Universidad de Puerto Rico

Recinto Universitario de Mayagez

Departamento de Biologa
Laboratorio de Microbiologa General

Modulo I. Extraccin de ADN genmico

Objetivos
1. Extraer ADN genmico de una bacteria gram negativa desconocida utilizando
tcnicas moleculares.
2. Familiarizar al estudiante en el uso del Kit de Purificacin de ADN (Promega)
para obtener ADN genmico.
3. Determinar la calidad y el rendimiento de la extraccin a travs de una
electroforesis de gel de agarosa.
Teora
La biologa molecular surge alrededor de los 1930s. Se centra en entender la
interaccin y regulacin entre ADN, ARN y protenas. Mediante esta podemos
acercarnos al entendimiento de procesos biolgicos que ocurren a larga escala,
estudindolos a nivel molecular. La misma une conceptos del rea de biologa con
gentica, qumica y bioqumica, entre otros.
La microbiologa molecular nos permite entender los principios moleculares
de los procesos fisiolgicos de la clula prokariota y eukariota. Adems, nos ayuda
en la caracterizacin de bacterias desconocidas aisladas y de comunidades
microbianas.
Este laboratorio se centra principalmente en la extraccin de ADN genmico
de una clula prokariota. El ADN genmico se refiere a todo el ADN presente en la
clula de un organismo. Para llevar a cabo la extraccin del ADN genmico
utilizaremos tcnicas moleculares, las cuales se pueden utilizar para caracterizar,
aislar y manipular componentes celulares. Algunos ejemplos de estas tcnicas
moleculares son: Reaccin en cadena de polimerasa (PCR), Clonacin, Geles de
electroforesis y Southern Blot.
Extraccin de ADN genmico
En laboratorios anteriores se ha discutido que uno de los mtodos que nos
ayudan en la identificacin y diferenciacin de bacterias es la tincin gram. La
misma nos permite determinar si una bacteria desconocida es gram positiva o
negativa. Una bacteria gram positiva posee una pared gruesa de peptidoglicano,
mientras que la gram negativa posee una pared fina de peptidoglicano seguida hacia

el exterior por una membrana externa. Esta pared y membrana protegen el interior
de la clula, que es donde se encuentra el ADN genmico. Para poder extraer el
mismo, debemos utilizar agentes qumicos y/o fsicos que debiliten la pared y
membrana de la clula. Por ende, es importante conocer el tipo de gram a la hora de
realizar una extraccin de ADN genmico, ya que debemos determinar qu agentes
utilizar para el rompimiento efectivo de la clula.
Materiales y Mtodos
(Se usar el DNA Purification kit de la compaa Promega)
A. Lisis Celular (Rompimiento de la clula)
1. Resuspender las clulas en microtubo con 600L de la solucin de lisis
(Nuclei Lysis Solution, NLS). Esta contiene amortiguadores y detergentes que
ayudan a lisar la clula, sin hacerle dao al ADN.
2. Incubar a 80oC por 10 min. La temperatura alta tambin ayuda a
desestabilizar la membrana. Dejar enfriar a temperatura ambiente.
3. Aadir 3ul de la solucin de RNAsa, mezclar invirtiendo el tubo. La RNAsa
es una nucleasa que cataliza la degradacin del RNA en componentes ms
pequeos. Esto permite que nuestro producto quede limpio de ARN.
4. Incubar a 37oC (temperatura de activacin de la RNAsa) por 15 minutos y
dejar enfriar a temperatura ambiente.
B. Precipitacin de Protenas
5. Aadir 200ul de la solucin de precipitacin de protena (PPS). Mezclar
por vortex por 20 segundos.
6. Incubar en hielo por 5 minutos.
7. Centrifugar a 13,000rpm por 3 minutos.
C. Purificacin (Se utilizar isopropanol y etanol, los cuales ayudan a purificar y/o
concentrar ADN, ARN y polisacridos de soluciones aquosas)
8. Transferir sobrenandante a un tubo nuevo que ya contiene 600ul de
isopropanol (A-Iso) y mezclar por inversin.
9. Centrifugar a 13,000rpm por 3 minutos, decantar sobrenandante. El
sobrenadante es la parte lquida soluble de una muestra luego de
centrifugacin o precipitacin de slidos insolubles.
10. Aadir 600ul de etanol (ET) al 70% y mezclar por inversin.
11. Centrifugar a 13,000rpm por 3 minutos.
12. Decantar el etanol. Dejar secar los tubos por 10 minutos boca abajo sobre
papel toalla.

D. Rehidratacin (Poner el ADN en solucin)

13. Rehidratar el pellet de DNA en 100ul de la solucin de rehidratacin (RS).
Esta solucin posee buffers que protegen el ADN.
14. Incubar a 65oC por 30 minutos.

Gel de electroforesis
Se utiliza para observar los resultados de la extraccin. Se prepara un gel de
agarosa al 0.8%, para permitir la migracin del ADN genmico. Esta posee varias
fosas en donde sern colocadas las muestras y un marcador. El marcador sirve como
regla para medir cunto pesa nuestra muestra.

Preparacin de las muestras (se har sobre parafina)

En la primera fosa se debe colocar el marcador 1Kb. Este se prepara de la siguiente
forma:
6 l Tris EDTA (TE) 1X
2 l Bromophenol Blue (BB)
2 l 1Kb (Kilobase)
Luego, en las siguientes fosas se colocarn las muestras de ADN. Estas se preparan
de la siguiente forma:
3 l Tris EDTA (TE) 1X
2 l Bromophenol Blue (BB)*
5 l ADN
La gel de electroforesis para el ADN genmico se correr por 30 minutos a 150V.
*En este caso utilizamos bromophenol blue (BB) ya que posee menor peso
molecular que el ADN genmico.