LAPORAN RESMI

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PRAKTIKUM VI
UJI AKTIVITAS MIKROBA: METODE DILUSI CAIR

Penyusun :
1.
2.
3.
4.

Annisa Nilamsari Utami

Muhammad Faishal Mahdi
Agung Wiranto Setyabudi
Cinantya Talia Paramita

14/362870/FA/10026 ()
14/362873/FA/10029 ()
14/362876/FA/10032 ()
14/362879/FA/10035 ()

Kelas

:A

Golongan / Kelompok

: II / 2

Hari, Tanggal Praktikum

: Rabu, 29 April 2015 (Tahap I)

Rabu, 6 Mei 2015 (Tahap II)

Dosen Jaga

: Dr. rer.nat. Yosi Bayu Murti, M.Si., Apt.

Asisten Jaga

: Lodyta dan Dwi

Asisten Koreksi

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

BAGIAN BIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
2015
PRAKTIKUM VI

UJI AKTIVITAS MIKROBA: METODE DILUSI CAIR

I. Tujuan
Menentukan kadar hambat minimum dan kadar bunuh minimum dari suatu sampel
terhadap mikroba uji.
II. Dasar Teori
Antibiotik adalah suatu substansi kimia yang dihasilkan oleh mikroorganisme, yang
dalam

konsentrasi

kecil

mempunyai

kemampuan

menghambat

atau

membunuh

mikroorganise lain. Antibiotik bersifat selektif toksis pada bakteri, namun tidak toksik pada
sel inang. Sedangkan, antimikroba adalah bahan-bahan yang dihasilkan dari mikroorganisme,
tanaman, dan lain lain yang digunakan untuk memberantas atau membasmi mikroba,
khususnya yang merugikan manusia, terbatas yang bukan parasit di antaranya antibiotika,
antiseptik, kemoterapeutika, preservative (Dwidjoseputro, 2003).
Antibiotika dan antimikroba dapat melakukan aktivitasnya lewat beberapa
mekanisme terutama dengan penghambatan sintesa penting dari bakteri :
1. Dinding sel, antibiotik dan antimikroba dapat menghambat biosintesis peptidoglikan
sehingga dinding sel menjadi lemah, dan dinding sel akan lisis, sehingga bakteri mati.
Contohnya adalah penisilin, vankomisin, dan lain lain.
2. Membran sel, antibiotik dan antimikroba akan mempengaruhi permeabilitas dan
menyebabkan keluarnya senyawa intraseluler mikroorganisme, sehingga sel rusak dan
mati. Contohnya adalah polimiksin dan nistatin.
3. Protein sel, berkaitan dengan sub unit ribosom 30S dan mengubah sintesis protein, dan
akhirnya sel mati. Contohnya adalah minoglikosida.
4. Asam nukleat, antibiotik dan antimikroba akan menghambat RNA polimerase dan
topoimerase. Contohnya adalah golongan kuinolon.
5. Metabolisme sel, antibiotik dan antimikroba secara struktur seperti sulfonamide mirip
dengan PABA yang merupakan metabolit utama bakteri. Antimikroba ini akan bersaing
dengan PABA, dan jika menang bersaing dengan PABA, maka akan terbentuk asam folat
non fungsional yang akan mengganggu mikroorganisme. Contohnya adalah sulfonamide,

1.
2.
3.
4.

dan lain lain.

Agen antimikroba yang ideal adalah yang bersifat sebagai berikut :
Menghambat pertumbuhan atau membunuh pathogen tanpa merusak host.
Bersifat bakterisida (membunuh mikroba).
Tidak menyebabkan resistensi terhadap kuman.
Berspektrum luas, sehingga efektif baik terhadap bakteri Gram positif maupun Gram

5.
6.
7.
8.

negatif.
Tidak menimbulkan alergi dan efek samping jika digunakan dalam jangka waktu lama.
Aktif dalam plasma, eksudat, atau cairan bahan.
Larut dalam air secara stabil.
Bacterial dalam tubuh cepat dicapai dan dapat bertahan dalam jangka waktu yang lama
(Hugo & Russell, 1998).

Antimikroba tertentu aktivitasnya dapat meningkat dari bakteriostatik (menghambat

pertumbuhan mikroba) menjadi bakteriosida bila kadat antimikroba ditingkatkan melebihi
nilai KHM dan KBM. KHM (Kadar Hambat Minimum) adalah kadar minimum yang
diperlukan untuk menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Sedangkan KBM (Kadar
Bunuh Minimum) adalah kadar minimum yang diperlukan untuk membunuh organisme atau
mikroba. Penentuan kadar antibiotik dari suatu sampel sangat diperlukan untuk memeriksa
kadar antibiotik dalam suatu sampel sediaan obat, kadar antibiotik dalam susu dan daging,
penetapan kadar antibiotik yang dihasilkan dari prosen fermentasi, dan lain sebagainya.
Metode uji antimikroba bermacam-macam, salah satu di antaranya adalah metode
dilusi cair (broth dilution). Pada metode ini, diukur KHM dan KBM dari antimikroba yang
diuji. Cara yang dilakukan adalah dengan membuat seri pengenceran agen antimikroba pada
medium cair yang ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar
terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM.
Larutan yang ditetapkan sebagai KHM, dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan
mikroba uji atau agen antimikroba, dan diinkubasi selama 18-24 jam. Media cair yang tetap
III.

IV.

terlihat jernih setelah diinkubasi ditetapkan sebagai KBM (Pratiwi, 2008).

Alat dan Bahan
A. Alat
1. Laminar Air Flow (LAF)
2. Ose
3. Lampu Bunsen
4. Eppendorf
5. Tabung reaksi ukuran 5 mL beserta raknya
6. Kapas
7. Aluminium foil
8. Mikropipet, blue tip dan yellow tip
9. Cawan petri
10. Inkubator
11. Kulkas
12. Kompor listrik
B. Bahan
1. Minyak atsiri Krangean (Litsea cubeba Pers.)
2. Pelarut DMSO
3. Media cair Mueller-Hinton (MH)
4. Antibiotik Kloramfenikol
5. Suspensi bakteri Staphylococcus aureus
6. Media cair Nutrien Agar (NA)
7. Alkohol 75%
Cara Kerja
A. Tahap I
Dibuat stok minyak atsiri Krangean 50% dengan mencampur 0,5 mL minyak atsiri dan
0,5 mL DMSO
Dibuat lima seri pengenceran kelipatan (two-fold dilution)

Diisi tabung reaksi 5 mL pertama dengan media cair MH sebanyak 4 mL dan empat
tabung reaksi 5 mL lainnya dengan media cair MH sebanyak 2 mL
Dibuang 0,08 mL media dari tabung I, dimasukkan 0,08 mL stok minyak atsiri ke
dalamnya sehingga didapatkan kadar minyak atsiri 1% dalam tabung I
Diambil 2 mL campuran dari tabung I, ditambahkan ke dalam tabung II, sehingga
didapatkan kadar minyak atsiri 0,5% dalam tabung II; demikian seterusnya hingga
didapatkan kadar minyak atsiri dalam tabung III, IV, dan V masing-masing sebesar
0,25%, 0,125% dan 0,0625%
Dibuang 2 mL campuran dari tabung V sehingga seluruh tabung berisi sampel uji
sebanyak 2 mL
Dibuang 0,02 mL campuran dari kelima tabung tersebut, ditambahkan 0,02 mL suspensi
bakteri S. aureus ke dalam seluruh tabung
Dibuat kontrol positif berisi: 1,940 mL MH; 0,04 mL suspensi Kloramfenikol 2 mg;
serta 0,02 mL suspensi bakteri S. aureus
Dibuat kontrol media berisi: 2 mL MH
Dibuat kontrol pelarut berisi 1,940 mL MH; 0,04 mL DMSO; serta 0,02 mL suspensi
bakteri S. aureus
Dibuat kontrol negatif berisi 1,980 mL MH serta 0,02 mL suspensi bakteri S. aureus
Ditutup kelima tabung dengan kapas dan aluminium foil
Diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam
Diambil sampel uji yang masih menunjukkan kejernihan beserta keempat kontrol,
dimasukkan ke dalam kulkas
B. Tahap II
Dikeluarkan sampel uji dari dalam kulkas
Dicairkan media NA yang masih padat, ditunggu hingga suhunya 40C
Dituangkan media cair NA ke dalam cawan petri, dibiarkan memadat
Digoreskan sampel uji pada media dengan bantuan ose
Diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam
Diamati keberadaan koloni bakteri S. aureus yang tumbuh pada media

V. Hasil Pengamatan
A. Tahap I

Gambar 1. Sampel uji beserta kontrol setelah diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam. Dari kiri ke
kanan: Sampel uji konsentrasi 0,0625%, 0,125%, 0,25%, 0,5%, 1%; kontrol media, kontrol positif;
kontrol pelarut; kontrol negatif.

Setelah sampel uji beserta kontrol diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam,
didapatkan hasil sebagai berikut:
Kejerniha
n
Sampel / Kontrol
Jernih
Sampel uji konsentrasi 0,25%, 0,5%, 1%; kontrol media; kontrol positif
Keruh
Sampel uji konsentrasi 0,0625%, 0,125%; kontrol pelarut; kontrol negatif
Berdasarkan data tersebut, KHM dari minyak atsiri Krangean yang diuji adalah
0,25%. Seluruh sampel yang jernih kemudian disimpan di dalam kulkas untuk
dilakukan penentuan KBM pada tahap berikutnya.
B. Tahap II

Gambar 2. Sampel uji yang telah digoreskan ke atas media padat NA setelah diinkubasi pada suhu 37C
selama 24 jam. KR = minyak atsiri Krangean; TL = minyak atsiri Temulawak (percobaan kelompok lain
yang diuji dalam cawan petri yang sama dengan kelompok praktikan)

Setelah sampel uji yang digoreskan pada media padat NA diinkubasi pada suhu
37C selama 24 jam, tidak terdapat koloni bakteri yang tumbuh. Dengan demikian, nilai
KBM minyak atsiri Krangean yang diuji sama dengan nilai KHMnya, yakni 0,25%.
VI. Pembahasan
Praktikum ini bertujuan untuk menentukan Kadar Hambat Minimum (KHM) dan kadar
Bunuh Minimum (KBM) dari suatu sampel terhadap suatu mikroba uji dengan metode dilusi
cair. Prinsip dilusi cair adalah pengujian terhadap suatu senyawa yang diduga memiliki
aktivitas antimikroba dengan membuat seri pengenceran senyawa tersebut dalam suatu
media cair yang nantinya akan ditambahkan sejumlah tertentu mikroba, kemudian
diinkubasi pada suhu 3610C selama 18-24 jam lalu diamati kejernihannya (Istiantoro,
1995)
Langkah pertama dalam percobaan ini adalah pembuatan larutan stok minyak atsiri yang
akan diuji, yaitu minyak Krangean dengan konsentrasi 50%. Larutan stok ini dibuat dengan
mencampurkan minyak atsiri dan pelarut DMSO dalam jumlah yang sama.
Kemudian dibuat lima seri pengenceran kelipatan (two-fold dilution). Disiapkan lima
buah tabung reaksi ukuran 5 mL, salah satunya diisi media cair MH sebanyak 4 mL
sedangkan sisanya sebanyak 2 mL.
Pada tabung yang berisi 4 mL media, dikeluarkan 0,08 mL media dan dimasukkan 0,08
mL stok minyak atsiri sehingga campuran dalam tabung tersebut mengandung minyak atsiri
Krangean dengan kadar 1%. Selanjutnya diambil 2 mL campuran dari tabung tersebut dan
dipindahkan ke dalam tabung kedua, sehingga tabung II mengandung minyak atsiri
Krangean dengan kadar 0,5%. Begitu seterusnya sehingga tabung III, IV dan V masingmasing mengandung minyak atsiri dengan kadar 0,25%, 0,125% dan 0,0625%. Pada akhir
pengenceran, dalam tabung V akan terdapat 4 mL campuran, untuk menyeragamkan dengan
tabung-tabung lain maka dibuang 2 mL campuran dari tabung V sehingga volume campuran
dari setiap tabung adalah tepat 2 mL. Pemindahan dan pemasukkan media serta sampel yang
akan diuji dilakukan dengan mikropipet dan blue tip yang steril.
Selanjutnya dibuang 0,02 mL campuran dari masing-masing tabung dan diisikan 0,02 mL
suspensi bakteri Staphylococcus aureus ke dalam setiap tabung. Pengambilan dan
pemasukan suspensi bakteri dilakukan dengan mikropipet dan yellow tip yang steril; Mulut
tabung wadah suspensi bakteri dipanaskan terlebih dahulu sebelum dan sesudah suspensi
bakteri diambil. Seluruh tabung kemudian ditutup dengan kapas dan aluminium foil untuk
mencegah kontaminasi.
Berikutnya disiapkan empat buah kontrol sebagai berikut: Kontrol positif, berisi 1,940
mL media, 0,04 mL suspensi Kloramfenikol 2 mg dan 0,02 mL suspensi S. aureus; Kontrol
media, berisi 2 mL media; Kontrol pelarut, berisi 1,940 mL MH, 0,04 mL DMSO dan 0,02
mL suspensi S. aureus; Kontrol negatif, berisi 1,980 mL MH dan 0,02 mL suspensi S.

aureus. Kontrol-kontrol tersebut dibuat sebagai perbandingan terhadap sampel yang akan
diuji. Kontrol positif berfungsi sebagai pembanding apakah senyawa uji dapat memberikan
efek yang sama dengan antibiotik, sementara kontrol pelarut digunakan untuk mengetahui
apakah pelarut mempunyai efek terhadap mikroba yang digunakan (Emrizal dkk., 2012).
Lima seri pengenceran sampel uji beserta keempat kontrol kemudian diinkubasi pada
suhu 37C selama 24 jam. Apabila mikroba tidak terpengaruh oleh sampel uji, dengan kata
lain sampel uji tidak memiliki aktivitas antimikroba, maka dalam masa inkubasi mikroba
akan bereproduksi dan mengakibatkan kekeruhan pada media yang berisi sampel uji tersebut
(Leboffe & Pierce, 2010). Setelah masa inkubasi terlewati, diamati kejernihan pada seluruh
tabung reaksi untuk menentukan nilai KHM dari sampel uji. Dari kelima seri pengenceran
sampel uji, yang masih menunjukkan kejernihan adalah sampel dengan kadar 0,25%, 0,5%
dan 1%. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa KHM dari minyak atsiri Krangean
yang diuji adalah 0,25%.
Pada kontrol positif, larutan tampak jernih yang membuktikan bahwa Kloramfenikol
memiliki aktivitas antimikroba. Kloramfenikol merupakan antibiotik yang memberikan efek
dengan bereaksi pada unit 50S ribosom dan menghalangi aktivitas enzim peptidil transferase
sehingga ikatan peptida antara asam amino baru yang masih melekat pada tRNA dengan asa
amino terakhir yang sedang berkembang tidak dapat terbentuk; Akibatnya, sintesis bakteri
akan terhenti seketika (Pratiwi, 2008).
Pada kontrol pelarut yang berisi DMSO, larutan menjadi keruh yang menunjukkan bahwa
DMSO tidak dapat menghambat pertumbuhan bakteri. DMSO, atau dimetil sulfoksida,
merupakan larutan tidak berwarna yang memiliki sifat aprotik dipolar (dapat melarutkan
senyawa polar maupun nonpolar) juga amfifilik (memiliki sifat hidrofilik dan hidrofobik).
Sifat amfifilik ini mendukung kemampuan DMSO dalam menembus membran sel sehingga
dapat melakukan penetrasi ke dalam sel (Sum & Pablo, 2003).
Sampel yang masih jernih beserta kontrol kemudian disimpan ke dalam kulkas hingga
praktikum tahap kedua yang dilaksanakan seminggu setelah praktikum tahap pertama.
Pada tahap kedua, dimana akan ditentukan KBM dari sampel uji, media yang digunakan
adalah Nutrien Agar (NA). NA merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam
prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa
produk kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri dan untuk mengisolasi organisme
dalam kultur murni. Media ini mengandung 10 g beef extract, 10 g pepton, 5 g natrium
klorida, 1 L aqua destillata dan 15 g agar/L (Jawetz dkk., 1995).
Media NA yang masih padat dicairkan dulu dengan bantuan kompor listrik, lalu ditunggu
hingga suhu 40C, setelah itu dituangkan ke dalam cawan petri dan dibiarkan hingga
media memadat. Cawan petri sebelumnya telah ditandai dengan spidol di bagian bawahnya
untuk memisahkan area yang akan digoreskan sampel uji dengan kadar yang berbeda.

Sampel uji digoreskan pada media padat NA menggunakan ose yang dipanaskan sebelum
dan sesudah digunakan untuk mencegah kontaminasi. Tahap ini direplikasi sebanyak satu
kali. Setelah itu, cawan petri yang berisi media dan sampel uji diinkubasi pada suhu 37C
selama 24 jam.
Setelah masa inkubasi berlalu, diamati keberadaan koloni bakteri pada media padat NA.
Dari hasil pengamatan kelompok praktikan, media NA jernih pada seluruh bagian, tidak
terdapat koloni bakteri sama sekali sehingga dapat disimpulkan bahwa nilai KBM minyak
atsiri Krangean yang diuji sama dengan nilai KHMnya yaitu 0,25%.
Hasil yang diperoleh kelompok praktikan tidak bertentangan dengan literatur yang
menyatakan bahwa ekstrak air, etanol, etil asetat, dan heksan dari daun Krangean tidak
menunjukkan adanya aktifitas antimikrobia baik terhadap bakteri, kapang, maupun jamur
(Areekul dkk., 2009) serta minyak esensial dari buah Krangean memiliki aktivitas anti
bakteri baik gram negatif maupun positif (Daniel, 2005). Sifat antimikroba ini dikarenakan
kandungan asam laurat pada Litsea cubeba yang tinggi; Asam laurat merupakan media
pengikatan asam lemak dan dalam tubuh diubah menjadi monolaurin yang memiliki
aktivitas antimikroba (Enig, 1998)
Seluruh prosedur dalam praktikum ini, kecuali pembuatan larutan stok minyak atsiri 50%
dan inkubasi, dilakukan secara aseptis dalam LAF (Laminar Air Flow) untuk menghindari
kontaminasi baik terhadap sampel yang diuji maupun terhadap praktikan dan ruangan
laboratorium (Nair, 2005).
VII. Kesimpulan
1. Percobaan ini dilakukan dengan metode dilusi cair untuk menentukan Kadar Hambat
Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh Minimum (KBM) dari senyawa yang ingin diuji.
2. Minyak atsiri Krangean yang diuji memiliki nilai KHM dan KBM yang sama, yaitu
0,25%
3. Hasil yang diperoleh kelompok praktikan sesuai dengan literatur, bahwa minyak atsiri
tumbuhan Litsea cubeba atau dikenal dengan nama Krangean memiliki aktivitas
antimikroba.
VIII. Daftar Pustaka
Areekul, V., Jiapiyasakul, P. & Chandrapatya. A., 2009, In vitro antimicrobial screening
of selected traditional Thai plants, Thai Journal of Agricultural Science, 42(2): 8189.
Daniel, M., 2005, Herbal technology - concepts and scope, Current Science, 88(9): 13691370.
Dwidjoseputro, D., 2003, Dasar-Dasar Mikrobiologi, Djambatan, Jakarta.
Emrizal, Fernando, A., Suryani, F., Ahmad, F., Sirat, H.M. & Arbain, D., 2012, Isolasi
Senyawa dan Uji Aktivitas Anti-inflammasi Ekstrak Metanol Daun Puwar Kincung
(Nicolaia speciosa Horan), Jurnal Penelitian Farmasi Indonesia, 1(1): 1-5

Enig, M.G., 1998, Health and nutritional benefit from coconut oil, Price Pottenger Nutr
Found Health J., 20(1): 1-6.
Hugo, W. B. & Russell, A. D., 1998, Pharmaceutical Microbiology, 6th ed., Blackwell
Science, Oxford.
Istiantoro, 1995, Penisilin, Sefalosporin dan Antibiotik Betalaktam Lainnya, dalam
Farmakologi dan Terapi, edisi keempat, Bagian Farmakologi dan Terapi FKUI,
Jakarta.
Jawetz, E., Melnick, J.L., Adelberg, E.A., Brooks, G.F., Butel, J.S. & Ornston, L.N.,
1995, Mikrobiologi Kedokteran, edisi keduapuluh, diterjemahkan oleh Nugroho &
R.F. Maulany, EGC, Jakarta.
Leboffe, M.J. & Pierce, B.E., 2010, Microbiology: Laboratory Theory & Application, 3rd
ed., Morton Publishing, Colorado.
Nair, J., 2005, Comprehensive Biotechnology Class XII, Firewall Media, New Delhi.
Pratiwi, S.T., 2008, Buku Ajar Mikrobiologi Farmasi, Erlangga, Jakarta.
Sum A.K. & Pablo J.J., 2003, Molecular simulation study on the influence of
Dimethylsulfoxide on the structure of phospholipid bilayers, Biophys J 85: 36363645.
Yogyakarta, 12 Mei 2015
Praktikan,
1.
2.
3.
4.

Annisa Nilamsari Utami

Muhammad Faishal Mahdi
Agung Wiranto Setyabudi
Cinantya Talia Paramita

(10026) ()
(10029) ()
(10032) ()
(10035) ()