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RELACIN DE PREGUNTAS DE ANLISIS INSTRUMENTAL

1. Defina los siguientes conceptos que caracterizan un mtodo analtico:


a. Exactitud.
Grado de concordancia entre el valor obtenido de la concentracin del
analito en la muestra y el valor verdadero.
b. Precisin.
Grado de concordancia mutua entre un grupo de resultados obtenidos al aplicar
repetitiva e independientemente el mismo mtodo analtico a alcuotas de la
misma muestra.
c. Sensibilidad.
Capacidad de un mtodo analtico para discriminar entre concentraciones
semejantes del analito en la muestra o capacidad para poder detectar (anlisis
cualitativo) o determinar (anlisis cuantitativo) pequeas concentraciones del
analito en la muestra.
d. Selectividad.
Capacidad de un mtodo para originar resultados que dependan de forma
exclusiva del analito para su identificacin o cuantificacin en la muestra.
e. Robustez.
Propiedad de un mtodo analtico, que describe su resistencia al cambio de
respuesta (resultado) cuando se aplica independientemente a alcuotas de la
misma muestra variando ligeramente las condiciones experimentales.
(Selecciona y cuantifica los puntos dbiles experimentales).
f. Fiabilidad.
Capacidad de un mtodo para mantener su exactitud y precisin a lo largo del
tiempo.
2. Qu diferencia(s)
instrumentales?

existe(n)

entre

los

mtodos

clsicos

los

3. Cules son los mtodos pticos? Estos mtodos se clasifican en


espectroscpicos y no espectroscpicos, qu diferencia a los unos de
los otros? Cite al menos dos ejemplos de cada uno de ellos.
Los primeros mtodos espectroscpicos restringan al empleo de la radiacin
visible, por ello se denominaron MTODOS PTICOS.

Debido a la similitud del instrumental utilizado, el trmino de MTODOS


PTICOS se emplea tambin para aquellos que emplean la radiacin UV e IR
a pesar de que estas no son perceptibles por el ojo humano.
4. Nombre y describa los diferentes tipos de transiciones que puede
experimentar una molcula cuando es expuesta a radiacin:
a. Ultravioleta.
b. Visible.
La radiacin ultravioleta y visible provoca la promocin de un electrn de un
orbital atmico o molecular de baja energa a otro de alta energa. Para ello
la energa del fotn debe corresponderse exactamente con la diferencia de
energa
entre
los
dos
orbitales.
c. Infrarroja.
Puede inducir transiciones de los estados vibratorios y rotacionales
relacionados con el estado electrnico fundamental de la molcula.
5. Explique brevemente en que consiste la espectroscopia de fluorescencia.
Compare las caractersticas de esta tcnica con la espectroscopia de
absorcin. Represente mediante un diagrama los diferentes
componentes empleados en estos instrumentos.
Proceso de fotoluminiscencia en el que los tomos y molculas se excitan con
la absorcin de la radiacin electromagntica. Despus la especie excitada se
relaja al estado fundamental y emite su exceso de energa como fotones.

6. Emisin de Radiacin y procesos de relajacin


El tiempo de vida de un tomo o de una molcula excitada por absorcin de
radiacin es breve, ya que existen diversos procesos de relajacin que les
permiten regresar al estado fundamental:

Relajacin no radiante.

Implica la prdida de energa a travs de una serie de pequeas etapas,


en las que la energa de excitacin se transforma en energa cintica
que se libera al colisionar con otras molculas.

Se produce un pequeo aumento de la temperatura del sistema.

Relajacin por fluorescencia y fosforescencia.

La fluorescencia sucede ms rpidamente que la fosforescencia y


generalmente finaliza unos 10-5 s despus del inicio de la excitacin.

La emisin de fosforescencia puede continuar durante minutos o


incluso horas despus de que la irradiacin haya cesado. La
fluorescencia y la fosforescencia se observan ms fcilmente a un
ngulo de 90 grados respecto al haz de excitacin.

7. Cite y explique los diferentes nebulizadores que suelen usarse para la


formacin de aerosol en los equipos de espectrocopa ptica atmica.
Nebulizadores neumticos
-

El tipo ms comn, es el nebulizador neumtico de tubo concntrico,


en el que la muestra lquida es aspirada a travs de un capilar por una
corriente de gas a elevada presin que fluye alrededor del extremo del
capilar (efecto Venturi). Este proceso se denomina aspiracin. El gas a
elevada velocidad rompe el lquido en finas gotitas de distinto tamao,
que son conducidas al atomizador.
Tambin se emplea el nebulizador neumtico de flujo cruzado, en el
que el gas a elevada presin cruza perpendicularmente el extremo del
capilar. Frecuentemente en este tipo de nebulizador, el lquido se
bombea a travs del capilar.
Los nebulizadores neumticos de disco fritado, en el que la
disolucin de la muestra se bombea sobre una superficie de vidrio fritado
a travs de la cual fluye el gas portador. Este tipo de nebulizador
produce un aerosol mucho ms fino que los dos primeros.
Los nebulizadores Babington consisten en una esfera hueca en la que
el gas a elevada presin se bombea a travs de un pequeo orificio en
la superficie de la esfera. El lquido que cae formando una delgada
pelcula sobre la superficie de la esfera, se nebuliza al expandirse el
chorro del gas. Este tipo de nebulizador est menos expuesto a sufrir
obstrucciones y, por ello, es de mayor utilidad en el caso de muestras
con un contenido salino elevado o de suspensiones con un contenido de
partculas alto.

Nebulizadores ultrasnicos
-

La muestra se bombea sobre la superficie de un cristal piezoelctrico


que vibra a una frecuencia que puede ir desde 20 kHz a varios MHz.
Dichos nebulizadores producen aerosoles ms densos y ms
homogneos que los nebulizadores neumticos.

8. Indique los diferentes mtodos de introduccin de muestras lquidas en


los atomizadores de espectrometra ptica atmica.
-

Nebulizadores neumticos
Nebulizadores ultrasnicos
Vaporizadores electrotrmicos
Ablacin por lser
Tcnica de la descarga luminiscente
Tcnicas de generacin de hidruros

9. La intensidad de una lnea del Cs atmico es mucho menor en una llama


de gas natural, que alcanza 1.800 C, que en una llama de
hidrgeno/oxgeno, cuya temperatura es de 2.700 C. Justifquese.
10. Ventajas de la espectrometra de emisin de plasma, arco y chispa.
-

Escasa interferencia entre elementos.


Se obtienen buenos espectros de emisin para la mayora de los
elementos en unas mismas condiciones de excitacin. Se pueden
registrar simultneamente espectros para multitud de elementos.
Las fuentes de plasma (ms energticas) permiten la determinacin de
bajas concentraciones de elementos que tienden a formar compuestos
refractarios (es decir, compuestos que son muy resistentes a la
descomposicin trmica, tales como xidos de boro, fsforo, wolframio,
uranio, circonio y niobio).
Las fuentes de plasma permiten determinar no metales como cloro,
bromo, yodo y azufre.
Los mtodos con fuentes de plasma tienen generalmente unos
intervalos lineales de concentracin que abarcan varias decenas de
rdenes de magnitud.

11. Defina el concepto de plasma. Cite los tres tipos de plasma de alta
temperatura utilizados en la espectroscopia de emisin y describa
brevemente el funcionamiento de al menos uno de ellos.
Plasma: Mezcla gaseosa conductora de electricidad que contiene una
concentracin significativa de cationes y electrones (la concentracin de
ambos es tal que la carga neta se aproxima a cero).
Existen tres tipos de plasma de alta temperatura:
-

Plasma

de

acoplamiento

inductivo

(ICP).

Consiste en tres tubos concntricos de cuarzo a travs de los cuales


fluyen corrientes de argn. Rodendola se encuentra una bobina de
induccin, refrigerada por agua, que est alimentada por un generador
de radiofrecuencia. La ionizacin del argn que fluye se inicia por medio
de una chispa que proviene de una bobina Tesla. Los iones resultantes y
sus electrones asociados interaccionan entonces con el campo

magntico oscilante (H en la figura) producido por la bobina de


induccin. Esta interaccin hace que los iones y los electrones dentro de
la bobina se muevan en trayectorias circulares. La temperatura del
plasma es lo suficientemente elevada como para hacer necesario el
aislamiento trmico del cilindro exterior de cuarzo. Para ello se hace fluir
argn de forma tangencial alrededor de las paredes interiores del tubo
central y centra el plasma radialmente. Una disposicin horizontal de la
antorcha mejora los lmites de deteccin de 4 a 10 veces. El caudal de
argn utilizado es muy elevado y supone un coste significativo.
-

Plasma de corriente continua (DCP).


Plasma inducido por microondas (MIP).

12. En qu se basan los mtodos electroanalticos? Qu ventajas


podemos encontrar en ellos frente a otras tcnicas instrumentales?
Estn basados en las propiedades elctricas de una disolucin de analito
cuando forma parte de una celda electroqumica.
VENTAJAS
- Las medidas electroanalticas son a menudo especficas para un estado
de oxidacin particular de un elemento.
- Instrumentacin econmica.
- Proporcionan informacin sobre las actividades de las concentraciones
de las especies qumicas.
13. Describe la utilizacin de una celda electroqumica
-

Consiste en un electrodo de cinc sumergido en una disolucin de sulfato


de cinc y un electrodo de cobre sumergido en una disolucin de sulfato
de cobre.
Las dos disoluciones estn unidas por un puente salino, que consiste en
un tubo relleno con una disolucin, que est saturada de cloruro
potsico, o a veces de algn otro electrolito.
Los dos extremos del tubo estn equipados con tapones porosos que
permiten el movimiento de iones a travs suyo pero que evitan el paso
de lquido desde una disolucin de electrolito a la otra.

14. Componentes de un equipo empleado en potenciometra.


Comprende un electrodo de referencia, un electrodo indicador y un dispositivo
de medida de potenciales.
Eref se conoce con exactitud y es independiente de la concentracin del
analito u otros iones en la disolucin de estudio.
El electrodo indicador, que se sumerge en la disolucin del analito, adquiere
un potencial Eind que depende de la actividad del propio analito.
El tercer componente de la celda potenciomtrica es un puente salino, el cual
impide que los componentes de la disolucin de analito se mezclen con los del
electrodo de referencia.

15. Explique
brevemente
electrogravimtricos.

los

procedimientos

culombimtricos

Mtodos electrogravimtricos
-

Hay
-

La deposicin electroltica se ha usado durante ms de un siglo para la


determinacin gravimtrica de metales.
En la mayora de las aplicaciones, el metal se deposita en un ctodo de
platino pesado previamente y se determina entonces el incremento de
su masa.
Algunos mtodos emplean deposicin andica, como la determinacin
de plomo como dixido de plomo sobre platino y la de cloruro como
cloruro de plata sobre plata.
dos

tipos

generales

de

mtodos

electrogravimtricos.

No se ejerce ningn control sobre el potencial del electrodo de trabajo y


el potencial de celda aplicado se mantiene en un nivel ms o menos
constante que genera suficiente corriente para completar la electrlisis
en un tiempo razonable.
El de potencial controlado o mtodo potenciosttico.

Mtodos culombimtricos
-

Los mtodos culombimtricos se llevan a cabo midiendo la cantidad de


carga elctrica requerida para convertir cuantitativamente una muestra
de un analito a un estado de oxidacin diferente.
Los mtodos culombimtricos y gravimtricos comparten la ventaja
comn de que la constante de proporcionalidad entre la cantidad medida
y la masa del analito se deduce de constantes fsicas conocidas con
precisin, lo cual elimina la necesidad de calibracin con patrones
qumicos.
A diferencia de los mtodos gravimtricos, los procedimientos
culombimtricos son generalmente rpidos y no requieren que el
producto de la reaccin electroqumica sea un slido pesable.
Los mtodos culombimtricos son tan precisos como los procedimientos
gravimtricos y volumtricos convencionales y adems son fcilmente
automatizables.

16. En qu se basan los mtodos voltamtricos? Qu puedes decir con


respecto al tamao de los electrodos? Con respecto al consumo del
analito existe algn tipo de diferencia con respecto a la electrogravimetra
y culombimetra?
-

Se llama mtodos voltamtricos a las tcnicas electroanalticas que


dependen de la medida de corrientes en funcin del potencial aplicado.

En ellos, se usan condiciones que facilitan la polarizacin del electrodo


de trabajo o indicador. En general, para favorecer la polarizacin, los

electrodos de trabajo en voltametra son relativamente pequeos, con un


rea superficial de unos pocos milmetros cuadrados como mximo y, en
algunas aplicaciones, son de apenas unas pocas micras cuadradas.
-

El consumo del analito en voltametra es mnimo, mientras que en


electrogravimetra y culombimetra casi todo el analito se convierte en
producto.

17. Defina los siguientes conceptos relacionados con la cromatografa:


a. Tiempo de retencin.
El tiempo que transcurre desde la inyeccin de la muestra hasta que el analito
alcanza el detector
b. Tiempo muerto.
El tiempo necesario para que la especie no retenida alcance el detector
c. Factor de selectividad
d. Eficacia de una columna
18. El siguiente cromatograma fue obtenido mediante un mtodo
cromatogrfico desarrollado con HPLC para separar especies de
mercurio y la salida de la columna fue acoplada a un ICP-MS, que
permiti la monitorizacin del 202Hg. Los tiempos de retencin de los
picos B y C coinciden con los de los patrones de metilmercurio y mercurio
inorgnico respectivamente. Determinar la resolucin del mtodo
cromatogrfico para estos dos analitos. Es una resolucin ptima? O
por el contario propondra usted algn tipo de cambio en la metodologa
o instrumentacin empleada para mejorar el procedimiento.

19. Qu relacin existe entre el tamao de partcula y la eficacia de una


columna de HPLC?
Contra ms reducido sea el tamao de partcula, se obtiene una mayor
eficacia en una columna de HPLC.
20. Qu es la cromatografa de reparto?
-

Es el tipo de cromatografa de lquidos ms ampliamente utilizado.


En el pasado, la mayora de las aplicaciones se han referido a
compuestos polares, no inicos, de baja a moderada masa molecular (<
3.000).
Recientemente se han desarrollado algunos mtodos (derivatizacin y
formacin de pares inicos) que han extendido las separaciones de
reparto a los compuestos inicos.
La cromatografa de reparto se puede subdividir en:

Cromatografa lquido-lquido. La fase estacionaria lquida se retiene sobre la


superficie del soporte por adsorcin fsica.
Cromatografa de fase unida qumicamente. La fase estacionaria se une
qumicamente a la superficie del soporte.
- Desventajas del sistema lquido-lquido:
Prdida de fase estacionaria por disolucin en la fase mvil, lo que hace
necesario un peridico recubrimiento de las partculas del soporte.
21. Ventajas de la elucin en gradiente frente a la elucin isocrtica
22. Describa los diferentes detectores empleados en HPLC.
1- Detectores de absorbancia
La figura muestra el esquema de una celda de flujo en forma de Z para las
medidas de la absorbancia de los efluentes de una columna cromatogrfica.
A fin de minimizar el ensanchamiento de banda extracolumna, el volumen de
estas cubetas ha de ser lo menor posible 1-10 L.
La utilizacin de cubetas de este tipo est restringida, en la mayor parte de los
casos, a presiones no mayores de unos 400 bares. Por ello, a menudo es
necesario un dispositivo para reducir la presin.
2- Detectores de Fluorescencia
La fluorescencia se detecta por medio de un detector fotoelctrico colocado
perpendicularmente respecto al haz de excitacin.
Los detectores ms sencillos utilizan una fuente de excitacin de mercurio, y
uno o ms filtros para aislar la radiacin emitida.

Los instrumentos ms sofisticados consisten en una fuente de radiacin de


xenn y emplean un monocromador de red para aislar la radiacin
fluorescente.
Una ventaja de los mtodos de fluorescencia es su alta sensibilidad, que
resulta ser ms de un orden de magnitud mayor que la de los sistemas de
absorbancia.
Compuestos no fluorescentes pueden convertirse en fluorescentes mediante
tratamientos previos de las muestras con determinados reactivos.
3- Detectores de ndice de refraccin
La figura muestra el esquema de un detector diferencial de ndice de refraccin,
en el que el disolvente en su camino hacia la columna pasa a travs de una
mitad de la cubeta y el eluyente de la columna pasa por la otra mitad.
Los dos compartimentos estn separados por una placa de vidrio montada a un
ngulo tal que si las dos disoluciones difieren en el ndice de refraccin se
produce una desviacin del haz incidente.
El desplazamiento resultante del haz con respecto a la superficie fotosensible
del detector provoca una variacin de la seal de salida, la cual, una vez
amplificada y registrada proporciona el cromatograma.
Los detectores de ndice de refraccin tienen la ventaja de que responden a
casi todos los solutos.
Adems, son fiables y no dependen del caudal, sin embargo, son muy
sensibles a los cambios de temperatura, y se han de mantener a una
temperatura constante en unas pocas milsimas de grado centgrado.
Por otra parte, no son tan sensibles como la mayora de los otros detectores.
4- Detector de luz dispersada tras evaporacin (ELSD)
El efluente de la columna se pasa a un nebulizador donde se convierte en una
fina niebla mediante un flujo de nitrgeno o aire.
Las finas gotitas se llevan a travs de un tubo por el que pasa la corriente del
gas a temperatura controlada donde tiene lugar la evaporacin de la fase mvil,
lo que origina unas finas partculas de analito.
La nube de partculas de analito pasa a travs de un haz lser.
La radiacin dispersada se detecta perpendicularmente al flujo mediante un
fotodiodo de silicio.
Ventaja Su respuesta resulta ser aproximadamente la misma para todos los
solutos no voltiles. Ms sensible que el detector de ndice de refraccin.

5- Detectores electroqumicos
Estos dispositivos se basan en la amperometra, la voltamperometra, la
culombimetra y la conductimetra.
La superficie del electrodo forma parte de un canal formado al insertar una
junta de tefln de 50 m entre dos bloques moldeados de plstico de Kel-F.
El electrodo indicador es de platino, oro, carbn vtreo, o de pasta de carbono.
El electrodo de referencia se coloca ms adelante en el canal de flujo, despus
del bloque en el que se encuentra el electrodo indicador.
El volumen de la celda es de 1 a 5 L.
23. Enumere y describa los diferentes componentes de un HPLC.
1. Recipientes para la fase mvil y sistemas para el tratamiento de los
disolventes.
Uno o ms recipientes de vidrio o de acero inoxidable, cada uno de los cuales
contiene de 200 a 1000 mL de un disolvente. Los recipientes, a menudo se
equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos que interfieren
formando burbujas en la columna y en los sistemas de deteccin. Estas
burbujas provocan ensanchamientos de banda y a menudo interfieren en el
funcionamiento del detector. Un desgasificador puede consistir en un sistema
de bombeo por vaco, un sistema de destilacin, dispositivos para calentar y
agitar los disolventes o, un sistema de purga que permiten arrastrar los gases
disueltos fuera de la solucin mediante finas burbujas de un gas inerte de baja
solubilidad. Con frecuencia estos sistemas tambin contienen un dispositivo
para la filtracin del polvo y de las partculas slidas en suspensin en los
disolventes para evitar que estas partculas daen la bomba o los sistemas de
inyeccin u obturen la columna. No es necesario que los desgasificadores y los
filtros sean partes integrantes de los sistemas de HPLC, ya que hay
alternativas como tratar los disolventes antes de introducirlos en el recipiente,
filtrndolos a vaco a travs de un filtro de tamao de poro muy pequeo. Que
elimina los gases y la materia en suspensin. Una separacin que utiliza un
solo disolvente de composicin constante se denomina una elucin isocrtica.
Con frecuencia, la eficacia de la separacin se aumenta notablemente por una
elucin con gradiente. En este caso se utilizan dos o tres sistemas disolventes
con una polaridad significativamente distinta. Una vez que comienza la elucin,
se vara la relacin de los disolventes de forma programada, a veces
continuamente y a veces mediante una serie de etapas escalonadas.
2. Sistema de bombeo.
Los requisitos para un sistema de bombeo en HPLC son rigurosos e incluyen:
- La generacin de presiones por encima de 400 bares.
- Un flujo libre de pulsaciones.
- Un intervalo de caudales de 0,1 a 5 mL/min.
- El control y la reproducibilidad del caudal mejor del 0,5 % relativo.

Componentes resistentes a la corrosin (juntas de acero inoxidable o


tefln).

Se utilizan tres tipos de bombas:


- Bombas recprocas (700 bares, volmenes
pulsaciones).
- Bombas de jeringa o de desplazamiento.
- Bombas neumticas o de presin constante.

internos

pequeos,

3. Sistemas de inyeccin de muestra.


En cromatografa de lquidos el mtodo ms ampliamente utilizado para la
introduccin de la muestra utiliza bucles de muestra. Normalmente disponemos
de bucles intercambiables que permiten la eleccin de tamaos de muestra
desde 5 a 500 L. Tambin existen vlvulas de inyeccin de micromuestras,
con bucles con volmenes de 0.5 a 5 L.
4. Columnas para cromatografa de lquidos.
Normalmente son construidas con un tubo de acero inoxidable de dimetro
interno uniforme, aunque en algunas ocasiones se encuentran tubos de vidrio
de paredes resistentes (presiones < 40 bares).
5. Tipos de rellenos de la columna.
En cromatografa de lquidos se han utilizado dos tipos bsicos de rellenos,
pelicular y de partcula porosa. El primero consiste en bolas de vidrio o de
polmero, no porosas y esfricas con unos dimetros caractersticos de 30 a 40
m. En la superficie de estas bolas se deposita una capa delgada y porosa de
slice, almina, de una resina sinttica de poliestireno-divinilbenceno o de una
resina de intercambio inico. Para algunas aplicaciones se aplica un
recubrimiento adicional, constituido por una fase estacionaria lquida que se
mantiene fija por adsorcin. Las bolas tambin se pueden tratar qumicamente
para obtener una capa superficial orgnica.
Los tpicos rellenos de partculas porosas para cromatografa de lquidos estn
formados por micropartculas porosas con dimetros entre 3 y 10 m y con la
menor dispersin posible con respecto a un tamao determinado. Las
partculas son de slice, almina, de una resina sinttica de poliestirenodivinilbenceno o resinas de intercambio inico, aunque la slice es el material
de relleno ms comn en cromatografa de lquidos. Las partculas de slice se
preparan aglomerando partculas de slice de tamaos inferiores al micrometro
en unas condiciones tales que se forman partculas mayores con dimetros
muy uniformes. Las partculas que resultan se recubren muchas veces con
pelculas orgnicas, que se unen qumica o fsicamente a la superficie.
6. Detectores.
Caractersticas del detector ideal:

Adecuada sensibilidad.
Buena estabilidad y reproducibilidad.
Respuesta lineal para los solutos que se extienda a varios rdenes
de magnitud.
Tiempo de respuesta corto e independiente del caudal.
Alta fiabilidad y manejo sencillo.
Respuesta semejante para todos los solutos o, por el contrario, una
respuesta selectiva y altamente predecible para uno o ms tipos de
solutos.
No destructivo de la muestra.
No hay un detector que rena todas estas caractersticas.

Un detector de HPLC debe tener un volumen interno mnimo a fin de reducir el


ensanchamiento de banda.
Los detectores en cromatografa de lquidos son de dos tipos bsicos:
-

Los detectores que se basan en la medida de una propiedad de la


disolucin responden a una propiedad del efluente (ndice de
refraccin, constante dielctrica, densidad, etc) que se modifica por
la presencia de los analitos.

Los detectores basados en una propiedad del soluto responden a


alguna de las propiedades del soluto (absorbancia en el UV,
fluorescencia, corriente lmite, etc.) que son inherentes a la fase
mvil.

24. Represente esquemticamente un cromatgrafo de gases indicando y


comentando cada uno de componentes.
25. Qu tipo de detector (no espectroscpico) utilizara para analizar
compuestos halogenados como pesticidas y bifenilos policlorados
mediante cromatografa de gases. Describa brevemente su
funcionamiento.
26. Propiedades de los fluidos supercrticos.
-

La temperatura crtica de una sustancia es la temperatura por encima de


la cual no puede existir en fase lquida independientemente de la
presin.
La presin de vapor de una sustancia a su temperatura crtica es su
presin crtica.
Una sustancia a temperaturas y presiones por encima de su temperatura
y de su presin crtica (punto crtico) se denomina fluido supercrtico.
Los fluidos supercrticos tienen densidades, viscosidades y otras
propiedades que son intermedias entre las caractersticas de esa
sustancia en estado gaseoso y en estado lquido.
Gracias a sus elevadas densidades (de 0,2 a 0,5 g/cm3), estos fluidos
poseen una notable capacidad para disolver molculas grandes no
voltiles.

Ciertos procesos industriales importantes se basan en la elevada


solubilidad de las especies orgnicas en dixido de carbono supercrtico.
Los analitos disueltos en los fluidos supercrticos pueden ser fcilmente
recuperados permitiendo que las disoluciones se equilibren con la
atmsfera a temperaturas relativamente bajas.
Otra ventaja de muchos de los fluidos supercrticos es que son baratos,
inocuos y no son sustancias txicas.
Adems, los fluidos supercrticos tienen la ventaja de que las
difusividades de los solutos en ellos son un orden de magnitud ms altas
que en los lquidos y que las viscosidades son un orden de magnitud
ms bajas que las de los disolventes lquidos. Ventajas importantes tanto
en la cromatografa como en las extracciones con fluidos supercrticos.

27. Represente de forma esquemtica y comente la instrumentacin utilizada


en la tcnica de extraccin con fluidos supercrticos. Qu diferencias
encontramos entre la instrumentacin utilizada para Cromatografa de
Fluidos Supercrticos y la instrumentacin utilizada para HPLC?
28. Explique los dos modos de operacin que pueden utilizarse en la
extraccin con fluidos supercrticos, e indique cul sera, en la prctica, la
ms adecuada.
Un sistema de SFE puede actuar de dos modos:
-

Extraccin dinmica: La vlvula entre la cubeta de extraccin y el


restrictor permanece abierta de manera que el fluido supercrtico fresco
llega continuamente a la muestra y la sustancia extrada fluye
continuamente hacia el recipiente donde se recoge y donde tiene lugar
la despresurizacin.
Extraccin esttica: La vlvula entre la cubeta de extraccin y el
restrictor est cerrada y la cubeta de extraccin est presurizada en
condiciones estticas. Despus de un perodo adecuado la vlvula de
salida se abre y el contenido de la cubeta se transfiere a travs del
restrictor. Este modo de operacin est menos difundido que el anterior.

En principio, cabe pensar que la extraccin dinmica d mejores y ms rpidas


recuperaciones, ya que con esta forma de operacin, durante todo el proceso
de extraccin, se produce la continua renovacin del fluido que entra en
contacto con la muestra, lo que hace que sea difcil que el fluido pueda llegar a
saturarse. No obstante, el modelo esttico permite una mayor penetracin del
fluido en los poros de la matriz de la muestra, as como el que se pueda
alcanzar el equilibrio de reparto del analito entre la matriz y el fluido. Esta es la
razn de que, en la prctica, las extracciones suelan llevarse a cabo realizando
una extraccin esttica, a la que sigue un perodo de extraccin dinmica
(extraccin esttica/dinmica).

29. Describa los mtodos de introduccin de muestra en electroforesis


capilar. Acompae la explicacin con un dibujo esquemtico.

En la inyeccin electrocintica, se retiran del depsito del tampn uno de los


extremos del capilar y el correspondiente electrodo, y se colocan en un
pequeo recipiente donde est situada la muestra. Se aplica entonces un
potencial durante un tiempo determinado, lo que hace que la muestra penetre
en el capilar debido a la actuacin conjunta de los fenmenos de migracin
inica y flujo electroosmtico. El extremo del capilar y el electrodo vuelven a
introducirse en la disolucin tampn, donde se mantiene durante el resto del
proceso de separacin. Esta tcnica de inyeccin es discriminatoria al
introducir mayor cantidad de los iones ms mviles respecto a los ms lentos.

En el mtodo de inyeccin por presin, el extremo del capilar se coloca


momentneamente en un pequeo recipiente que contiene la muestra, y se
utiliza una diferencia de presin para conducir la muestra al interior del capilar.
Esta diferencia de presin puede obtenerse por tres procedimientos:
-

Aplicando vaco en el extremo del detector.


Aplicando presin en el recipiente que contiene la muestra.
Elevando el extremo que contiene la muestra.

En los tres casos el volumen inyectado se controla por la duracin de la


inyeccin. Los volmenes de inyeccin ms habituales estn comprendidos
entre 5 y 50 nL, pero pueden llegarse a volmenes inferiores a los 100 pL.

30. Describa las diferentes maneras de llevar a cabo las separaciones por
electroforesis capilar.
Las separaciones por electroforesis capilar se llevan a cabo de distintas
maneras:
-

Electroforesis capilar de zona (CZE).

Tambin llamada electroforesis capilar en disolucin libre. Es el procedimiento


de electroforesis capilar ms habitual. La composicin del tampn es constante
en toda la zona de separacin y puede ser cido (fosfato o citrato), bsico
(borato), o anftero (carcter cido y bsico). El potencial aplicado hace que los
diferentes componentes inicos de la mezcla migren cada uno segn su propia
movilidad y se separen en zonas que puedan estar completamente resueltas o
parcialmente solapadas. Entre las zonas completamente resultas hay huecos
ocupados por el tampn.
-

Electroforesis capilar en gel (CGE).

Permite la separacin en funcin de la migracin electrofortica y tambin en


funcin del peso molecular de las muestras. El tipo de gel ms comnmente
utilizado en electroforesis es un polmero de poliacrilamida, formado por
polimerizacin de la acrilamida (CH2=CH-CO-NH2) en presencia de un agente
de entrecruzamiento. El tamao de poro del polmero depende de la relacin
entre monmero y agente de entrecruzamiento, de manera que al incrementar
la cantidad de este ltimo se produce una disminucin del tamao de poro.
Otros geles que se han empleado en electroforesis capilar son la agarosa, la
metilcelulosa y el polietilenglicol. Aplicacin: separacin de oligonucletidos.
-

Isoelectroenfoque capilar (CIEF).

Tambin recibe el nombre de electroforesis en soporte Se utiliza para la


separacin de especies anfteras como aminocidos y protenas, que
presentan en su estructura un grupo carboxlico (cido dbil) y un grupo amino
(base dbil). La separacin se lleva a cabo en una mezcla de tampones cuyo
pH vara continuamente a lo largo del sistema de separacin. Estos procesos
tienen como resultado la separacin de los analitos en bandas estrechas,
situadas en el valor de pH correspondiente a su punto isoelctrico.
Posteriormente ser necesario desplazar o movilizar el contenido del capilar, y
hacer as que las bandas alcancen el detector. La movilizacin puede llevarse a
cabo aplicando una diferencia de presin, de la misma manera que para cargar
la muestra. Las altas eficiencias obtenidas con este procedimiento permiten
separar pptidos con pI que apenas difieren entre s 0,02 unidades de pH.
-

Isotacoforesis (CITP).

Las bandas de todos los analitos migran, finalmente, a la misma velocidad. En


cualquier aplicacin concreta, bien los cationes o bien los aniones pueden ser
separados, pero no ambos al mismo tiempo. Antes de iniciar la EF, el capilar se
debe llenar con un electrolito gua en un extremo. Este debe tener una gran
movilidad y debe ser mayor que la de los componentes a separar. Luego se
introduce la muestra seguida del electrolito terminal o cola, cuya movilidad
debe ser menor que cualquiera de los componentes de la muestra. Entre estos
dos tampones se inyecta la muestra. Cuando en una separacin por
isotacoforesis se aplica inicialmente un potencial, los iones migran como en la
electroforesis de zona, cada ion a una velocidad caracterstica que viene dada
por el producto de eE. La diferencia en las velocidades de migracin da lugar
a la separacin de los distintos analitos en bandas adyacentes, con la especie

ms rpida situada en la banda ms prxima al tampn conductor y la ms


lenta inmediatamente por delante del tampn terminal. Una vez que se han
formado todas las bandas, todas ellas se mueven a la misma velocidad.
31. Qu es el flujo electroosmtico? Por qu tiene lugar? Sugerir una
manera de evitar dicho fenmeno.
-

Cuando se aplica un potencial elevado a travs de un capilar que


contiene un tampn, se origina normalmente un flujo electroosmtico,
gracias al cual el disolvente migra hacia el ctodo o el nodo.

La causa del flujo electroosmtico es la doble capa elctrica que se


forma
en
la
interfase
slice/disolucin.

Puede eliminarse el flujo electroosmtico por recubrimiento de la pared


interna del capilar con un reactivo como el trimetilclorosilano, para
eliminar los grupos silanol de la superficie.

32. Indique las etapas de las que consta un anlisis por espectrometra de
masas.
Un anlisis por espectrometra de masas atmica implica las siguientes etapas:
1. Atomizacin.
2. Conversin de una fraccin significativa de los tomos formados en la
anterior etapa en un flujo de iones (generalmente iones positivos de una
sola carga).
3. Separacin de los iones formados segn su relacin masa/carga (m/z).
4. Recuento del nmero de iones de cada tipo o medida de la corriente
inica producida cuando los iones formados a partir de la muestra llegan
al detector.
33. Tipos de analizadores en espectrometra de masas atmica.
Analizador de masas cuadrupolar
Es el analizador ms comn. Es ms compacto, ms barato y ms robusto que
cualquier otro tipo de espectrmetro de masas. Posee una elevada velocidad
de barrido, de manera que se puede obtener un espectro de masas completo
en menos de 100 ms. El corazn de un instrumento cuadrupolar es un conjunto
de las cuatro barras cilndricas paralelas que actan como electrodos. En
cualquier momento, todos los iones excepto aquellos que tengan un
determinado valor de m/z inciden en las barras y se convierten en molculas
neutras. Por tanto, slo los iones cuyo valor de m/z est dentro de un intervalo
limitado alcanzarn al detector. Generalmente, los instrumentos cuadrupolares
separan fcilmente iones que difieren en su masa en una unidad. Un
cuadrupolo es parecido a un filtro de banda estrecha variable, ya que en unas
determinadas condiciones de operacin transmite slo iones de un pequeo
intervalo de relaciones m/z. El resto de iones son neutralizados y eliminados
como molculas sin carga. Variando las seales elctricas de un cuadrupolo es

posible variar el intervalo de valores m/z transmitidos haciendo as posible el


barrido espectral. Debido a que los cuadrupolos funcionan por eliminacin
selectiva de iones, se llaman a menudo filtros de masas, en vez de
analizadores de masas. La parte ms importante de este analizador es el
conjunto de cuatro barras cilndricas de metal que sirven de electrodos del filtro
de masas. Los iones de la fuente son acelerados por un potencial de 5 a 15 V e
introducidos en el espacio entre las barras. Las barras opuestas se conectan
elctricamente, un par al polo positivo de una fuente variable de corriente
continua y el otro par a la terminal negativa. Adems, se aplican a cada par de
barras potenciales variables de corriente alterna de radiofrecuencia. Las barras
cilndricas son normalmente de 6 mm de dimetro y raramente tienen ms de
15 cm de longitud. Estn sujetas rgidamente sobre soportes cermicos
construidos con precisin que proporcionan una buena estabilidad mecnica
aunque cambie la temperatura. La aplicacin a cada par de barras opuestas de
un voltaje y una radiofrecuencia posibilita un control de la trayectoria de los
iones. Esto permitir al in m/z seguir una trayectoria rectilnea y cruzar el tnel
alcanzando el detector, mientras que las dems masas, al ser inestables sus
trayectorias, no alcanzan el detector, siendo desviadas fuera del conjunto de
barras. Las ventajas de los espectrmetros con analizador de cuadrupolo
respecto a los de sector magntico son su menor coste, facilidad de uso y
barrido rpido. Sus desventajas son su menor sensibilidad y resolucin.
Analizador de masas de tiempo de vuelo (TOF)
Los iones positivos se producen peridicamente mediante el bombardeo de la
muestra con impulsos cortos de electrones, iones secundarios o fotones
generados por lser. Los iones producidos de esta manera son acelerados
despus mediante un impulso de campo elctrico de 103 a 104 V. Las
partculas aceleradas pasan al tubo analizador de aproximadamente un metro
de longitud y que no est sometido a ningn campo. Todos los iones que entran
en el tubo idealmente tienen la misma energa cintica, por tanto sus
velocidades deben variar inversamente con sus masas, llegando al detector
antes las partculas ms ligeras que las ms pesadas. Los tiempos de vuelo
habituales son de 1 a 30 s. Este tipo de equipos suelen usar como detector un
multiplicador de electrones. Resolucin y reproducibilidad peores que los
instrumentos cuadrupolares y de sector magntico. Ventajas: sencillez,
robustez, facilidad de accesibilidad a la fuente de iones, intervalo de masas
virtualmente ilimitado, rapidez en la adquisicin de datos. En la actualidad se
emplea rutinariamente en el campo del anlisis de biomolculas, desde
azcares de menos de 1000 Da, hasta protenas de ms de 300 KDa,
empleando tcnicas de ionizacin por desercin con lser tipo MALDI-TOF
(Matriz Assisted Laser Desorption Ionisation-Time of Flight)
Analizadores de doble enfoque
Los iones que proceden de la fuente son acelerados a travs de una rendija en
la que un campo electrosttico curvado sirve para enfocar un haz de iones que
tiene una banda estrecha de energas cinticas sobre una rendija que conduce
a un campo magntico curvado. En este campo, los iones ms ligeros son los
que ms se desvan y los iones ms pesados, los que menos. Los iones

dispersados inciden sobre una placa fotogrfica y, por tanto se registran.


Resolucin de 0,001 respecto a una m/z de 100
34. A continuacin se muestran tres espectros de masas de cido glutmico
obtenidos mediante diferentes tcnicas de ionizacin. Indique con qu
tcnica se ha obtenido cada espectro, y comente las principales
caractersticas de esa fuente.

35. Cuando se trata de fines analticos, cmo podemos obtener Rayos X?


Cuando se trata de fines analticos, los rayos X se obtienen de cuatro maneras:
-

Por bombardeo de un blanco metlico con un haz de electrones de


elevada energa.
Por exposicin de una sustancia a un haz primario de rayos X con el
objetivo de generar un haz secundario de fluorescencia de rayos X.
Utilizando una fuente radiactiva cuyo proceso de desintegracin da lugar
a una emisin de rayos X.
A partir de una fuente de radiacin sincrotrn (acelerador de partculas).

36. Describa los diferentes componentes que integran los espectrmetros de


Rayos X.
Estos componentes incluyen una fuente, un dispositivo encargado de
seleccionar el intervalo de longitud de onda de la radiacin incidente, un
soporte para la muestra, un detector de radiacin o transductor, un procesador
de la seal y un dispositivo de lectura.
1.

Fuentes

En los instrumentos de rayos X se pueden encontrar tres tipos de fuentes:


El tubo de rayos X
Es la fuente ms habitual de rayos X para el trabajo analtico. Tambin llamado
(tubo de Coolidge), que puede adoptar una gran variedad de formas. Es un
tubo a alto vaco en el que se instala un ctodo de filamento de wolframio y un
nodo slido. El nodo consta, normalmente, de un bloque pesado de cobre
con un blanco de metal (wolframio, cromo, cobre, molibdeno, rodio, escandio,
plata, hierro, cobalto) dispuesto sobre o empotrado en la superficie de cobre.
Se utilizan circuitos separados para calentar el filamento y para acelerar los
electrones hacia el blanco. El circuito de calentamiento permite controlar la

intensidad de los rayos X emitidos mientras que el potencial de aceleracin


determina su energa o longitud de onda
Radioistopos
Diversas sustancias radiactivas se han utilizado como fuentes en mtodos de
fluorescencia y de absorcin de rayos X. Generalmente, el radioistopo se
encapsula para prevenir la contaminacin del laboratorio. Estas fuentes
radiactivas pueden proporcionar espectros de lneas sencillos o continuos,
pudiendo emplearse para estudios de absorcin o fluorescencia.
Fuentes de fluorescencia secundaria.
Consiste en la exposicin de una sustancia a un haz primario de rayos X, de
manera que la sustancia genere un haz secundario de fluorescencia de rayos
X. De esta manera se evita el espectro continuo de la fuente primaria y se
trabaja solo con los espectros lineales de la fuente secundaria.
2.

Filtros de rayos X

En muchas aplicaciones, es deseable utilizar un haz de rayos X con un


intervalo de longitudes de onda restringido. Con este objetivo, se utilizan tanto
filtros como monocromadores.
3. Monocromadores para rayos X
El monocromador consta de un elemento dispersante y de un par de
colimadores del haz, que tienen la misma finalidad que las rendijas en un
instrumento ptico. El elemento dispersante es un monocristal instalado sobre
una placa rotatoria que permite variar y determinar de forma precisa el ngulo
, formado por la cara del cristal y el haz incidente colimado. Para un ngulo
dado elegido, slo se difractan algunas longitudes de onda. Para obtener un
espectro, es necesario que el colimador del haz de salida y el detector estn
colocados sobre un segundo soporte que gire a doble velocidad que el primero;
esto es, cuando el cristal gira un ngulo , el detector debe desplazarse
simultneamente un ngulo 2. Los colimadores de los monocromadores de
rayos X constan, normalmente, de una serie de placas o tubos de metal poco
espaciados que absorben todos los haces de radiacin excepto los paralelos.
La radiacin X de longitud de onda superior a aproximadamente 2 armstrongs
es absorbida por los componentes de la atmsfera. Por ello, cuando se
necesitan longitudes de onda largas se suministra un flujo continuo de helio a
travs del compartimento de la muestra y del monocromador. Como alternativa
se puede hacer el vaco en estas reas mediante bombas de vaco. En un
monocromador equipado con un cristal plano la prdida de intensidad es alta,
ya que hasta el 99 por 100 de la radiacin es lo suficientemente divergente
como para ser absorbida en los colimadores. Esta prdida de intensidad puede
minimizarse utilizando superficies cristalinas curvadas que consiguen el
enfoque del haz divergente de la fuente sobre el colimador de salida.
La mayora de las lneas de rayos X importantes analticamente se encuentran
en la regin comprendida entre alrededor de 10 y 100 nm. Un solo cristal no

dispersa satisfactoriamente la radiacin en todo este intervalo. Como


consecuencia, un monocromador de rayos X debe estar provisto, al menos, de
dos (y preferiblemente de ms) cristales intercambiables.
4. Detectores de rayos X
Los primeros equipos de rayos X utilizaban emulsiones fotogrficas para la
deteccin y medida de la radiacin. Sin embargo, por razones de comodidad,
velocidad y precisin, los instrumentos modernos estn equipados,
generalmente con detectores que convierten la energa radiante en una seal
elctrica.
- Se pueden encontrar tres tipos de detectores:
Detectores de gas
Contadores de centelleo
Detectores semiconductores.
5. Procesadores de seal
La seal del preamplificador de un espectrmetro de rayos X alimenta a un
amplificador lineal de respuesta rpida cuya amplificacin puede variarse en un
factor de hasta 10.000. Como resultado se obtienen unos impulsos de potencial
del orden de los 10 V.
37. Qu es el coeficiente de absorcin msico?
Es un parmetro de la Ley de Beer, el cual es independiente del estado fsico o
qumico del elemento.
38. Comente los diferentes tipos de espectrometra Raman estudiados,
comentando las ventajas e inconvenientes de unos sobre otros.
39. Fuentes de radiacin en espectroscopa Raman
Las fuentes utilizadas en la espectrometra Raman moderna son casi siempre
lseres debido a su alta intensidad, necesaria para producir una relacin
seal/ruido razonable. El lser de diodos y el de Nd-YAG, que emiten radiacin
del infrarrojo cercano, se usan cada vez ms como fuentes de excitacin. Las
fuentes del infrarrojo cercano presentan dos ventajas importantes sobre los
lseres de longitud de onda ms corta. La primera es que pueden funcionar a
potencias muy superiores (hasta 50 W), sin producir fotodescomposicin de la
muestra. La segunda es que no son lo suficientemente energticas para
provocar, en la mayora de las molculas, un nmero significativo de estados
electrnicos excitados capaces de producir fluorescencia. Como consecuencia,
con estos lseres, la fluorescencia es, en general, mucho menos intensa o
inexistente. La lnea a 1.064 nm de Nd/YAG es particularmente efectiva para
eliminar la fluorescencia. Las dos lneas del lser de diodos en serie a 782 y
830 nm tambin reducen notablemente la fluorescencia en la mayora de los
casos. Es necesario disponer de varias fuentes porque hay que elegir una con
la que no absorba la muestra (excepto para las medidas de Raman de
resonancia), o el disolvente.

40. Mecanismo de la dispersin Raman y Rayleigh


En la espectroscopia Raman, la excitacin espectral se realiza, de ordinario,
con radiacin cuya longitud de onda est muy alejada de la de los picos de
absorcin del analito. La flecha gruesa de la izquierda representa el cambio de
energa de la molcula cuando interacciona con un fotn de la fuente. El
aumento de energa es igual al de del fotn hv. La segunda flecha ms fina,
muestra el tipo de cambio que ocurrira si la molcula alcanzada por el fotn
estuviera en el primer nivel vibracional del estado electrnico fundamental. A
temperatura ambiente, la fraccin de molculas que se encuentran en este
estado es pequeo. De este modo, como se indica por la anchura de las
flechas, la probabilidad de que ocurra este proceso es mucho menor. Las
flechas centrales representan los cambios que originan la dispersin Rayleigh.
De nuevo, el cambio ms probable se indica por una flecha ms gruesa.
Obsrvese que en la dispersin Rayleigh no se pierde energa. Como
consecuencia, las colisiones que tienen lugar entre el fotn y la molcula se
dice que son elsticas. Por ltimo, en la parte derecha se representan los
cambios de energa que producen la emisin Stokes y la anti-Stokes. Las dos
difieren de la radiacin Rayleigh en la frecuencia correspondiente a E, la
energa del primer nivel vibracional del estado fundamental. Obsrvese que si
el enlace fuera activo en el infrarrojo, la energa de su absorcin sera tambin
E. Por tanto, el desplazamiento de la frecuencia Raman y la frecuencia del
pico de absorcin en el infrarrojo tiene la misma magnitud.
41. En qu se basan las tcnicas de RMN?
Se basa en la medida de la absorcin de la radiacin electromagntica en la
regin de las radiofrecuencias aproximadamente de 4 a 900 MHz.
42. En un experimento de resonancia magntica nuclear, Cul es la relacin
el campo magntico aplicado y la frecuencia de resonancia?
43. Explicar la diferencia en la forma en que se realiza un experimento de
RMN de transformada de Fourier y uno de onda continua.
44. Indica qu tipo de espectros son los que aparecen a continuacin, y que
los caracteriza.

2- Espectro de absorcin de rayos X, una peculiaridad de los espectros de


absorcin de rayos X es la aparicin de unas discontinuidades agudas,
llamadas discontinuidades, lmites o bordes de absorcin, a longitudes de onda
inmediatamente superiores a las del mximo de absorcin.