una sustancia con respecto al desplazamiento del
disolvente es constante y caracterstico de ella.
Rf=

_Distancia recorrida por la sustancia_

Distancia recorrida por el disolvente

Los 3 valores pueden ser interpretados como 3 diferentes sustancias de las cuales, la
1era (Rf=0,05) tiene un desplazamiento menor, la 2da (Rf=0,6) un desplazamiento
algo ms amplio, y la 3era (0,98) un desplazamiento mayor a las dems.
5.- Introducira algn cambio cuando se tiene un Rf de 0,05, Por qu?

S, porque esa distancia es muy pequea para utilizarla como identificacin de un

compuesto.
6.- Explique algn mtodo para localizar las bandas de adsorcin cuando se
trabaja con sustancias incoloras en una columna cromatogrfica.
Es un tipo de cromatografa de particin que utiliza papel de filtro (fibras de celulosa)
como soporte inerte de la fase fija que puede ser el agua que, normalmente, contiene
otro lquido con el que se ha impregnado el papel filtro.
Las separaciones se realizan por participacin de las sustancias entre la fase acuosa
(estacionaria) y la fase orgnica (mvil) que fluye por el papel por gravedad y/o
capilaridad. La muestra a analizar o separar se siembra (en solucin) cerca del borde
inferior de la tira de papel. Luego de secar o evaporar el solvente de siembra, se
sumerge este extremo de papel de un recipiente (cuba cromatogrfica),
hermticamente cerrado, que contiene el solvente de desarrollo, ste asciende por
capilaridad (cromatografa ascendente) y los componentes de la muestra se van
desplazando a diferente velocidad del lugar en que fueron sembrados.
Cuando el solvente llega a la altura adecuada, se saca el cromatograma y se seca. La
identificacin de los distintos componentes de la muestra se hace por comparacin
con sustancias patrn o midiendo su desplazamiento respecto al de la fase mvil (Rf)
pudiendo ser necesario el uso de un revelador.
El disolvente tambin puede desplazarse en sentido contrario (de arriba hacia abajo),
desde una cubeta colocada en la parte superior de la cuba (cromatografa
descendente) o desde el centro de un papel circular hacia los bordes de ste
(cromatografa circular).
La cromatografa sobre papel es una valiosa herramienta en todos los campos de la
qumica pero, el solo hecho de que todas las separaciones se hacen sobre celulosa le
impone una gran limitacin tcnica ya que esta no siempre es satisfactoria para todos
los casos. Es particularmente til en la separacin de compuestos muy polares (como
azcares, aminocidos, etc.). Otro inconveniente es que slo se puede trabajar con
pequeas cantidades de muestra, por lo que su principal utilidad es con fines
analticos.
7. Qu es la electroforesis y cul es su principal aplicacin en los
compuestos biolgicos?
La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas (protenas o cidos
nucleicos) sobre la base de su tamao molecular y carga elctrica. Los cidos
nucleicos ya disponen de una carga elctrica negativa, que los dirigir al polo positivo,
mientras que las protenas se cargan con sustancias como el SDS (detergente) que
incorpora cargas negativas de una manera dependiente del peso molecular. Para la
separacin se usa un gel de agarosa o poliacrilamida (fibras cruzadas, como una
malla). Al poner la mezcla de molculas y aplicar un campo elctrico, stas se

movern y debern ir pasando por la malla, por la que las pequeas se movern
mejor, ms rpidamente. As, las ms pequeas avanzarn ms y las ms grandes
quedarn cerca del lugar de partida. La principal aplicacin de la electroforesis capilar
es para la determinacin de residuos de antibiticos.

IX. BIBLIOGRAFA
-

CHANG, Raymond. Qumica. 10a Edicin, Editorial MC. GRAW HILL. Mxico
D.F. 2010.
NOLLER, Carl R. Qumica Orgnica. Tercera edicin. Editorial Interamericana
S.A de C.V. Mxico D.F. 1973
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Edicin. Editorial EUDEBA. Argentina. 1995.
SHRINER, R. FUSON, R. & CURTIN, D. Identificacin Sistemtica de
Compuestos orgnicos. Dcima reimpresin. Editorial LIMUSA. 1991. Espaa.
RODRIGUEZ, J. Curso Experimental en Qumica Orgnica. Editorial SINTESIS.
2008. Espaa.
CUEVA, P.; LEN, J. & FUKUSAKI, A. Manual de Laboratorio de Qumica
Orgnica. Segunda Edicin. JUAN GUTEMBERG EDITORES. Per. 2010.