17/05/2015

TrabalhoEnzimas

Depto.CinciasBiolgicas

LCB208BIOQUIMICA

ENZIMAS2

Prof.Dr.LuizAntonioGallo
Colaboradores:GiulianaCastroMagalhesePauloF.MendesFilho

ICONCEITO

Asenzimassoprotenasespecializadasemcatalisarreaesbiolgicas,ousejaaumentamavelocidadedeumareaoqumicasem
interferirnoprocesso.Elasestoassociadasabiomolculas,devidoassuasextraordinriaespecificidadeepodercataltico.

Ia.Histria

Onomeenzimaprovmde"inyeasts",noqualsuspeitavasequeascatlisesbiolgicasestavamenvolvidascomafermentaodo
acaremlcool.
AprimeiradescobertafoifeitaporPayenePersozem1833,quandoencontraramumasubstnciatermolbilnoprecipitadodolcool,
extratodemalte,queconvertiaamidoemacar,maistardedenominadaamilase.Aprimeirateoriafoipublicadaem1835porBerzelius.
Pasteurem1860postulouqueasenzimasestoassociadasestruturaeavidadaclula.
Em 1877 Buchener obteve sucesso na extrao de enzimas de clulas de leveduras que catalisavam a fermentao alcolica. Isto
demonstrou que estas enzimas catalisavam a maioria das vias metablicas energticas e podem funcionar independentemente da sua
estrutura.
Aenzimafoiprimeiramenteisoladanaformacristalina,masistofoicompreendidomelhorquandoSummerem1926isolouureasede
feijoeevidenciouqueestescristaisconsistememprotenas.
Hoje2000diferentesenzimassoconhecidas,nasquaismuitassoisoladasnaformapurahomogenizadae200naformacristalizada.

IINATUREZAEESTRUTURAENZIMTICA

Todasasenzimassoprotenas,masnemtodasasprotenassoenzimas.Asprotenas,comoumtodo,ocupamumpapeldedestaque
nadinmicaeestruturaodosorganismosvivos.
Asenzimas,partedestegrupodeprotenas,funcionamcomocatalisadores,permitindoqueumareaoqumicavenhaaocorrerdentro
doslimitesdastemperaturasbiolgicas.
Paraumperfeitoentendimentosobreaestruturadeumaenzimaecomoestafunciona,devemosconsideralatantocomoumaprotena
quantoumcatalisadorbiolgico.
Comoumaprotenaaenzimaapresentablocosdeconstruodenominadosaminocidos.Algumasprotenas,taiscomoribonucleases,
quimiotripsinaetripsina,soconstitudasapenasdeaminocidos.Outrasprotenas,almdosaminocidos,contmcomponentesorgnicose
inorgnicosesodenominadasdeprotenasconjugadas.Aperoxidaseeacatalasesoexemplosdeenzimascomestruturaconjugadaeque
apresentamporfirinafrricacomocofator.
Asligaespeptdicasqueligamcadeiaslinearesdeaminocidoscaracterizamaestruturaprimriadasprotenas.
Considerandose apenas a estrutura primria de uma protena, a molcula deveria ser muito extensa e muito fina. Porm, muitas
enzimasapresentamumaformaglobosaemvezdafinafitalinear,evidenciandoestruturaesdeordemsuperior,conhecidascomoestrutura
secundria,terciriaequaternria,queocorrememfunodeinteraesintrnsecasentreosblocosconstituintesdamolcula.
A estrutura secundria de uma protena caracterizada pela formao de alfa hlices e folhas beta, conformaes resultantes das
interaesacimamencionadas.Somenteestaestruturaadicionalexplicacomoumamolculadeprotenapossasertocompacta.Quandoas
quatropontesdedissulfetoqueestabilizamaestruturadeumaribonucleasesoreduzidasemumasoluodeuria,acadeiapolipeptdica
assume uma conformao espiralada randmica e perde toda a sua atividade enzimtica. Removendose a uria e o agente redutor e
deixandoseaspontesdedissulfetorestabeleceremse,maisde90%daatividadeenzimticavoltaaocorrereaspropriedadesdamolcula
retornamquelasdoestadooriginal.
Naestruturaterciria,aprotenaestenroladadeumamaneiracomplexaeirregular,formandoumprismacompacto,triangulares
vezesachatado.Nestaconformaoosgruposhemeequasetodososresduosdeaminocidospolaresestonasuperfcieenquantoquequase
todososresduosdeaminocidosnopolaresestoorientadosparaointeriordamolcula.Consequentemente,osresduoshidroflicosesto
expostosaosolvente,gua,enquantoosresduoshidrofbicossoremovidosdaguaoquantopossvel.Umnmerograndedediferentes
ligaes est envolvido na estabilizao desta conformao terciria. Estas incluem ligaes eletrostticas, pontes de hidrognio, pontes
hidrofbicas,pontesdipolaresepontesdedissulfeto.
Muitas enzimas so compostas de uma cadeia polipeptdica simples. Este caso de enzimas como a ribonuclease, lisosima,
tripsina,pepsina e algumas alfa amilases. Ao contrrio, existe um grande nmero de enzimas que so compostas por mais de uma cadeia
peptdica.Aenzimalactatodesidrogenasecompostaporquatrocadeiaspolipeptdicas.Arepetiodascadeiaspolipeptdicasnaconstruo
deumamacromolculadeprotenacaracterizaaestruturaoquaternriaqueestapodeassumir.

IIINOMENCLATURAECLASSIFICAODASENZIMAS:

Anomenclaturadasenzimastemsidoutilizadadevriasmaneiras.Amaisutilizadafeitapelaadiodosufixoaseaonomedo
substrato(chamadadeNomeRecomendado),ouseja,amolculanaqualaenzimaexercesuaaocataltica.Nestecaso,aenzimaurease
catalisaahidrlisedauriaemamniaeCO2,aarginasecatalisaahidrlisedaargininaemornitinaeuria,eafosfatasecatalisaahidrlise
desteresdefosfato.
Entretanto,estanomenclaturasimplesnotemsemostradoprticaumavezquemuitasenzimasrecebemdenominaesque,doponto
de vista qumico, so muito pouco informativos. Por esta razo, e tambm devido descoberta de novas enzimas, foi proposta uma
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classificaosistemticarecomendadaporumacomissointernacionaldeespecialistasnoestudodetaismacromolculas.
OnovosistemadeclassificaodivideasenzimasemseisClassesprincipais,nasquaisestoinclusassubclassesdeacordocomotipo
de reao catalisada. De acordo com esta sistemtica, cada enzima designada por um Nome Recomendado, usualmente pequeno e
apropriado para o uso dirio, um Nome Sistemtico, o qual identifica a reao catalisada, e um Nmero de Classificao, o qual usado
quando uma identificao precisa necessria. Como exemplo do novo sistema de classificao, considere a reao abaixo catalisada por
umaenzima:

ATP+creatinaADP+fosfocreatina

O Nome Recomendado para esta enzima, que o normalmente usado, creatininaquinase e o Nome Sistemtico, baseado na reao
catalisada, ATP:creatina fosfotransferase. Seu nmero de classificao EC 2.7.3.2, onde EC representa Enzyme Commission of the
InternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology IUBMB, o primeiro dgito, 2, a Classe (transferase), o segundo dgito, 7, a
Subclasse(fosfotransferase),oterceirodgito,3,aSubsubclasseemqueafosfotransferaseapresentaumgruponitrogenadocomoaceptor,e
oquartodgito,2,designaumacreatinaquinase.Oquadroabaixorelacionaoscdigosutilizadosparaaaplicaodonmerodeidentificao
dasenzimas.

ClassificaodasEnzimasSegundoaComissodeEnzimas
1.Oxidoredutases(reaesdeoxidaoreduooutransfernciadeeltrons
DesidrogenaseseOxidases)
1.1.atuandoemCHOH
1.2.atuandoemC=O
1.3.atuandoemC=O
1.4.atuandoemCHNH2
1.5.atuandoemCHNH
1.6.atuandoemNADH,NADPH
2.Transferases(transferemgruposfuncionaiscomoamina,fosfato,acil,carboxilQuinasese
Transaminases)
2.1.gruposcomumcarbono
2.2.gruposaldedooucetona
2.3.gruposacil
2.4.gruposglicosil
2.7.gruposfosfatos
2.8.gruposcontendoenxfre
3.Hidrolases(reaesdehidrlisedeligaocovalentePeptidases)
3.1.steres
3.2.ligaesglicosdicas
3.4.ligaespeptdicas
3.5.outrasligaesCN
3.6.anidridoscidos
4.Liases(catalisamaquebradeligaescovalentesearemoodemolculasdegua,amnia
egscarbnicoDehidrataseseDescarboxilases)
4.1.=C=C=
4.2.=C=O
4.3.=C=N
5.Isomerases(reaesdeinterconversoentreismerosticosougeomtricosEpimerases)
5.1.racemases
6.Ligases(catalisamreaesdeformaodenovasmolculasapartirdaligaoentreduaspr
existentes,semprescustasdeenergiaSintetases)
6.1.CO
6.2.CS
6.3.CN
6.4.CC

IVCINTICADACATLISEENZIMTICA

A cintica enzimtica a parte da Enzimologia que estuda a velocidade das reaes enzimticas bem como os fatores que a
influenciam.
Os princpios gerais da cintica das reaes qumicas aplicamse s reaes catalisadas enzimaticamente, embora estas tambm
mostremumpadrodistintoquenousualmenteencontradonasreaesnoenzimticas:saturaocomosubstrato.
No grfico ao lado podemos observar o efeito da concentrao do substrato na taxa de uma reao catalisada por uma enzima, A
concentraesdesubstratomuitobaixas,avelocidadeinicialdereaov0quaseproporcionalconcentraodaconcentraodosubstratoearea
primeiraordememrelaoaosubstrato.Entretanto,aproporoqueaconcentraodosubstratoaumenta,ataxainicialpassaacrescermenos,
quenomaisproporcionalconcentra

o do substrato. Nessa zona, as ordens das reaes esto misturadas. Com o posterior aumento na concentrao do substrato, a taxa de
reao tornase essencialmente independente da concentrao do substrato e aproximase assintoticamente a uma taxa constante. Nesses
valores de concentraes de substrato a reao de ordem zero em relao ao substrato e a enzima tida como estando saturada com o
substrato.
Todasasenzimasapresentamoefeitodasaturao,pormvariandoconsideravelmentenoquedizrespeitoconcentraorequerida
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para produzilo. Esse efeito de saturao levou alguns pesquisadores a estabelecerem a hiptese de que enzima e substrato reagem
reversivelmenteparaformarumcomplexo,passoessencialnacatlisedeumareao.
Em1913ateoriadaaoecinticaenzimticafoidesenvolvidapordoiscientistaschamadosL.MichaeliseM.L.Menten,naqual
umareaoenzimticapodeserexpressapelaseguinteequao,considerandoseapenasumsubstrato:

Enzima+Substrato [EnzimaSsubstrato] Enzima+Produto

Asmolculasdosubstratopassamporumasriedeformasgeomtricaeeletricamentealteradasantesdeformaremprodutosdareao
e a energia livre destes intermedirios, especialmente aquelas que se encontram em estados de transio mais instveis, so os mais
determinantesdataxadereao.Asenzimastmmuitomaiorafinidadeporestesestadosdetransiodosubstratodoquetmporformas
maisestveis.Comoestainteraoabaixaaenergiadestesestadosdetransiocrticos,asenzimaspodemacelerarumadeterminadareao.
A partir do modelo de reao proposto por estes pesquisadores, desenvolveuse uma equao que nos permite demonstrar como a
velocidadedeumareaovariaemfunodaconcentraodosubstrato,aqualestaseguirdescrita:

V0=

Esta equao relaciona a velocidade (V0), a velocidade mxima (Vmax) e a concentrao inicial de substrato com a constante de
MichaelisMenten(Km).OKmdeumsubstratoaconcentraodosubstratonaqualavelocidadeinicialdereaoequivalemetadeda
velocidademxima.Parareaesqueenvolvemumsubstratoexpressaemmolesporlitroeindependentedaconcentraodaenzima.O
quadroabaixorelacionaalgumasenzimaseseusrespectivosKm.

Enzima
Substrato
Km(mM)
Catalase
Hoxoquinase
Quimiotripsina

H2O2
Glicose
Frutose
Nbenzoltirosinamida
Nformiltirosinamida
Nacetiltirosianamida
Gliciltirosinamida

25
0,15
1,5
2,5
12,0
32
122
9,0

Anidrasecarbnica

HCO3

Glutamatodesidrogenase

Glutamato
cetoglutarato
NH4+
NADox
NADred

0,12
2,0
57
0,025
0,018

Aspartatoamininotransferase

Aspartato
cetoglutarato
Oxalacetato
Glutamato

0,9
0,1
0,04
4,0

PodeseobservarpeloquadroapresentadoqueosvaloresdeKmnosofixosepodemvariarcomaestruturadosubstrato,comopHe
comatemperatura.Paraenzimasqueatuamemmaisdeumsubstrato,cadasubstratotemumKmcaracterstico.
A constante de MichaelisMenten de uma enzima , portanto, uma caracterstica muito importante e fundamental, no apenas
matematicamentenadeterminaodavelocidadedareaocatalisadacomotambmnaavaliaodaatividadeenapurificaodasenzimas
nostecidos.

VMECANISMODAAOENZIMTICA

Va.Enzimacomocatalisador

Oprincpiodecatalisadordiminuiraenergiadeativao.Aenzimaseligaaumamolculadesubstratoemumaregioespecfica
denominadastiodeligao.Estaregioumencaixequeapresentaumladoenvolvidoporcadeiasdeaminocidosqueajudamaligaro
substrato,eooutroladodestacadeiaagenacatlise.
Em1894EmilFischerpropsomodelochavefechaduraparaexplicaraaoenzimtica.Aenzimaseencaixacomosubstrato
especficonostioativo,comoumachaveefechadura.

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Tantoaenzimaquantoosubstratosofremconformaoparaoencaixe.Aenzimanoaceitasimplesmenteosubstrato,osubstrato
distorcidoparaconformaoexatadoestadodetransio,denominadoencaixeporinduo,propostoporKoshland(1958).

Aenzimatambmencontraoladoespecficodacadeiaposicionandonolugarexatodaligaonoprocessocataltico,muitasvezeso
ladodacadeiapodeserbsicooucidopromovendoaadioouremoodeprtons.Emoutrascircunstnciasaenzimaseagrupaaumon
metliconaposiocorretaparaaocorrnciadacatlise.
Aocompletarareaocatalticaaenzimaliberaoprodutoeretornaaformaoriginal.Oprocessoocorreemduasetapas:

(1)S+E
ES*(etapareversvel)
(2)ES
E+P(etapairreversvel)

*complexoenzimasubstrato

Vb.InibioEnzimtica

Muitostiposdemolculasinibemasenzimasepodemagirdevriasformas.Aprincipaldistinoentreinibioreversveleinibio
irreversvel.
Aformaqueenvolveligaesnocovalentesreversvel,atravsdaremoodoinibidor.Emalgunscasosasligaesnocovalentes
podemserirreversveissobdiferentescondiesfisiolgicas.
Jainibioirreversvel,aligaomolecularcovalente.Sogeralmenteencontradosemreaesqueapresentamtoxinasespecficas.

Vb.1.InibioReversvel

Existemvriosmodosqueestoenvolvidoscomligaonocovalente,elesdiferenciamquantoaomecanismopeloqualdiminuema
atividadeenzimticaecomoelesafetamnacinticadareao.

Vb.1.1.InibioReversvelCompetitiva

Uma molcula apresenta estrutura semelhante ao substrato da enzima que se liga para realizar a catlise, ela poder aceitar esta
molcula no seu local de ligao, mas no pode levar ao processo cataltico, pois ocupando o stio ativo do substrato correto. Portanto o
inibidorcompetepelomesmolocaldosubstrato.
OefeitodareaomodificaoKm,masnoalteraavelocidade.

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Vb.1.2.InibidorReversvelnoCompetitivo

Ocorre quando um molcula ou on pode se ligar em um segundo local na superfcie enzimtica (no no stio ativo). Isto pode
distorceraenzimatornandooprocessocatalticoineficiente.

Oinibidornocompetitivopodeserumamolculaquenoseassemelhacomosubstrato,masapresentaumagrandeafinidadecoma
enzima.omecanismoinversodoinibidorcompetitivo,porqueinibealigaodocomplexoESenodaenzimalivre.
OefeitodareaomodificaavelocidadeeoKmpermanececonstante.

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Vc.InibioIrreversvel

Algumassubstnciasseligamcovalentementesenzimasdeixandoasinativas.Namaioriadoscasosasubstnciareagecomogrupo
funcionalnostioativobloqueandoolocaldosubstrato,deixandoaenzimacataliticamenteinativa.
Inibidoresirreversveispodemserextremamenteseletivospoissosemelhantesaosubstrato.Somuitoutilizadoscomoresduos,os
quaisapresentamgruposdetomosqueseconfiguramsemelhantementeaoestadodetransioqueseligamaosubstrato.

Vd.Cofatores

Para alguns tipos de processos biolgicos, apenas a cadeia protica no suficiente, por isso a protena requer uma molcula
denominadacofatoraqualpodeserumapequenamolculaorgnica,denominadacoenzimaouumonmetlico.
Os cofatores so geralmente estveis em temperatura alta. A catlise ativa enzimacofator denominada holoenzima, quando o
cofatorremovido,semantmaprotena,aqualcatabolicamenteinativaedenominadaapoenzima.

Coenzimas

Amolculaorgnicaqueseligasenzimasparaativarumareao,denominadacoenzima,cadatipoapresentaumafunoqumica
particular,algumassoagentesoxiredutoras,outrastransferidorasetc.
Comoexemploexplanatrio,consideramosacoenzimadinucleotdeonicotinamidadeadenina(NAD+).Estamolculacontmduas
principaispartes:aporodifostatoadenosina,ligandoumariboseaumanicotinamida.AoutraporoapartefinaldamolculadoNAD
ondeoaneldenicotinamidaserimediatamentereduzidoeaindaservircomoagenteoxidante.UmareaotpicaqueoNADparticipana
conversodolcoolemaldedosecetonas,oqualagecomoagenteoxidante.
Algumas vezes difcil distinguir uma verdadeira coenzima de um segundo substrato. Durante uma catlise, uma coenzima tem a
capacidadede,atravsdeoxiredues,serreutilizadaporoutraenzima,voltandonovamenteaciclometablico.PorexemplooNADapsa
oxidao do substrato, passa a NADH, ativa a reao, deixa a enzima e novamente ser oxidada por um sistema de aceptor de eltrons,
voltandoaserNADeassimpodendoseligaraoutraenzima.Jumsegundosubstratonuncadeixaaenzima,elereduzidoeoxidadono
ciclometablico.
Muitas coenzimas so fortemente relacionadas com vitaminas. As vitaminas so molculas orgnicas essenciais para o processo
biolgicoemorganismossuperioresenopodemsersintetizadosporelesmesmos.Portantoestascoenzimassoessenciaisaosprocessos
metablicosvitaisdosorganismossuperiores.
Outra estrutura que apresenta a mesma funo de coenzima, so as metaloenzimas. So enzimas que tm ons metlicos ligados
covalentementenascadeiasdeaminocidosouemgruposprostticoscomoogrupoheme.Osmetaisqueseligamasenzimasagemcomo
metaiscatalticosemreaeshidrolticaseoutroscomagentesredutores.

VITCNICASEMPREGADASNOESTUDODASENZIMAS

VI1)AnlisedeVelocidadedereaocataltica

Existemduasformasessenciaisparaoestudodacinticadeumaenzima.Primeiramentedeveserfeitomediessobcondiesna
qualmantenhaoestadodeequilbrio,depoisobservaraaplicabilidadedaequaodeMichaelisMenten,edeterminaravelocidadedereao
pelaconcentraodosubstratoedaenzima.

2)AnlisedoEquilbriodeReao

Oequilbriodeumareaoenzimticaestabelecidoemsegundosoupoucosminutos.Vejamosalgumastcnicasdeavaliao:

Espectrofotometria

ummtodosimpleseapurado.medidopelaabsorodeluznaregioespectraldosubstratoouprodutoformadonareao.

Fluorescncia

similar a metodologia de espectrofotometria. O substrato ou o produto deve emitir fluorescncia neste espectro. A tcnica
vantajosaporseraltamentesensvel,asoluoaserempregadadeveestarextremamentediluda.

Titulaoautomtica

utilizadaquandoareaoproduzouconsomecidooubase.TitulasenasoluocidooubaseparaqueopHcontinueconstante.
Aquantidadedecidooubaseconsumidoovalordareaocatalticaenzimtica.

AnliseRadioativa

avaliadoquandoosubstratomarcadocomistoporadioativo,oqualserperdidooutransferidoduranteareaoaserestudada.
ummtodoextremamentesensvelparaanlisecinticaenzimtica.

3)Anlisesdereaescomaltavelocidade

a)"StoppedFlow"
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Aenzimaeosubstratosoinicialmenteseparadosemseringas,querapidamenteliberaseucontedoatumacmaramisturadorae
emseguidapassaparaaseringaquepraareao.Nesteinstanteumdetectormedeaabsorbnciadeluzoufluorimetria.

b)"TemperatureJump"

Oprocessoocorrequandoamisturadereao,queestemequilbrionumaTemperatura1,rapidamentepassadaumatemperatura2
.Opontodeequilbriomudareareaodeveocorrerparaqueareaoalcanceumnovoequilbrio.Amudanarpidadetemperatura
obtida por uma exploso de corrente eltrica nos eletrodos imergidos na mistura de reao. O tempo de relaxamento entre a mudana de
temperaturamedidoporabsorbnciaoufluorescncia.

4)Anlisequantitativadaatividadeenzimtica

Paraobtenodeumaanlisequantitativanecessriosaber:

Todaestequiometriadeumareaocataltica
Seaenzimarequeradiodecofatorescomoumonoucoenzima
Adependnciadaenzimasobaconcentraodocofatorousubstrato.
OpHtimo
Atemperaturapelaqualaenzimaestestveleapresentaaltaatividade.
Oprocedimentoparadeterminaodoaparecimentoedesaparecimentodosubstratodeumprodutodereao.

A anlise quantitativa confirmada quando o substrato ou o produto colorido ou absorvido em luz ultravioleta. O valor de
aparecimentooudesaparecimentodoprodutoousubstratoabsorvidoporluzpodeseranalisadopeloespectrofotmetro.Almdoprodutoou
substratopodeseanalisarointermedirio(aquelequeservecomoponteparaodesencadeamentodeoutrareao).

a)Purificaoenzimtica

As enzimas so encontradas na natureza em misturas complexas, geralmente as clulas apresentam centenas ou mais diferentes
enzimas,paraumestudoaprofundadodevesepurificaraenzimaaserestudada.
Em alguns casos possvel atravs da aplicao de mtodos especficos utilizar enzimas nos estado impuro, mas na maioria dos
casos,apresenadeoutrasenzimasinterferenossubstratosdesviandoasreaesespecficas.

b)Mtodosdepurificao

1)Testeprimeiramentefazseumaanlisequantitativadaatividadedaenzimaaserestudada.Aenzimadeveserisoladautilizando
seotestedeatividadeemdiferentesfraes,sendomaisimportantequeaexatidodomtodo.
2)ProcedimentoGeraldefiniodaunidadeenzimtica,concentraoeatividadeespecfica.
3) Origem enzimtica determinao do local (tecido) de maior quantidade, geralmente a rpida centrifugao adquire enzimas
mitocondrial.
4) Extrao necessrio ter a enzima em soluo e, portanto, a ruptura de membranas. Deve se utilizar um tampo, pois ao
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romperotecidopodeocorrerliberaodesubstnciascidasquedegradamaenzima.Osmtodosutilizadossoomecnicocom
partculasdeareia,nitrogniolquido,"shaker"emaltavelocidade,ondasdeultrassomesolventescomoacetona.

c)Unidadedeatividadeenzimtica

definidapelaquantidadequecausatransformaode1moldesubstratoporminutoa25Csobcondiestimas.Aatividade
especficaonmerodeunidadedeenzimaspormiligramadeprotena,medeapurezadaenzima.
A atividade molar ou molecular ou nmero de "turnover", o nmero de molculas do substrato transformado por uma nica
molculadeenzimaounicostiodeligaoemumminuto,quandoaenzimaestnovalordelimite.Aatividademolarpodesercalculada
pelavelocidademxima.
Anovaunidadeinternacionaldaatividadeenzimticadeterminadapela"ComissodaEnzima"o"katal",oqualdefinidocomoa
transformaodosubstratoem1molporsegundo.

MtodosdeFracionamento

O extrato de enzimas apresenta inmeras substncias com diferentes pesos moleculares e de acordo com seu interesse de estudo
utilizamsediferentesmtodos:

1)PrecipitaopordiferenadepH
2)Desnaturaoporaquecimento
3)Precipitaocomsolventesorgnicos(etanol,acetona)
4)Precipitaoporsais(sulfatodeamnia)
5)Adsoro
6) Cromatografia o mecanismo de separao depende da adsoro, troca inica, afinidade especfica para imobilizar ligantes
especficosouefeitosdepeneiramentomolecular.
7)Eletroforeseamobilidadedasprotenascausadaporcampoeltrico
8)Cristalizao
9)Concentraoreduodevolumeatravsdeevaporaodosolventeoucongelamento.

VIIREFERNCIASBIBLIOGRFICAS

DIXON,M.WEBB,E.C.Enzymes.NewYork:AcademicPress,1979.
1116p.

LEHNINGER,A.L.NELSON,D.L.COX,M.M.Princpiosde
Bioqumica.SoPaulo:Sarvier,1995.839p.

MATHEWS,C.K.VanHOLDE,K.E.Biochemistry.TheBenjamim
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WHITAKER,J.R.PrinciplesofEnzimologyfortheFoodSciences.New
York:MarcelDekkerInc.,1972.636p.

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