Anda di halaman 1dari 13

DISOSIASI JARINGAN, PENENTUAN JUMLAH DAN VIABILITAS SEL

Oleh :
Nama
NIM
Rombongan
Kelompok

: Ita Pratiwi K
: B1J012042
: II
:3

LAPORAN PRAKTIKUM KULTUR JARINGAN HEWAN

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN


UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2014

I.

PENDAHULUAN
A. Latar Belakang

Kultur sel hewan berasal dari eksplan jaringan atau supensi sel sebagai
kultur sel primer yang dapat di subkultur dengan rentang hidup yang terbatas. Selsel mungkin kehilangan beberapa sifat asli mereka karena adanya transformasi.
Banyak cellline yang bersifat aneuploidi dengan materi genetik yang tidak stabil.
Sintesis berbagai bioproduk seperti vaksin, antibody monoklonal, enzim, dan
hormon didapatkan dengan kultur sel sehingga banyak usaha yang dilakukan
untuk mengembangkan dan meningkatkan teknologi kultur sel. Penelitian akan
rmerangsang kemajuan metode kultur sel yang memberikan pemahaman lebih
baik mengenai invasi tumor dan mengungkapkan pentingnya matriks ekstra
seluler untuk pengaturan fisiologis interaksi sel-sel yang tidak dapat diamati
dengan system kultur monolayer atau suspensi. Pengetahuan akan hal ini
membantu untuk meningkatkan aplikasi kultur sel yang digunakan dalam
perawatan klinis seperti halnya untuk penyembuhan luka dengan implantasi
epidermis atau organ cacat seperti hati yang dapat didukung dengan organ
bioartificial yang bersifat sementara (Hlser, 2004).
Kultur Jaringan adalah suatu ungkapan umum yang digunakan untuk
mengisolasi sel, jaringan, atau organ dari hewan dan menempatkan mereka ke
lingkungan buatan untuk pertumbuhannya. Hal ini juga dikenal sebagai teknik
untuk menjaga jaringan hidup dan tumbuh dalam media kultur yang tepat.
Jaringan tumbuh organisme hidup di luar tubuh harus berada dalam media kultur
yang tepat, yang mengandung campuran nutrisi seimbang dalam bentuk padat atau
cair. Kultur sel berasal dari isolasi sel dari hewan atau tumbuhan dan pertumbuhan
selanjutnya berada dalam lingkungan buatan yang menguntungkan. Sel-sel dapat

diambil dari jaringan secara langsung dan dipisahkan dengan cara enzimatik atau
mekanis sebelum dikultur (Gibco, 2013).

B. Tujuan
Tujuan dari praktikum disosiasi jaringan, penentuan jumlah dan viabilitas sel
yaitu untuk membekali mahasiswa dengan keterampilan untuk mempersiapkan
kultur primer.

II.

MATERI DAN METODE


A. Materi
Alat-alat yang digunakan pada praktikum ini adalah alat bedah, cawan
petri,

waterbath,

tabung

sentrifugator,

tabung

falcon,

mikroskop,

haemocytometer, pipet transfer, mikropipet, dan stopwatch.


Bahanbahan yang digunakan adalah hepar, limfe dan ginjal ikan Nilem,
tripsin-EDTA, alkohol 70%, mediun DMEM, serum, antibiotik, dan Trypan blue.
B. Metode
1. Ikan dilumpuhkan dengan merusak bagian syaraf menggunakan gunting.
Tangan dicuci besih menggunakan sabun hinggga bersih.
2. Bagian abdomen ikan dibersihkan dengan menggunkan tissue yang telah
dibasahi oleh alkohol 70%.
3. Bagian abdomen ikan dibedah dengan menggunakan alat bedah yang telah
disterilisasi, hepar, limfe dan ginjal diangkat dan diletakkan di cawan petri
steril. Handling medium ditambahkan ke dalam cawan petri agar hepar, limfe
dan ginjal tidak mengalami dehidrasi. Proses ini dilakukan dalam kondisi
aseptis di dekat bunsen.
4. Hepar, limfe dan ginjal dipotong hingga berukuran kecil sekitar 1 mm 3
kemudian masukan kedalam tabung berisi dissociating medium yang
mengandung 0,025% Tripsin.
5. Tabung dimasukan kedalam waterbath dengan temperatur 37oC selama 15
menit. Setiap 5 menit sekali, tabung diagitasi untuk menghomogenkan.
6. Setelah itu tabung disentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit.
Supernatan dibuang dan tambahkan washing medium yang mengandung
serum kedalam tabung.
7. Natan yang didapat diresuspensi menggunakan washing medium kemudian
sentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit. Tahap ini diulang
hingga dua kali untuk menghilangkan tripsin.
8. Kepadatan sel dihitung dengan menggunakan haemocytometer.

9. Suspensi sel diambil 9 bagian dan tambahkan 1 bagian trypan blue untuk
mewarnai sel yang mati. Proporsi sel yang hidup dihitung untuk menentukan
viabilitas sel
10. Hasil disosiasi disimpan dalam refrigerator.

III.

HASIL DAN PEMBAHASAN


A. Hasil
Tabel 1. Jumlah dan Viabilitas dari Disosiasi Hepar, Limfe dan Ginjal Ikan
Rombongan 1
Jenis
Jaringan

Berat
Jaringan
(g)

Volume
suspensi
sel (ml)

Kepadata
n (sel/ml)

Hepar
Ginjal
Limfa

0,2
0,03
0,03

1
1
1

6,96 x 106
2,51 x 106
1,53 x 106

Jumlah Sel
dalam
Suspensi
(sel)
6,96 x 106
2,51 x 106
1,53 x 106

Viabilitas
(%)

Jumlah sel
per gram

38,9
46,215
52,77

3,48 x 107
8,37 x 107
5,12 x 107

Tabel 1. Jumlah dan Viabilitas dari Disosiasi Hepar, Limfe dan Ginjal Ikan
Rombongan 2
Jenis
Jaringan

Berat
Jaringan
(g)

Volume
suspensi
sel (ml)

Kepadata
n (sel/ml)

Hepar
Ginjal
Limfa

0,1
0,03
0,04

1
1
1

2,43 x 107
9,75 x 106
2,82 x 107

Jumlah Sel
dalam
Suspensi
(sel)
2,43 x 107
9,75 x 106
2,82 x 107

Viabilitas
(%)

Jumlah sel
per gram

66,46
78
70,2

2,43 x 108
3,25 x 108
7,05 x 108

Perhitungan :
1. Viabilitas Sel

= Jumlah sel hidup/Jumlah sel hidup dan mati X 100 %


= 323/486 x 100 % = 66,46 %

2. Kepadatan Sel

= Rata-rata 5 kotak X 2,5.105


= 97,2 x 2,5.105 = 2,43 x 107

3. Sel dalam suspensi

= Kepadatan sel x volume suspense


= 2,43 x 107 x 1 mL = 2,43 x 107

4. Jumlah sel per gram jaringan = Jumlah sel/gram jaringan


= 2,43 x 107/0,1 = 2,43 x 108

Gambar 1. Jaringan Hepar Hasil Disosiasi

B. Pembahasan
Berdasarkan hasil pengamatan bahwa rombongan 1 kelompok 1
mendapatkan kepadatan sel 6,96 x 106 dengan viabilitas 38,9 %, kelempok 2
mendapatkan kepadatan sel 2,51 x 106 dengan viabilitas 46,215 %, dan kelempok
3 mendapatkan kepadatan sel 1,53 x 106 dengan viabilitas 52,77 %. Hasil
rombongan 2 kelompok 1 mendapatkan kepadatan sel 2,43 x 10 7 dengan viabilitas
66,46 %, kelempok 2 mendapatkan kepadatan sel 9,75 x 106 dengan viabilitas 78
%, dan kelempok 3 mendapatkan kepadatan sel 2,82 x 107dengan viabilitas 70,2
%. Viabilitas sel dari semua kelompok tidak sesuai dengan pustaka yaitu viabilitas
sel paling sedikit 95% (Gibco, 2013). Jumlah sel yang didapatkan ketiganya tidak
sesuai dengan pustaka yaitu jumlah sel hasil disosiasi hepar ikan forel yaitu
2,92x106 (Klaunigetal., 1985). Adanya perbedaan antara rombongan 1 dan 2
dimugkikan karena perbedaan medium basal yang digunakan serta septisitas saat
kerja.
Berdasarkan penelitian yang dilakukan Duncan et al. (2010) menyebutkan
hepatosit primer diisolasi dengan dua langkah kolagenase perfusi 11 dan kultur
hepatosit

diisolasi

dengan

tripsinisasi.

Protokol

rinci

dijelaskan

untuk

isolasi/analisis populasi ploidi hepatosit dengan sitometri. FACS (fluorescence


activated cell sorting) dimurnikan dari hepatosit tikus tua 3-6 bulan yang diambil
jumlah sel yaitu 1000-2000 sel/cm2. Sel awalnya diinkubasi dalam media kultur
hepatosit mengandung DMEM dengan 4,5g/l glukosa (HyClone), 10% FBS
(HyClone), asam amino nonesensial (Cellgro) dan antibiotic anti mycotic
(Cellgro). Setelah 24 jam, medium kultur diganti dengan medium SUM3
ditambah dengan 0,5% FBS. Sel dikultur untuk interval di definisikan.
Media yang digunakan adalah handling medium yang meliputi media dasar
(DMEM) dan antibiotic yang dapat berupa streptomycin atau penicillin. Media

yang digunakan untuk tripsinasi berupa media yang mengandung tripsin.Washing


medium yaitu media dasar (DMEM) yang ditambahkan antiobiotik dan serum
yang biasanya berupa fetal bovine serum (Hlser, 2004). Disosiasi dari jaringan ke
suspense sel tunggal membutuhkan sebuah disosiasi atau penghancuran matriks
ekstra seluler (stroma). Metode yang digunakan bergantung pada komposisi dari
stroma. Parameter-parameter lain, jenis, kualitas, dan kuantitas sel juga harus
diperhatikan. Penggunaan enzim hidrolitik akan mengubah kondisi ekstraseluler
sel (Krause, 1973).
Penghitungan jumlah sel sangat penting dilakukan untuk memonitor
pertumbuhan dalam pengaturan kultur sel dengan jumlah yang diketahui.
Hemositometer merupakan alat yang biasa digunakan dalam perhitungan juumlah
sel dan dalam menentukan viabilitas sel. Hemositometer adalah slide kaca cukup
tebal dengan dua tempat untuk menghitung. Setiap 9 kotak memiliki volume
0,0001mL. Hemositometers sangat baik untuk menentukan viabilitas sel, tetapi
tidak tepat untuk menentukan jumlah sel karena jumlah yang sel yang relative
rendah. Penghitungan otomatis akan menghasilkan data yang paling dapat
diandalkan, terutama bila digunakan dalam kombinasi dengan data viabilitas dari
hemositometer (Freshney, 2011).
Tes viabilitas sel (yaitu penentuan jumlah sel-sel yang hidup dalam
sampel), yang berguna ketika sel yang tidak membelah (seperti sel primer)
terisolasi dan dipelihara dalam kultur, hal ini membantu untuk menentukan
kondisi kultur yang optimal. Metode yang paling berguna dan mudah untuk
menentukan jumlah sel yang viable adalah untuk pewarna sel dengan pewarna
seperti Trypan blue dan menghitungnya dengan hemositometer (seperti
hemositometer Neubauer). Pewarna ini memungkinkan untuk membedakan antara

sel-sel hidup dengan tanpa tidak menyerap warna dan yang tidak hidup (berwarna
biru) (Acea, 2013).
Viabilitas tes mengukur jumlah sel yang viable dalam suatu populasi.
Kombinasi viabilitas dengan jumlah sel yang mana jumlah sel yang viable
memberikan indikasi yang akurat tentang sel kultur yang baik. Metode yang
paling umum dan cepat berdasarkan integritas membrane sel sebagai indicator
viabilitas sel. Trypan blue dan erythrosin B tidak diserap oleh sel-sel yang viable
(Freshney, 2011). Menurut Coder (1997), viabilitas sel dapat ditentukan dari
perubahan morfologi atau oleh perubahan pada permeabilitas membrane terhadap
penyerapan zat warna tertentu. Untuk menghitung viabilitas sel dapat dilakukan
dengan bantuan mikroskop dengan cara menandai sel yang tidak viable. Pewarna
yang dapat digunakan adalah typan blue. Sel yang viabel memiliki membran utuh
dan akan melarang baahan pewarna masuk ke dalam sel sehingga sel tidak
terwarnai sedangkan sel yang tidak viabel akan terwarnai oleh zat pewarna.

IV.

KESIMPULAN DAN SARAN


A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil praktikum disosiasi jaringan, penentuan jumlah dan


viabilitas sel dapat disimpulkan bahwa :
1. Hasil disosiasi jaringan hepar kelompok 3 dengan berat 0,1 gram
mendapatkan kepadatan sel 2,43 x 107 sel/mL dengan viabilitas sel sebesar
66,46 %, jumlah sel dalam suspense adalah 2,43 x 10 7 sel/mL dan jumlah
sel/gram sebesar 2,43 x 108 sel/gram.

B. Saran
Saat melakukan persiapan kultur primer aseptisitas harus dijaga agar tidak
terjadi kontaminasi dan agar viabiltas sel yang didapatkan pun tinggi sehingga
dapat digunakan untuk kultur. Saat melakukan perhitungan sel yang hidup dan
mati pun harus lebih teliti agar data yang didapatkan lebih akurat.

DAFTAR REFERENSI
Acea. 2013. Culture and Monitoring of Animal Cells Basic Techniques.ACEA
Biosciences, Inc. USA.
Coder, D.M. 1997. Assessment of Cell Viability. Current Protocols in Cytometry
(1997) 9.2.1-9.2.14. Copyright 1997 by John Wiley & Sons, Inc.
Duncan, W. Andrew, M. H. Taylor, R. D. Hickey, A. E. H. Newell, M. L. Lenzi, S.
B. Olson, M. J. Finegold, M.Grompe. 2010. The Ploidy Conveyor of
Mature Hepatocytes as A Source of Genetic Variation. Journal of Medical
Genetics467(7316): 707710. DOI:10.1038/nature09414.
Freshney, R. 2011. Animal Cell Culture Basics: Tips and Techniques for
Continuous Cell Lines.ATCC.10801 University Blvd. Manassas, Virginia.
Gibco. 2013. Cell Culture Basics. Life Technologies Corporation. Indonesia.
Hlser, F. Dieter. 2004. Brain Tumour Development and Invasion. Int. J. Dev.
Biol. 48: 497-508 (2004).
Klaunig, J. E., Ruch R. J., Goldblatt P. J. 1985. Trout Hepatocyte Culture:
Isolation and Primary Culture. In Vitro Cell Dev Biol. 1985 Apr;21(4):2218.
Krause, F. Paul. 1973. Tissue Culture : Methods and Aplications. Academic Press
Inc. USA.